专利名称：一种检测松材线虫的方法及其专用引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物防治、分子诊断和线虫学领域中一种检测松材线虫的方法及其专用引物和探针，特别涉及一种检测松材线虫的方法及其专用引物和探针与包括该引物和探针的检测试剂盒。
背景技术：
松材线虫病，又称松枯萎病，是极具危险性的松林病害之一，植物染病40天后即可死亡，从发病到整片松林毁灭仅需3-5年时间，因此也被称为松树的“癌症”。松材线虫病主要通过松墨天牛、木材和木质包装材料三种渠道进行传播。该病最早在北美发现，我国1982年在南京中山陵首次发现，以后在安徽、山东、浙江、广东等省的局部地区发生并流行成灾，现在受害林面积近130万亩，直接经济损失25亿元，间接损失高达250亿元，而且该病害现已直接威胁到我国5亿多亩的松林资源。
对松材线虫的防治措施主要是通过检疫进行隔绝，一经发现感染了松材线虫的树木或木质材料，就要立即对其进行焚烧销毁，因此研究出对松材线虫快速、准确的检测方法至关重要。目前的检测手段主要是根据松材线虫的形态学特征进行判断。松材线虫属于伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus)，该属现报道有60余种，其中松材线虫与拟松材线虫的形态极为相似，尤其在幼虫阶段更难以区分。在亚洲(尤其是中国和日本)，拟松材线虫是优势种群，但其致病性弱，单纯通过形态观察难以对二者进行鉴别。Tares等人(1993)和Harmey(1994)对松材线虫的微卫星DNA及核DNA进行了研究，Beckenbach等人(1992)和Harmey(1993)利用PCR和DNA指纹图谱技术进行了松材线虫的检测、鉴定等研究。但普通的分子生物学检测方法，一般都需电泳或酶切等操作，检测速度较慢(至少6个小时)。
实时荧光定量PCR(Realtime fluorence quantative PCR)技术由美国AppliedBiosystems公司于1996年推出，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种TaqMan荧光探针和SYBR荧光染料。其中，TaqMan荧光探针是指PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该项技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它具有特异性更强、无污染、自动化程度高等优点，现已应用于对一些重要检疫对象的检测中，尤其是对病毒的检测，如苹果褪绿叶斑病毒、番茄斑点萎焉病毒(TSWV)等；此外，用该方法检测细菌(如大肠杆菌)和真菌(如镰刀菌)亦有文献报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测松材线虫的专用引物和探针。
本发明所提供的检测松材线虫的专用引物由正向引物和反向引物组成，正向引物是3’末端序列为3’-TCAGT的16-30个核苷酸的寡核苷酸序列，反向引物是3’末端序列为3’-CCAAG的16-30个核苷酸的寡核苷酸序列；探针是3’末端序列为3’-GGTAGTACGCGCC的16-25个核苷酸的寡核苷酸序列。
所述探针的3’端还标记有一个淬灭荧光基团(TAMRA)，5’端标记有一个报告荧光基团(FAM)。
所述正向引物优选为具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述反向引物优选为具有序列表中序列2的核苷酸序列。所述探针具有序列表中序列3的核苷酸序列。
本发明的第二个目的是提供一种能快速、准确地检测松材线虫的方法。
本发明所提供的检测松材线虫的方法，是以线虫样品的基因组DNA为模板，用上述检测松材线虫的引物和探针进行实时荧光定量PCR，检测扩增产物荧光信号。
所述线虫样品可为同一种线虫的纯样品或多种线虫的混合样品，其虫态可为幼虫和/或成虫和/或卵等虫态。
上述方法中，如从扩增产物中可检测到荧光信号，说明所述检测样品为松材线虫或含有松材线虫，而且可根据Ct(循环域值)的大小确定样品中的起始模板的量。
所述线虫样品经提取液和蛋白酶K处理、离心，取上清，即得到所述线虫样品的基因组DNA；所述提取液为25mM Tris-HCl，125mM KCl，0.3mM Mg2+，0.25mMDTT，1.2％Tween-20，pH9-10。
所述实时荧光定量PCR的反应体系除含有所述线虫样品的基因组DNA外，还含有PCR预混液2.5-3.5mM Mg2+，0.2-0.3mM dNTP，检测松材线虫的正、反向引物各300-500nM，探针150-250nM，Taq DNA聚合酶3-3.5U/50μL；所述实时荧光定量PCR的反应程序为先95℃预变性3min，随后进行40个循环95℃变性45sec、55-61℃延伸15sec。
本发明还提供了一种检测松材线虫的试剂盒。
本发明所提供的检测松材线虫的试剂盒包括上述检测松材线虫的引物和探针。
本发明所提供的检测松材线虫的试剂盒还包括线虫样品提取液，PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶。
所述线虫样品提取液可为25mM Tris-HCl，125mM KCl，0.3mM Mg2+，0.25mMDTT，1.2％Tween-20，pH9-10。
本发明针对现有松材线虫的检测方法费时、费力的缺点，提供了一种能快速、简易和准确地检测松材线虫的方法和试剂盒。本发明的方法及其专用引物和试剂盒对松材线虫具有很强的专化性，并通过对反应体系的优化，不仅能大幅度提高松材线虫检测的效率和准确性，此外，还能对受检样品进行定量分析。应用本发明所提供的松材线虫检测试剂盒，普通操作人人员(而非松材线虫专家)就能快速准确地对该种线虫进行检测。
本发明具有以下优点A.快速简单只需少量的虫体DNA，用荧光PCR仪仅需30分钟即可得出检验结果，避免了普通分子检测技术中的电泳、酶切等处理工序；B.灵敏度高由荧光PCR仪自动收集荧光信号，避免常规PCR终点分析法中的人为因素干扰，进一步提高灵敏度，探针灵敏度可达到8pg DNA；C.特异性强采用一对松材线虫的特异引物进行目标基因片段的扩增及一条可与模板(松材线虫的基因组DNA)互补配对的荧光探针进行检测，提高了特异性，有效地避免假阳性和假阴性；D.干扰性污染低采用全封闭反应体系，在线式实时荧光监测，PCR产物不用进行凝胶电泳，可有效地防止PCR产物的污染。E.应用本发明的方法不仅能检测松材线虫成虫，还能检测其幼虫，解决了单纯依靠形态难以对幼虫进行鉴定的问题，且检测工作不一定需要专家的介入，普通人员即可完成。本发明的方法也为其它检疫性线虫的检测提供了新思路。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、检测松材线虫的专用引物和探针的设计具体过程包括以下步骤1、松材线虫的分离将来自日本、德国、意大利、美国及中国江苏、山东、浙江、安徽、广东的不同种群的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)及其相关种用贝曼漏斗法进行分离。具体步骤为1)将受害的松树切成小段，用8层纱布包起，放入带有胶管的漏斗中，向漏斗中加入无菌水，静置12-24h，收集线虫；2)加入200mL浓度为3mg/100ml的四环素盐和0.5g/100ml的硫酸链霉素对其进行消毒，再将线虫悬液置于离心管中，2000rpm离心3min，弃上清，然后加入0.9％NaCl溶液，2000rpm离心3min，弃上清，最后用无菌水再将线虫离心洗涤3次。最后，在倒置显微镜下挑取线虫，-20℃保存备用。
2、松材线虫基因组DNA的提取挑取步骤1中的单条线虫，切成2-3段，加入线虫提取液(含125mM KCl，25mMTris-Cl，0.3mM Mg2+，0.25mM DTT，1.2％Tween-20)及蛋白酶K(24μg/mL)(Merck)，提取松材线虫基因组DNA。
3、PCR扩增松材线虫核糖体ITS区的DNA片段选用ITS区的通用引物，引物1(上游引物)5’-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3’引物2(下游引物)5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’以步骤2提取的线虫基因组DNA为模板，在引物1和引物2的引导下，PCR扩增松材线虫核糖体ITS区的DNA片段(约900bp)，50μL PCR反应体系为5μL10×PCR反应缓冲液，4μL MgCl2(25mM)，4μL dNTP(2.5mM)，引物1和引物2(10μM)各4μL，0.4μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，2μL模板DNA(终浓度约0.2ng/μL)，最后用双蒸水补充到50μL；PCR反应条件为先94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min，循环35次；再72℃保温10min。
4、所收集线虫核糖体ITS区的克隆及测序具体步骤为1)将步骤3的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用DNA回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN公司)回收该长度约900bp的DNA片段；2)将回收的DNA片段与载体pMD 18-T(Takara)制备重组载体ITS/pMD 18-T；3)将重组载体ITS/pMD18-T用CaCl2法转化到大肠杆菌DH5α，将重组菌涂20mg/mlX-gal和0.8M IPTG的LB抗性平板上，37℃培养12-24h进行蓝白斑筛选；4)挑取白色单菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养12-24h后，质粒直接送公司进行测序(上海基康)。
5、检测松材线虫的专用引物和探针的设计与筛选用Clustalx1.8.1软件对上述步骤4中的测序结果进行序列分析，再根据引物和探针设计的一般原则，用primer express软件设计探针及引物，通过筛选最终确定一对引物及一条探针。其中上游引物(正向引物)结合位点在松材线虫ITS1区30-60bp之间，其序列为5’-GATGATGCGATTGGTGACT-3’(序列1)，引物长度19nt；下游引物(反向引物)结合位点在ITS1区70-100bp之间，其序列为5’-AACGACGCGAATCGAACC-3’(序列2)，引物长度18nt；确定的探针序列为5’FAM-CGGTTGCCGCGCATGATGG-TAMRA 3’(序列3)，探针长度为19nt。
实施例2、实时荧光定量PCR检测体系的优化以实施例1中步骤2获得的松材线虫基因组DNA为模板，分别对实时荧光定量PCR检测体系中的镁离子浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、检测松材线虫的引物和探针的浓度及荧光定量PCR循环条件中的延伸温度进行优化，具体步骤如下一、镁离子浓度的优化按如下实时荧光定量PCR反应体系及循环条件对镁离子浓度进行优化，50μL反应体系为5μL 10×PCR反应缓冲液、镁离子(25mM)(选择体积分别为2、3、4、5、6、7、8、9μL)、4μL dNTP(2.5mM)、4μL检测松材线虫的正向引物(序列1)(10μM)、4μL检测松材线虫的反向引物(序列2)(10μM)、2μL探针(序列3)(10μM)、0.4μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)、2μL模板DNA(终浓度约0.2ng/μL)，最后用双蒸水补充到50μL；反应条件为第一阶段95℃3min；第二阶段95℃45s，60℃15s，40次循环。结果表明镁离子最佳终浓度为3mM。
二、Taq DNA聚合酶浓度的优化按如下实时荧光定量PCR反应体系及循环条件对Taq DNA聚合酶浓度进行优化，50μL反应体系为5μL 10×PCR反应缓冲液、4μL MgCl2(25mM)、4μL dNTP(2.5mM)、检测松材线虫的正向引物(序列1)、反向引物(序列2)各4μL(10μM)、2μL探针(序列3)(10μM)、2μL模板DNA(终浓度约0.2ng/μL)、Taq DNA聚合酶(5U/μL)(选择体积分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8μL)，最后用双蒸水补充到50μL；反应条件为第一阶段95℃3min；第二阶段95℃45s，60℃15s，40次循环。结果表明Taq DNA聚合酶最佳浓度为3U/50μL。
三、dNTP浓度的优化按如下实时荧光定量PCR反应体系及循环条件对dNTP浓度进行优化，50μL反应体系为5μL 10×PCR反应缓冲液、4μL MgCl2(25mM)、dNTP(2.5mM)(选择加入体积分别为0.4、1、2、4、6、8、10μL)、检测松材线虫的正向引物(序列1)、反向引物(序列2)各4μL(10μM)、2μL探针(序列3)(10μM)、2μL模板DNA(终浓度约0.2ng/μL)、0.4μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，最后用双蒸水补充到50μL；反应条件为第一阶段95℃3min；第二阶段95℃45s，60℃15s，40次循环。结果表明dNTP最佳浓度为0.2mM。
四、检测松材线虫的引物浓度的优化按如下实时荧光定量PCR反应体系及循环条件对引物浓度进行优化，50μL反应体系为5μL 10×PCR反应缓冲液、4μL MgCl2(25mM)、4μL dNTP(2.5mM)、检测松材线虫的正向引物(序列1)(10μM)、反向引物(序列2)(10μM)(加入体积分别为0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4μL)、2μL探针(序列3)(10μM)、0.4μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)、2μL模板DNA(终浓度约0.2ng/μL)，最后用双蒸水补充到50μL；反应条件为第一阶段95℃3min；第二阶段95℃45s，60℃15s，40次循环。结果表明正向、反向引物的最佳浓度为400nM。
五、检测松材线虫的探针浓度的优化按如下实时荧光定量PCR反应体系及循环条件对探针浓度进行优化，50μL反应体系为5μL 10×PCR反应缓冲液、4μL MgCl2(25mM)、4μL dNTP(2.5mM)、检测松材线虫的正向引物(序列1)、反向引物(序列2)各4μL(10μM)、0.4μL TaqDNA聚合酶(5U/μL)，探针(序列3)(10μM)(体积分别为0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2μL)、2μL模板DNA(终浓度约0.2ng/μL)，最后用双蒸水补充到50μL；反应条件为第一阶段95℃3min；第二阶段95℃45s，60℃15s，40次循环。结果表明探针最佳浓度为200nM。
六、实时荧光定量PCR循环条件中延伸温度的优化按如下实时荧光定量PCR反应体系及循环条件对实时荧光定量PCR循环条件中延伸温度进行优化，50μL反应体系为5μL 10×PCR反应缓冲液、4μL MgCl2(25mM)、4μL dNTP(2.5mM)、检测松材线虫的正向引物(序列1)、反向引物(序列2)各4μL(10μM)、2μL探针(序列3)(10μM)、0.4μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)、2μL模板DNA(终浓度约0.2ng/μL)，最后用双蒸水补充到50μL；反应条件为第一阶段95℃3min，第二阶段95℃45s，延伸15s，40次循环，延伸温度分别是55℃，58℃，60℃，61℃，62℃，63℃。结果表明循环条件中最佳延伸温度为60℃。
其中，优选的实时荧光PCR检测体系为3mM Mg2+，0.2mM dNTP，检测松材线虫的正向引物(序列1)、反向引物(序列2)各400nM，检测松材线虫的探针(序列3)200nM，Taq DNA聚合酶3U/50μL，延伸温度60℃。
实施例3、检测松材线虫的探针的灵敏度检测用紫外分光光度计测定实施例1中提取的松材线虫基因组DNA的浓度，并将其稀释为50μL中分别含有800pg、80pg、8pg、0.8pg、0.08pg、0.008pg及0.0008pg核酸，以上述7个不同浓度的松材线虫基因组DNA为模板，用实施例2优选的实时荧光PCR检测体系检测探针的灵敏度，反应条件为第一阶段95℃3min，第二阶段95℃45s，60℃15s，40次循环。结果表明该探针可检测到的最小DNA含量为8pg。
实施例4、用实时荧光定量PCR技术检测松材线虫的专化性实验分别来自日本、德国、意大利、美国及中国江苏、山东、浙江、安徽、广州等地不同种群的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(B.mucronatus)、B.fraudulentus、B.tusciae，及其模式种Caenorhabditis elegans共17个，其中松材线虫8个不同种群，拟松材线虫6个不同种群，B.fraudulentus、B.tusciae各1个，模式线虫1个。
按如下实时荧光定量PCR反应体系及循环条件对实时荧光定量PCR循环条件中延伸温度进行优化，50μL反应体系为5μL 10×PCR反应缓冲液、3mM Mg2+、0.2mM dNTP、2μL模板DNA(终浓度约0.2ng/μL)、检测松材线虫的正向引物(序列1)、反向引物(序列2)各400nM、检测松材线虫的探针(序列3)200nM、Taq DNA聚合酶3U/50μL；反应条件为第一阶段95℃3min；第二阶段95℃45s，延伸15s，40次循环，延伸温度为60℃。8个松材线虫种群都能检测出来，而其他线虫没有信号。
序列表<160>3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gatgatgcga ttggtgact 19<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2aacgacgcga atcgaacc 18<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3cggttgccgc gcatgatgg 19
权利要求
1.一种检测松材线虫的专用引物及探针，所述专用引物由正向引物和反向引物组成，正向引物是3’末端序列为3’-TCAGT的16-30个核苷酸的寡核苷酸序列，反向引物是3’末端序列为3’-CCAAG的16-30个核苷酸的寡核苷酸序列；所述探针是3’末端序列为3’-GGTAGTACGCGCC的16-25个核苷酸的寡核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的专用引物及探针，其特征在于所述探针的3’端标记有一个淬灭荧光基团，5’端标记有一个报告荧光基团。
3.根据权利要求1或2所述的专用引物及探针，其特征在于所述正向引物具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述反向引物具有序列表中序列2的核苷酸序列；所述探针具有序列表中序列3的核苷酸序列。
4.一种利用权利要求1或2或3所述的引物及探针检测松材线虫的方法，是以线虫样品的基因组DNA为模板，用所述检测松材线虫的引物和探针进行实时荧光定量PCR，检测扩增产物的荧光信号。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述线虫样品为同一种线虫的纯样品或多种线虫的混合样品，其虫态为成虫和/或卵和/或幼虫。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述线虫样品经提取液和蛋白酶K处理、离心，取上清，即得到所述线虫样品的基因组DNA；所述提取液为25mMTris-HCl，125mM KCl，0.3mM Mg2+，0.25mM DTT，1.2％Tween-20，pH 9-10。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述实时荧光定量PCR的反应体系除含有所述线虫样品的基因组DNA外，还含有PCR预混液2.5-3.5mM Mg2+，0.2-0.3mM dNTP，Taq DNA聚合酶3-3.5U/50μL，检测松材线虫的正、反向引物各300-500nM，检测松材线虫的探针150-250nM。
8.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述实时荧光定量PCR的反应程序为先95℃预变性3min，随后进行40个循环95℃变性45sec、55-61℃延伸15sec。
9.一种检测松材线虫的试剂盒，它包括权利要求1或2或3所述的专用引物及探针。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括线虫样品提取液，PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP和Taq DNA聚合酶。
全文摘要
本发明公开了一种检测松材线虫的方法及其专用引物和探针，其目的是提供一种检测松材线虫的方法及其专用引物和探针与包括该引物和探针的检测松材线虫的试剂盒。该专用引物由正向引物和反向引物组成，正向引物是3’末端序列为3’－TCAGT的16－30个核苷酸的寡核苷酸序列，反向引物是3’末端序列为3’－CCAAG的16－30个核苷酸的寡核苷酸序列；该探针是3’末端序列为3’－GGTAGTACGCGCC的16－25个核苷酸的寡核苷酸序列。用本发明的方法检测松材线虫具有快速简单、灵敏度高、特异性强、干扰性污染低的优点，不仅可检测同一种线虫幼虫的纯样品或多种线虫的混合样品，还可检测成虫等不同虫态的样品。
文档编号G01N21/76GK1614396SQ200410098620
公开日2005年5月11日 申请日期2004年12月14日 优先权日2004年12月14日
发明者刘杏忠, 曹爱新, 朱水芳 申请人:中国科学院微生物研究所