专利名称：Dna片段扩增方法,扩增dna片段的反应装置和制备该反应装置的方法
技术领域：
本发明涉及扩增相对长的DNA片段的反应装置和及其制备方法。
背景技术：
已知聚合酶链反应(PCR)是一种扩增特定DNA片段的方法(见，例如，美国专利号4,683,195)。在普通的PCR过程中，首先将目标DNA热变性形成单链DNA，并且通过退火，引物与获得的单链DNA结合，所述引物具有与所述DNA末端碱基序列互补的碱基序列。其后，通过应用DNA聚合酶来进行互补链DNA的延伸反应，并且重复这样的循环来指数地扩增目标DNA。
常规地，出于在不需另外应用电场的延伸条件下使用扫描隧道显微镜观察链型聚合物分子诸如DNA的目的，公开了一项技术，其中当DNA的一端与电极接触时，将溶液加热并且其另一端垂直地延伸到电极，由此在延伸时将分子结合和固定到基底上(见，例如，日本专利号3,064,001)。
发明内容
但是，在常规PCR中，通过PCR以相对长的DNA片段，例如数十kb或更长的片段作为模板进行扩增是困难的。
考虑到上述情况，本发明的一个目的是提供一项技术从而在甚至使用长DNA片段的模板情况中进行有效扩增。
本发明的发明人已经考虑到不能有效进行相对较长的DNA片段，例如数十kb或更长的片段模板的PCR过程的一个原因是模板的过长DNA片段倾向于被扭曲，并且因为那个原因，中断了互补链DNA的延伸反应，由此导致了本发明的开发。
由于起始模板使用的长DNA片段诸如，例如，染色体DNA，或通过超声波打断的DNA片段除扩增目标部分外还包含许多序列，在那里发生了更大的扭曲，并且因此其将成为扩增DNA的障碍。在这样的情况中，考虑通过阻止DNA片段这样的扭曲可以更高效的进行初级互补链的延伸反应。
按照本发明，提供了扩增DNA片段的方法，其包括使DNA片段结合于在基底(base)构件的表面上形成的结合部位；在DNA片段与基底构件的表面结合的状况下，通过将DNA片段用作模板来合成DNA片段的互补链。
由于这提供了将用作模板的DNA片段结合并固定于基底构件的表面的条件，当合成DNA片段的互补链时，即使是将相对长的DNA片段用作模板，也可以减少DNA片段的扭曲，由此优选地进行互补链的合成。
按照本发明扩增DNA片段的方法可以具有一种构型(configuration)，其中构造结合部位以结合DNA序列，所述DNA序列位于扩增目标DNA片段的扩增目标区的外侧。
在此，“外侧”指除扩增目标区之外的扩增目标DNA片段的部分。扩增目标DNA片段的扩增目标区的外侧都可以与基底构件的表面结合，或仅有其一个外侧也可以与基底构件的表面结合。当仅有其一个外侧与基底构件的表面结合时，在通过例如，在互补链的合成过程中在反应场中产生某种流速来延伸DNA片段的状况下，进行互补链的合成是优选的。因为具有这样的构型，可以减少DNA片段的扭曲，由此提供互补链的更好的合成。
按照本发明的扩增DNA片段的方法可以具有一种构型，在所述构型中结合部位可以包括用作固定的寡核苷酸，其具有与扩增目标DNA片段的部分互补的序列。
因为具有这样的构型，扩增目标DNA片段的部分通过氢键在结合部位与用于固定的寡核苷酸结合，从而使DNA片段可以与结合部位结合。
按照本发明扩增DNA片段的方法可以具有一种构型，在所述构型中，结合部位包含两种或更多类型的用于固定的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与位于扩增目标DNA片段的扩增目标区的两个外侧中的DNA序列互补的序列。
因为具有这样的构型，扩增目标DNA片段的扩增DNA靶向区的两个外侧通过氢键在结合部位都与用于固定的寡核苷酸结合，由此容许DNA片段通过两点与结合部位结合。
按照本发明扩增DNA片段的方法可以具有一种构型，其中，在其结合过程中，将DNA片段在延伸条件下与基底构件的表面结合。
因为具有这样的构型，可以减少DNA片段的扭曲，从而可以适当地进行互补链的合成。
按照本发明扩增DNA片段的方法可以具有一种构型，其中通过在其结合过程中使用例如，剪切应力，将DNA片段在延伸条件下，与基底构件的表面结合。可以应用在反应场(field)生产中产生流速的方法，或提供反应场旋转的方法来提供剪切应力。
按照本发明扩增DNA片段的方法可以具有一种构型，其中，在其结合过程中，通过对DNA片段施加低频电场，将DNA片段在延伸条件下与基底构件的表面结合。在本文，低频电场可以是，例如，等于或低于100Hz的电场。
按照本发明扩增DNA片段的方法可以具有一种构型，其中在其结合过程中，通过对DNA片段施加高频电场，将DNA片段在延伸条件下与基底构件的表面结合。在本文，高频电场可以是，例如，等于或高于500Hz的电场。
按照本发明扩增DNA片段的方法可以具有一种构型，其还包括在结合DNA片段后，伸展基底构件的表面。
因为具有这样的构型，可以减少DNA片段的扭曲，从而可以适当地进行互补链的合成。
按照本发明扩增DNA片段的方法可以具有一种构型，在所述构型中，互补链的合成包括模板DNA片段和互补链的变性和分离，其中在DNA片段的结合中，将DNA片段固定在结合部位从而使DNA片段在变性和分离中不从结合部位分离出来。
在模板DNA片段和互补链的变性和分离中，通常加入大约95℃的加热步骤。即使在按照本发明扩增DNA片段的方法中加入所述温度的加热步骤，优选将DNA片段固定在结合部位从而避免从结合部位分离DNA片段。例如，当结合部位包括上述的用于固定的寡核苷酸时，通过氢键提供的DNA片段与结合部位的键合将可能不足以在模板DNA片段和互补链的变性和分离过程中避免DNA片段与结合部位键合的钝化。为了避免钝化在本发明这种情况中的DNA片段与结合部位的键合，通过，例如共价键可以固定DNA片段和结合部位。
按照本发明扩增DNA片段的方法可以具有一种构型，其中扩增目标DNA片段具有等于或长于10kb的长度。
虽然在常规扩增方法中，当使用这种相对长的DNA片段作为模板时可能会发生DNA片段的扭曲，按照本发明的扩增DNA片段的方法，即使在使用相对长的DNA片段作为模板时，也可以抑制DNA片段的扭曲从而提供更好的扩增反应。
按照本发明扩增DNA片段的方法可以具有一种构型，在所述构型中，使结合部位具有一定形式从而与扩增目标DNA片段的扩增目标DNA区的部分结合，并且所述方法还包括，在互补链的合成中，钝化(deactivating)DNA片段与结合部位的键合。作为钝化DNA片段与结合部位的键合的方法，可以加入大约75℃-85℃的加热步骤。当对模板DNA片段和互补链进行变性和分离时，虽然加入大约90℃的加热，如上所述，与DNA片段与互补链的键合比较，在结合部位与DNA片段的键合中，结合在其上的DNA的碱基数目非常少。与DNA中具有更大数目的碱基的情况相比，结合在其上的DNA中的较小数目的碱基在双链间提供较弱的键合强度，并且因此，当加入大约75℃-85℃的加热步骤时，尽管模板DNA在延伸状态中没有从互补链中分离出来，仍可以钝化结合部位与DNA片段的键合。在模板DNA片段的互补链延伸到某一程度的阶段中，通过从结合部位分离模板DNA片段也可以合成其结合部位的互补序列。由于这提供了包括在合成的互补链中的结合部位，可以将互补链固定在基底构件的表面，由此以提高的效率获得相对长的DNA片段的扩增。
按照本发明的另一个方面，提供了进行DNA片段扩增反应装置，其包括基底构件的表面；在基底构件的表面上形成的和能够结合以扩增目标DNA片段的结合部位。
由于通过将扩增目标DNA片段引入由此构建的反应装置来使DNA片段结合和固定在结合部位上，即使将相对长的DNA片段用作模板，也抑制了DNA片段的扭曲从而提供DNA片段的更好的扩增。
按照本发明的反应装置可以具有一种构型，其中在多个区域上形成结合部位，在所述区域之间具有一定距离。在此，优选各个区域之间的距离可以是与扩增目标DNA片段的扩增目标部分的长度大致相同的长度。因为具有这样的构型，通过提供将位于DNA片段的扩增目标部分的外侧的DNA序列与结合位点的结合，可以在将所述DNA片段延伸到一定程度的状况下，将其固定到基底构件的表面，并且因此可以减少DNA片段的扭曲。
按照本发明的反应装置可以具有一种构型，其中结合部位可以包括在基底构件表面上形成的多个突出部分。在此，突出部分可以是通过精细加工形成的柱状构件。优选地，突出部分之间的距离可以是与扩增目标DNA片段的扩增目标部分的长度大致相同的长度。因为具有这样的构型，通过提供将位于DNA片段的扩增目标部分的外侧的DNA序列与结合位点的结合，可以在DNA片段延伸到一定程度的状况下，将所述DNA片段固定到基底构件的表面，并且因此可以减少DNA片段的扭曲。而且，通过向结合部位提供突出部位，可以在突出部分上捕获DNA片段以促进固定。
按照本发明的反应装置可以具有一种构型，其中结合部位与扩增目标DNA片段的两个外侧结合。因为具有这样的构型，在将DNA片段延伸到一定程度的状况下，可以将DNA片段固定在基底构件的表面，并且因此可以减少DNA片段的扭曲。
按照本发明的反应装置可以具有一种构型，其中结合部位包括用于固定的寡核苷酸，其具有与扩增目标DNA片段的部分互补的序列。
按照本发明的反应装置可以具有一种构型，其中基底构件由能够伸展的材料组成。例如，基底构件可以由橡胶或塑料材料组成。
而且，按照本发明的反应装置还可以包括一种组件(unit)，所述组件可以用于在延伸条件下固定DNA片段。这样的组件的典型实例可以包括施加低频电场和高频电场的电场施加组件，以及将剪切应力施加到反应场的剪切应力施加组件。例示的剪切应力施加组件可以包括例如，在反应场中产生流速的搅拌构件，提供反应容器的旋转的旋转组件或类似物。
按照本发明的另外一方面，提供了生产反应装置进行DNA片段扩增的方法，其包括形成结合部位，所述结合部位在基底构件的表面与扩增目标DNA片段结合；以及将扩增目标DNA片段与结合位点结合。
按照本发明生产反应装置的方法可以具有一种构型，其中，在结合部位的形成中，将用于固定的寡核苷酸固定在基底构件的表面，所述寡核苷酸具有与扩增目标DNA片段的部分互补的序列。
按照本发明生产反应装置的方法可以具有一种构型，其中在结合DNA片段的过程中，在延伸条件下，DNA片段与基底构件的表面结合。
按照本发明生产反应装置的方法还可以包括在结合DNA片段后，拉伸基底构件的表面。
按照本发明，即使将相对长的DNA片段用作模板，也可以获得更好的DNA的扩增。
附图简述本发明的上述和其它目标、优势和特点将通过随后优选的实施方案与附图的描述而更加清楚。
图1是流程图，其显示在本发明实施方案中的PCR的程序。
图2包括透视图，其举例说明了在本发明实施方案中一种生产反应装置的方法。
图3包括简图，其举例说明了在本发明的实施方案中使用的起始模板DNA的实例。
图4包括简图，其举例说明了在本发明的实施方案中一种形成反应装置的柱状构件的方法。
图5包括简图，其举例说明了在本发明的实施方案中一种形成反应装置的柱状构件的方法。
图6包括简图，其举例说明了在本发明的实施方案中一种形成反应装置的柱状构件的方法。
图7包括简图，其举例说明了在本发明实施方案中一种生产反应装置的方法。
图8包括简图，其举例说明了在本发明实施方案中反应装置的结构。
图9包括简图，其举例说明了在本发明实施方案中一种生产反应装置的方法。
图10包括简图，其举例说明了在本发明实施方案中，一种固定起始模板DNA的方法。
图11包括简图，其举例说明在本发明实施方案中的反应装置。
图12包括简图，其举例说明了在本发明实施方案中的另一个反应装置。
图13包括简图，其举例说明了在本发明实施方案中一种扩增起始模板DNA的方法。
图14是一个概念简图，其举例说明了在本发明的实施方案中一种固定DNA链的方法。
图15包括方法简图，其举例说明了在本发明实施方案中一种制备基底的方法。
实施本发明的最佳方式图1是流程图，其显示了在本发明实施方案中的PCR的程序。
首先，通过超声波打断具有扩增目标部分的染色体DNA以获得包含起始模板DNA(S10)的片段。虽然在这个场合下，染色体DNA是被随机打断的，进行的断裂使片段包括扩增目标部分和位于扩增目标部分的两个外侧中的用于固定的部分。这些片段的功能是作为起始模板DNA。在本实施方案中，将起始模板DNA用作模板来合成起始模板DNA的扩增目标部分的初级互补链，随后，将合成的互补链用作模板来继续合成相应的互补链。由于起始模板DNA是通过随机打断获得的，其包括除扩增目标部分之外的碱基序列并且因此具有更长的结构。因此，按照原样使用起始模板DNA作为模板是困难的。在本实施方案中，将起始模板DNA固定以合成互补链后，获得的互补链仅由扩增目标部分组成，并且因此可以不需要另外的固定而有效合成相应的互补链。因为具有这个程序，起始模板DNA的扩增目标部分可以亚-指数地进行扩增。
接下来，通过使用碱或加热使起始模板DNA片段变性从而修饰双链-起始模板DNA片段形成单链产物(S12)。另一方面，形成了固定起始模板DNA片段的固定表面(S14)。将用于与起始模板DNA形成化学键的用于固定的寡核苷酸固定在固定表面上。用于固定的寡核苷酸具有与在起始模板DNA中用于固定的部分互补的序列。形成固定表面的方法随后将在各自的实施方案中进行描述。
随后，已经被修饰成单链的起始模板DNA片段通过化学键(S18)粘附于固定表面的用于固定的寡核苷酸。
由于在此情况中，用于固定的寡核苷酸具有与起始模板DNA片段的用于固定部分互补的序列，起始模板DNA片段和用于固定的寡核苷酸形成氢键。然后，将起始模板DNA片段固定于固定表面，从而当在随后的PCR过程(S20)中加入加热步骤时，避免了起始模板DNA片段与用于固定的寡核苷酸之间键的断裂。在此，通过使用例如，交联剂，诸如补骨脂素可以通过共价键将起始模板DNA片段与用于固定的寡核苷酸结合。
在此情况中，起始模板DNA可以在延伸条件(S16)下与用于固定的寡核苷酸粘附，或可以在固定于用于固定的寡核苷酸以获得起始模板DNA延伸的条件后延伸起始模板DNA，并且在这些条件下进行随后的PCR过程。
首先，将固定表面引入反应容器中进行PCR。然后，通过混合特定量的PCR缓冲溶液、引物(有义引物，反义引物)、耐热的DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP:dATP(2’-脱氧腺苷5’-三磷酸)，dGTP(2’-脱氧鸟苷5’-三磷酸)，dCTP(2’-脱氧胞苷5’-三磷酸)和dTTP(2’-脱氧胸苷5’-三磷酸的混合物)制备反应溶液，并且将其引入反应容器中。随后，取决于引物的寡核苷酸的熔解温度，例如，加入大约50℃-70℃的加热步骤，通过退火(S22)使起始模板DNA片段与引物结合。然后，取决于所用的耐热DNA聚合酶的最适反应温度，反应在，例如大约70℃进行以通过使用耐热的DNA聚合酶(S24)合成起始模板DNA的片段的互补链DNA。
然后，例如，加入大约95℃的加热步骤使合成的起始模板DNA片段和互补链DNA变性以获得单链，并且接着重复普通PCR过程，其包括退火、互补链延伸和变性。此外，取决于使用的耐热DNA聚合酶的特性，还可以使用双-温度反应系统。
由于在本发明的实施方案中，在延伸条件下将起始模板DNA片段固定在固定表面上来进行PCR过程，减少了DNA片段的扭曲，因此即使起始模板DNA片段较长，也可提供DNA的更好的扩增。
第一个实施方案图2是透视图，其举例说明了生产本实施方案反应装置10的方法。
反应装置10包括基底12和多个在基底12上形成的柱状构件14(图2(a))。虽然基底12图解为平面，可以使具有在基底12上形成的柱状构件14的区域形成凹的部分，从而使其具有一定形式能够将各种类型的试剂引入基底12。此外，还可以在将基底12引入反应容器的条件下，将各种类型的试剂引入反应容器。
当柱状构件14显示为圆筒时，可以使用任何类型的几何形状来提供形成突出部分，在其上可以固定起始模板DNA片段，诸如准-圆筒几何形状诸如圆柱形；锥状物诸如圆锥、椭圆锥状物、三角角锥和四角角锥；矩形柱诸如三角柱和正方柱；以及另外地条纹状突出物或类似物。各个柱状构件14的距离d可以等于在延伸起始模板DNA的条件下，在起始模板DNA的扩增目标部分的两个外侧上提供的用于固定的部分之间的距离，或稍短于用于固定的部分之间的距离。起始模板DNA的长度可以是，例如2-100kb。1bp的DNA长度约是0.33nm，因此各个柱状构件14的距离d可以是，例如约600nm-35μm。
基底12可以由弹性材料，诸如硅、玻璃、石英、各种类型的塑料材料、橡胶等组成。至于塑料材料，优选地使用具有较好加工性能的那些，并且典型塑料材料可以包括，例如，热塑性树脂诸如聚(异丁烯酸甲酯)(PMMA)、聚乙烯对苯二酸酯(PET)、聚碳酸酯(PC)等，或热固性树脂诸如环氧树脂。可以用金属诸如金(Au)或类似物涂布基底12和柱状构件14的表面。基底12和柱状构件14的表面保持清洁是优选的。当基底12由硅组成时，基底12和柱状构件14的表面可以在用氧化硅(SiO2)薄膜涂布的环境中。
将用于固定的寡核苷酸16粘附于因此具有一定形式的基底12和柱状构件14的表面(图2(b))，所述寡核苷酸16具有与起始模板DNA中用于固定的部分互补的序列。当基底12由玻璃组成时，或当用氧化硅薄膜，或金属涂布基底12和柱状构件14的表面时，通过保持基底12和柱状构件14的表面清洁，用于固定的寡核苷酸16可以吸附于基底12和柱状构件14的表面。
如下描述关于使用由硅组成的基底12的情况。在此情况中，可用的用于固定的寡核苷酸16可以是，例如，在引物5末端(5’末端)包含硫羟基团。在此情况中，将能够结合硫醇的化学化合物，预先固定在基底12和柱状构件14的表面。将描述固定这些化学化合物的方法。首先，将基底12浸在，例如1∶1混合比率的conc.HCl∶CH3OH的混合溶液中约30分钟，然后用蒸馏水漂洗，其后浸于conc.H2SO4约30分钟，然后用蒸馏水漂洗，其后用去离子水煮沸几分钟。随后，将氨基硅烷，诸如，例如，1％的蒸馏的三甲氧基甲硅烷基丙基二亚乙基三胺(DETA)溶液或N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(EDA)(在1mM乙酸水溶液中)等引入基底12，并且在室温进行其反应约20分钟。
这提供了将DETA或EDA固定于基底12的表面。其后，通过用蒸馏水漂洗去除残余物，并且通过在惰性气体气氛下于约120℃加热3-4分钟来进行干燥。随后，用1％的间，对-(氨基乙基氨基甲基)苯乙基三甲氧基硅烷(PEDA)溶液(在95∶5比率的CH3OH∶1mM乙酸水溶液的混合物中)于室温将基底12处理约20分钟，然后用CH3OH漂洗。其后，在惰性气体气氛中，通过于约120℃加热3-4分钟来进行干燥。
随后，制备双官能的交联剂诸如1mM的琥珀酰亚胺基4-[马来酰亚胺苯基]丁酸酯(SMPB)溶液等，然后将其溶解在少量的二甲亚砜(DMSO)中，其后用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、DMSO或溶剂混合诸如DMSO和C2H5OH的组合，或DMSO和CH3OH的组合对其进行稀释。于室温，将基底12浸于这样的稀释溶液中约2小时，并且在用稀释溶剂漂洗后，在惰性气体气氛中进行干燥。
因为具有这样的程序，SMPB中的酯基团与EDA或其类似物中的氨基基团反应以提供一种情形，其中马来酰亚胺暴露在基底12和柱状构件14的表面上。在这样的情形中，当将具有硫羟基团的用于固定的寡核苷酸16引入反应装置10时，用于固定的寡核苷酸16中的硫羟基团与基底12和柱状14的表面上的马来酰亚胺反应，从而将固定16的寡核苷酸固定在基底12和柱状构件14的表面上(见，例如，Chrisey等，Nucleic AcidsResearch，1996，24卷，15期，3031-3039页)。这容许提供用于固定的寡核苷酸16在基底12和柱状构件14的表面上的固定。
其后，在延伸起始模板DNA 18的条件下，将起始模板DNA 18粘附于基底12和柱状构件14的表面上(图2(c))。可以通过与如上所述的制备普通PCR的起始模板DNA的技术相似的技术来制备所述起始模板DNA18。当使用巨大的DNA诸如染色体DNA时，例如，首先通过超声波将其打断以提供DNA片段，随后通过碱或加热变性来获得单链。当将因而形成单链的DNA片段处理到基底12和柱状构件14的表面上时，因为用于固定寡核苷酸16被固定于基底12和柱状构件14的表面中，起始模板DNA18的用于固定的部分形成与用于固定的寡核苷酸16互补的键。如在这种场合中显示的，尽管起始模板DNA 18可以在收缩条件或卷曲条件中被粘附，如果将其至少一个部分粘附于多个柱状构件14上时，通过使用起始模板DNA 18作为模板，可以顺利进行随后的PCR。
为了延伸起始模板DNA 18，在例如将低频电场施加到基底12上的条件下，将起始模板DNA 18引入基底12。在此，低频电场可以是例如，等于或低于100Hz的电场。这容许延伸无规卷曲的起始模板DNA 18。或者，为了延伸起始模板DNA 18，在例如将高频电场施加到基底12上的条件下，将起始模板DNA 18引入基底12。在此，高频电场可以是，例如等于或高于500Hz的电场。其产生了一种介电电泳，由此提供起始模板DNA 18的延伸。
此外，为了延伸起始模板DNA 18，还可以使用剪切应力。例如，可以使用喷射起始模板DNA 18由此将其粘附在基底12和柱状构件14的表面上的方法，或在反应场中产生流速然后在那里将起始模板DNA 18粘附于基底12和柱状构件14的表面上的方法，或类似方法。产生流速的方法可以是，例如，在旋转基底12的同时，将起始模板DNA 18引入反应场，由此粘附在基底12和柱状构件14的表面上。
随后，将起始模板DNA 18固定在用于固定的寡核苷酸16上(图2(d))。例如，使用补骨脂素20诸如4，5’，8-三甲基补骨脂素来将起始模板DNA18固定在用于固定的寡核苷酸16上。将补骨脂素20嵌入DNA的双链序列之间，并且通过照射约320nm-400nm上的光，使其与邻近的嘧啶碱基结合，由此提供了双链之间的强烈结合。在此过程后，例如，可以用缓冲液漂洗来将没有被固定在基底12和柱状构件14的表面上的残余的起始模板DNA 18去除。
将反应溶液引入起始模板DNA 18被固定在基底12和柱状构件14的表面上的反应装置10中，通过混合特定量的PCR缓冲溶液、引物(有义引物、反义引物)，耐热的DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP:dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物)制备所述反应溶液。
其后，适当控制反应场的温度来进行引物在起始模板DNA 18上的退火并且用耐热DNA聚合酶延伸与起始模板DNA 18互补的互补链DNA。在起始模板DNA 18的互补链形成后，通过将这次的这些互补链用作模板来重复进行包括变性、退火和互补链延伸的普通PCR过程。通过使用起始模板DNA 18作为模板形成的互补链具有一定长度，所述长度能够提供不需进行固定而作为模板的功能，然后可以高效进行互补链的延伸。其提供了亚指数地扩增起始模板DNA 18的互补链。
图3包括简图，其图解说明了使用在本实施方案中的起始模板DNA的实例。
如图3(a)所显示的，通过熔解包含起始模板DNA 18a和起始模板DNA18b的双链来获得起始模板DNA，所述起始模板DNA 18a具有从5’末端侧起的DNA序列A’、D’、B’，所述起始模板DNA 18b具有从5’末端侧起的DNA序列B、C’、A。在此，DNA序列A’、B’、A和B的功能是作为用于固定的部分。此外，DNA序列D’和C’的功能是作为扩增目标部分和引物结合部分的起始点。在此，A表示与A’互补的序列，B表示与B’互补的序列，C表示与C’互补的序列，以及D表示与D’互补的序列。
图3(b)是一个简图，其显示粘附于基底12的固定16a和16b的寡核苷酸。出于将起始模板DNA 18a粘附于基底12的目的，用于固定的寡核苷酸16a具有DNA序列A和B，它们分别与起始模板DNA 18a中的用于固定部分的DNA序列A’和B’互补。出于将起始模板DNA 18b粘附于基底12的目的，用于固定的寡核苷酸16b具有DNA序列A’和B’，它们分别与起始模板DNA 18b中的用于固定部分的DNA序列A和B互补。
图3(c)显示将起始模板DNA 18a粘附于用于固定的寡核苷酸16a的情形。然后，如图3(d)所示，用补骨脂素20强化使起始模板DNA 18a固定在用于固定的寡核苷酸16a上。随后，如图3(e)所示，引入引物来开始PCR，所述引物具有与起始模板DNA 18a的DNA序列D’互补的DNA序列D。如图3(f)所示，关于具有与起始模板DNA 18a互补的序列的起始模板DNA 18b，可以通过引入引物开始PCR，所述引物被固定在用于固定的寡核苷酸16b上并且具有与DNA序列C’互补的序列C。
接着，将描述在基底12上形成柱状构件14的方法。首先，参考图4，图5和图6，将描述在基底12由硅组成的情况中形成柱状构件14的方法。当可以通过将基底12蚀刻成某种模式的几何形状来进行柱状构件14在基底12上的形成时，不特别限制其形成的方法。
在此，在每个图中，中心简图是平视图，并且右边和左边的简图是截面视图。在这个方法中，通过利用应用光刻胶的平板印刷术技术来形成柱状构件14。
在该情况中，对于基底12，使用具有平取向的硅基底(100)。如在图4(a)中所显示的，在这个顺序中，首先在基底12上形成了氧化硅薄膜185和“sumiregist NEB”183(由Sumitomo Chemical Co.，Ltd生产)。氧化硅薄膜185和“sumiregist NEB”183的薄膜厚度分别是300nm和400nm。接着，将柱状构件14的区域暴露于光。通过使用二甲苯进行显色法，并且用异丙醇进行漂洗。如图4(b)所显示，该方法提供了“sumiregist NEB”183的模式。
随后将正光刻胶155涂布到其整个表面上(图4(c))。将其薄膜厚度调整到1.8μm。其后，进行遮蔽-暴露从而将区域暴露于反应容器112，然后进行显色(图5(a))。
然后，通过使用CF4和CHF3的气体混合物，进行氧化硅薄膜185的反应性离子蚀刻。
将蚀刻的薄膜的厚度设定为300nm(图5(b))。通过使用丙酮、乙醇和水的混合溶液进行有机洗涤来剥去“sumiregist NEB”183，然后进行氧化的等离子体处理(图5(c))。随后，通过使用HBr气体对基底12进行电子回旋共振(ECR)蚀刻。将蚀刻的硅基底的间隔(或柱状构件的高度)设定为3μm(图6(a))。随后，通过使用缓冲的氢氟酸(BHF)进行湿式蚀刻过程以去除氧化硅薄膜(图6(b))。通过上述方法，在基底12上形成柱状构件14。
在此，当将塑料材料用于基底12时，可以通过已知方法进行柱状构件14的形成，所述方法适合于基底12的材料的类型，诸如蚀刻、使用金属塑模的压缩模塑诸如压花模塑、注射成型、光硬化模塑等。
当基底12是由塑料材料组成时，通过机制或蚀刻来制备标准样品，并且使用通过经过电铸型的标准样品模式的反向转移制备的金属塑模进行注射成型或注射压缩模塑以形成具有在其上形成的柱状构件14的基底12。或者，还可以通过应用金属塑模的压缩方法来形成柱状14。此外，还可以通过应用光聚合树脂的激光束平版印刷术来形成具有在其上形成的柱状构件14的基底12。
第二个实施方案图7包括简图，其举例说明了在本发明第二个实施方案中制备反应装置10的方法。在本实施方案中，将起始模板DNA 18引入基底12后，把基底12压缩地进行拉伸以进一步延伸粘附于柱状构件14的起始模板DNA18。在本实施方案中，基底12由弹性材料诸如各种类型的可伸展材料，橡胶等组成。这样的材料包括，例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
如上所述，即使起始模板DNA 18在延伸条件下，粘附和固定于基底12和柱状构件14的表面上，起始模板DNA 18的部分可以经常仍旧在如图7(a)所示的收缩状态。为了进一步高效延伸其进行PCR，在本实施方案中，如图7(b)所显示的，通过使用加压构件22如图7(c)所示的延伸基底12，来从基底12背面一侧向基底12加压。因为具有这样的程序，增加了构件14之间的距离，并且起始模板DNA也在延伸的状态，所述起始模板DNA一个末端和另一个末端都分别固定于邻近的柱状构件14。
此外，在本实施方案中，如图8所示，可以提供给基底12以凹的部分，并且在凹部分中形成柱状构件14(图8(a))的条件下将起始模板DNA 18引入，并且然后，在引入起始模板DNA 18后(图18(b))，可以翻转基底12的凹的部分来获得基底12的表面的延伸，所述基底12具有在其上形成的柱状构件14。
第三个实施方案图9包括简图，其举例说明在本发明实施方案中制备反应装置的方法。在不提供形成于基底12上的柱状构件14这一方面，本实施方案不同于第一个和第二个实施方案。
首先，用于固定的寡核苷酸16粘附于基底12的表面上(图9(a))。将用于固定的寡核苷酸16粘附于基底12的表面的方法类似于在第一个实施方案中使用的方法。随后，将起始模板DNA 18固定于基底12(图9(b))。相似地，如在第一个实施方案中，通过诸如，例如施加低频、施加高频电场、使用剪切应力等方法，在延伸条件下将起始模板DNA 18粘附在基底12的表面上。相似地，如在第一个实施方案中所述的，通过交联剂将起始模板DNA 18固定于用于固定的寡核苷酸16。尽管在本实施方案中，在这种条件下可以进行PCR，相似地，如在第一个实施方案中，还可以在如下伸展基底12后进行PCR。
如在图9(c)中所显示的，对基底12的每一侧施加均匀力量来拉伸基底12。这伸展了基底12，并且固定在基底12上的起始模板DNA 18也被延伸了(图9(d))。当基底12以这种方式延伸时，基底12优选地由一种材料组成，所述材料能够被均匀延伸并且在延伸后没有收缩能力。例如，可以应用作为这种类型的材料的PDMS。
因为具有这样的构型，可以在延伸起始模板DNA 18的条件下，以简单的方法进行PCR。
第四个实施方案在用于固定的寡核苷酸16粘附于表面珠子，而不是基底12的表面上这一点中，本实施方案不同于第一到第三个实施方案，将起始模板DNA 18固定于用于固定的寡核苷酸16后，然后通过移动珠子可以延伸起始模板DNA 18。在本实施方案中，将Optical Tweezers用作移动珠子的计量装置。
图10是一个简图，其举例说明在本实施方案中固定起始模板DNA 18的方法。首先，将具有固定在那里用于固定的寡核苷酸16a(DNA序列A和B)的标记珠子30引入反应装置10(图10(a))。可获得的标记珠子30可以包括，例如，聚苯乙烯珠、胶态金、胶乳珠、二氧化硅或类似物的微细颗粒。
随后，将起始模板DNA 18a引入标记珠子30上。由于具有这样的程序，在标记珠子30上固定的用于固定的寡核苷酸16a和在起始模板DNA18a中用于固定的部分(DNA序列A’和B’)形成互补键(图10(b))。其后，相似地，如第一个实施方案中所描述的，将用于固定的寡核苷酸16a固定于起始模板DNA 18a中的进行固定的部分。在这个场合下，如在简图中所示，将至少一些引入的起始模板DNA 18a结合在两个标记珠子30上。
随后，用光钳32来移动标记珠子30(图10(c))。光钳是一种以非接触和非侵袭的方式通过由具有更大光圈的透镜凝聚的激光束在水中捕获微细材料的方法。因此，对于上述标记珠子30使用透明微粒是优选的，所述透明微粒具有比水的波长更大的直径和具有比水更大的折射率。此外，还可以将具有比水更短的波长的金属微细微粒用于标记的珠子30。这容许用激光束捕获标记的珠子30。通过使用光学显微镜可以观察这些标记珠子30，并且可以移动这些标记珠子30从而使标记珠子30之间的距离是，例如略短于起始模板DNA 18的扩增目标部分的长度。由于具有这种构型，可以延伸结合在两个标记珠子30上的起始模板DNA 18a(图10(d))。
第五个实施方案图11是一个简图，其显示在本发明第五个实施方案中的反应装置10。在此，将试管34用作反应装置10，所述试管34其中包含用于固定的寡核苷酸(未显示)。例如，将缓冲液引入试管34并且旋转试管34，同时保持其条件，将通过把起始模板DNA 18溶解在缓冲液中制备的溶液引入试管34(图11(a))中。在此，由于试管34的旋转，将剪切应力施加到引入的起始模板DNA 18上，并且因此，使起始模板DNA 18在延伸条件下粘附于试管34的侧壁上(图11B)。其后，通过真空去除方法或类似方法来去除缓冲液以获得具有固定在试管34侧壁上的起始模板DNA 18的反应装置10(图11(c))。
图12是一个简图，其显示本实施方案中反应装置10的另一个实例。在此，可以将起始模板DNA 18引入在基底12上形成的孔36(图12(a))。图12(b)是沿直线A-A’的图12(a)的截面图。在此情况中，在旋转基底12的同时，将起始模板DNA溶液引入孔36。因为具有这种构型，可以获得具有固定在孔36的侧壁上的起始模板DNA 18的反应装置10。
第六个实施方案当在构型中，起始模板DNA 18包含扩增目标部分和位于扩增目标部分外侧的进行固定的部分，并且在上述的第一个到第五个实施方案中固定用于固定的部分的条件下，通过使用扩增目标部分作为模板合成了互补链时，还可以通过将起始模板DNA 18中用于固定的部分用作扩增目标来合成互补链。因为具有这样的构型，通过将起始模板DNA 18用作模板合成的互补链还具有用于固定的部分，并且因此可以将合成的互补链固定于基底12的表面，由此提供更长的DNA链的有效扩增。
图13包括简图，其举例说明了在本实施方案中扩增起始模板DNA 18的方法。如在图13(a)中所示，起始模板DNA 18包括序列a’a’a’和序列b’b’b’。在基底12上，固定了用于固定的寡核苷酸16，所述寡核苷酸具有互补于起始模板DNA 18中的序列a’a’a’的序列aaa。在此，序列a’a’a’和序列b’b’b’位于起始模板DNA 18的扩增目标部分的各个末端。在这种条件下，将包含互补于序列b’b’b’的序列bbb的引物引入来启动PCR。
如图13B所显示的，具有序列bbb的引物与在起始模板DNA 18中的序列b’b’b’产生氢键，并且通过PCR合成了与起始模板DNA 18互补的互补链。例如，在约70℃，通过PCR进行了互补链的合成。随后，在PCR过程进行到一定程度的一个阶段中，将反应容器中的温度增加到约75-85℃，从而将具有序列aaa的用于固定的寡核苷酸16与在起始模板DNA 18中的序列a’a’a’的键合钝化，并且还合成了与在起始模板DNA18中的序列a’a’a’互补的链，由此获得了次级模板DNA 18’，其是起始模板DNA 18的互补链(图13(c))。
当起始模板DNA 18和次级模板DNA 18’是等于或高于几kb的更长DNA链时，与起始模板DNA 18的长度比较，用于固定的寡核苷酸16是大约几十到几百b的非常短的DNA链。由于与更长的DNA链相比，较短的DNA链在双链之间具有较弱的结合强度，双链之间的键易于为加热时产生的分子能量所影响而被钝化。因此，在本实施方案中，在PCR过程中从起始模板DNA 18分离合成的次级模板DNA 18’的变性过程前，加入比变性过程中设定的温度更低的温度的加热步骤来从用于固定的寡核苷酸16分离起始模板DNA 18，同时在结合起始模板DNA 18和次级模板DNA 18’的条件下延伸次级模板DNA 18’，从而可以合成次级模板DNA 18’。
随后，将反应容器中的温度增加到约90-98℃来使起始模板DNA 18和次级模板DNA 18’变性，由此形成了单链(图13(d))。在此，如在第一个实施方案中所述，通过使用施加低频电场和高频电场的电场施加组件和将剪切应力施加到反应场的剪切应力施加组件，来进行起始模板DNA 18和次级模板DNA 18’的延伸。
如图13(e)所示，由于合成了次级模板DNA 18’从而将互补于序列a’a’a’的序列aaa包含在起始模板DNA 18中，可以在延伸条件下，通过将具有序列a’a’a’的用于固定的寡核苷酸16固定在基底12上，来将合成的次级模板DNA 18’固定在基底12上。随后，通过分别将起始模板DNA 18和次级模板DNA 18’用作模板，来将具有序列bbb的引物和具有序列b’b’b’的引物引入合成各个互补链。
重复上述过程来继续扩增起始模板DNA 18。由于在本实施方案中，将合成的DNA链固定于基底12上，可以高效指数级地扩增相对较长的DNA链。
第七个实施方案还可以将上述实施方案所述的延伸模板DNA的方法和将其固定在基底上的方法应用于在特定位点断裂DNA链的技术。将在本实施方案中描述将DNA链固定在基底上从而使DNA链断裂的预期位点与脱氧核糖酶(DNase)接触以提高特异性断裂该位点的可能性的方法。
图14是概念简图，其举例说明在本实施方案中固定DNA链的方法。在此，如所示，待断裂的断裂目标DNA 48包括用于固定部分的序列a’a’a’和序列b’b’b’。将包含序列aaa的用于固定的寡核苷酸42和包含序列bbb的用于固定的寡核苷酸44固定到基底40上。所述序列aaa与序列a’a’a’互补，并且所述序列bbb与序列b’b’b’互补。在基底40上，介于用于固定的寡核苷酸42和用于固定的寡核苷酸44之间，当在延伸条件下将待断裂的断裂目标DNA 48固定到用于固定的寡核苷酸42和用于固定的寡核苷酸44上时，将切口酶46固定于与待断裂的DNA48的待断裂的位点C相应的位置上。通过以这种方式构建基底40，当将待断裂的DNA48固定于基底40上时，待断裂位点c与切口酶46接触的可能性增加，因而其断裂能够在特定的位点有效地进行。所述切口酶46是DNA酶。
图15包括流程图，其举例说明了一种在本实施方案中制造基底12的方法。
首先，如图15(a)中所示，将用于固定的寡核苷酸42粘附在基质40上的长条中。随后，如图15(b)中所示，将用于固定的寡核苷酸44粘附其上于长条中，与用于固定的寡核苷酸42间隔一定的距离。在用于固定的寡核苷酸42和用于固定的寡核苷酸44之间的间隔优选可以与待断裂的DNAs 48的用于固定的部分之间的距离相等或较其稍短。其后，如图15(c)中所示，当待断裂的DNA 48被延伸并固定到用于固定的寡核苷酸42和用于固定的寡核苷酸44上时，将切口酶46附于长条之内定位到待断裂位点的一个位置上。将由此形成的待断裂的DNA 48引入到基底40中以便将DNA 48中的用于固定的部分与用于固定的寡核苷酸42和用于固定的寡核苷酸44结合，由此将待断裂的DNA48固定到基底40上。
在此情况下，由于待断裂的DNA 48的待断裂位点被布置在基底40上的切口酶46附近，待断裂的DNA 48的待断裂位点被切口酶46有效地断裂。
尽管可以多种方式将用于固定的寡核苷酸42、用于固定的寡核苷酸44和切口酶46固定于基底40上，仍要举例说明一些示范性的方法。作为一个例子，当基底40由硅组成时，能够通过硅烷偶联试剂将用于固定的寡核苷酸42、用于固定的寡核苷酸44和切口酶46固定于基底40上，所述偶联试剂与在第一个实施方案中所述的诸如氨基硅烷等相似。首先，将硅烷偶联试剂选择性地引入到基底40表面上的位置上，并通过硅烷偶联试剂将用于固定的寡核苷酸42固定到基底40上，在所述位置用于固定的寡核苷酸42会被固定。接下来，将类似的硅烷偶联试剂选择性地引入到基底40表面上的位置上，并通过硅烷偶联试剂将用于固定的寡核苷酸44固定于基底40，在所述位置用于固定的寡核苷酸44会被固定。随后，将类似的硅烷偶联试剂选择性地引入到基底40表面上的位置上，并通过硅烷偶联试剂将切口酶46固定到基底40上，在所述位置切口酶46会被固定。
或者，作为另一个例子，在基底40的表面上形成疏水区域，随后将用于固定的寡核苷酸42、用于固定的寡核苷酸44和切口酶46按顺序粘附于所述疏水区域之外的其它区域上。在此情况中，基底40由，例如，玻璃组成，或者用氧化硅薄膜涂布基底40的表面，或者用金属涂布。在这种状态下，对基底40的表面提供清洁的条件，随后向除了基底40的所述区域之外的区域提供疏水性，将用于固定的寡核苷酸42固定到所述基底40的区域上。可以通过采用诸如印模或喷墨式印刷的印刷技术来进行向基底40的表面提供疏水性的过程。在利用印模的方法中，采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)树脂。通过使硅氧烷油聚合来处理PDMS树脂，并在树脂化之后保持在分子内空间之中包含充满的硅氧烷油的条件。因此，当PDMS树脂与疏水表面，如，例如，玻璃表面接触时，接触部分需要较强的疏水性并且因而排斥水。通过利用这种特性，采用具有凹入部分的PDMS模块作为冲压印并与疏水性基底40接触以提供对于除了形成用于固定的寡核苷酸42区域的区域的疏水性，所述凹入部分相应于形成用于固定的寡核苷酸42的区域。
在利用喷墨式印刷的方法中，采用一种具有较低粘性的硅氧烷油类型作为喷墨式印刷的墨水，以这样一种模式进行印刷，即，使得硅氧烷附于除了形成用于固定的寡核苷酸42区域的基底40表面中的区域。
在将用于固定的寡核苷酸42附于基底40的表面上之后，使用一种有机溶剂将应用在基底40表面上的硅氧烷油或其类似物洗去，随后通过与将用于固定的寡核苷酸42附于基底40的表面上相同的方法，将用于固定的寡核苷酸44附于基底40的表面上。其后，通过利用一种有机溶剂再次将应用在基底40表面上的硅氧烷油或类似物洗去。
随后，通过采用一种包括切口酶46的溶液作为喷墨式印刷的墨水，将切口酶46附于基底40表面上的相关位置。
在此，通过分别利用包括用于固定的寡核苷酸42的溶液和包括用于固定的寡核苷酸44的溶液作为墨水，可以将用于固定的寡核苷酸42和用于固定的寡核苷酸44等同地附于基底40的表面上。喷墨式印刷法的墨水可以优选包括一种防腐剂，用以防止切口酶46、用于固定的寡核苷酸42和用于固定的寡核苷酸44或类似物的变性。
此外，在本实施方案中，可以形成突出部分诸如柱状构件以提供一种构型，其中类似于第一个实施方案中所述的，将待断裂的DNA 48固定到所述突出部分上。
此外，在第一个实施方案中，可以类似于第七个实施方案中所述的，等同地采用喷墨式印刷法的技术，以提供一种固定的寡核苷酸以某种距离排列的模式，而非形成柱状构件14。此外，在上述第一到第七个实施方案中，可以通过利用多种类型的已知技术来进行，如光刻蚀术等，以及上面陈述的方法进行用于固定到基底上的寡核苷酸的固定。
实施例将参考如下的实施例对本发明进行描述，但是本发明并不受限于此。
在本实施例中，采用秀丽小杆线虫(C.elegans)的基因组DNA作为模板DNA 18。该线虫具有16,000到19,000个基因，在本实施例中，对这些基因的一个50kb的区域(在图3(a)中90k到140k左右)进行扩增，所述区域包括第四染色体中的基因tpa-1到daf-1。在此情况中，选择80k左右和150k左右的两个位置作为在起始模板DNA 18中用于固定的部分。
在本实施例中，采用下列序列A和B作为用于固定的寡核苷酸16。此外，采用下列序列C和D作为引物(有义引物，反义引物)。
A5’-SH-agcttacgacaaaatgcacaaattcacaaaattt-3’(序列号1)；B5’-SH-gcgtcattattctgatggttatctttttgagaggt-3’(序列号2)；C5’-actttcccacacttgataaatatcctcg-3’(序列号3)；和D5’-ataatcgttttcaaccgcaaaattacag-3’(序列号4)。
实施例1通过在第一个实施方案中所述的方法制备在基底12表面上形成的具有柱状构件14的反应装置10。在此情况中，基底12由硅基底所组成，所述硅基底具有(100)平板作为主平面。通过在图4到图6中所述的方法形成柱状构件14。在此情况中，形成柱状构件14以提供大约20μm的间距d。随后，将EDA固定到基底12和柱状构件14的表面上，并且随后，通过在第一个实施方案中所述的方法将SMPB固定到EDA上。其后，将在上述序列A和B中的用于固定的寡核苷酸引入以便将在序列A和B中的用于固定的寡核苷酸固定到基底12和柱状构件14上。
在对基底12施加大约10Hz低频电场的条件下，将起始模板DNA 18引入到基底12和柱状构件14上。
接下来，将TEN缓冲液(10mM tris(pH7.6)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)溶液和50mM NaCl)引入反应装置10中，随后将4，5’，8-三甲基补骨脂素的乙醇溶液引入到反应装置10中，并在其嵌入大约2分钟之后，通过利用紫外线(UV)装置(UVP生产)照射大约365nm的光大约20分钟。其后，用缓冲溶液清洁基底12的表面以去除起始模板DNA，其未被固定到基底12的表面或柱状构件14的表面上。
接下来，通过TaKaRa LA PCRTM方法进行PCR反应。如上面所描述的，将合适数目的具有起始模板DNA固定于其上的大约3mm2的反应装置转移到精细的离心容器中。
将10μl的10×LAPCR缓冲液II(不含Mg2+)，10μl的25mM MgCl2，16μl的dNTP混合物(每种组分2.5mM)，各自1μl(100pmol/μl)的引物(有义引物，反应引物)和1μl的TaKaRa LA Taq加入其中，随后向其中加入灭菌蒸馏水以获得100μl的总体积。其后，通过利用热循环仪在94℃进行变性反应1分钟，随后进行14个循环的反应循环，其包括于98℃变性20秒和于68℃引物退火与延伸互补链DNA 20分钟；以及16个循环的反应循环，其包括于98℃变性20秒和于68℃引物退火和延伸互补链DNA20分钟和15秒；最后将混合物在72℃反应10分钟。
将通过上述反应获得的产物在0.4％，高强度类型的琼脂糖凝胶中进行电泳，并且观察到了50kbp的扩增片段。
实施例2通过第三个实施方案中描述的方法生产反应装置10。在不具有形成于基底12的表面上的柱状构件14这一方面，这种情况不同于实施例1。相似于实施例1，基底12由具有(100)平面的主平面的硅基底组成。相似地，如在实施例1中，当将起始模板DNA固定于基底12的表面上时，进行PCR。结果，通过上述反应获得的产物也在本实施例中的0.4％，高强度类型的琼脂糖凝胶中进行电泳，并且也观察到了约50kbp的扩增片段。
序列表<110>日本电气株式会社<120>DNA片段扩增方法和扩增DNA片段的装置<130>34103754<160>4<210>1<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>misc结合<400>1agcttacgac aaaatgcaca aattcacaaa attt 34<210>2<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>misc结合<400>2gcgtcattat tctgatggtt atctttttga gaggt 35<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>3actttcccac acttgataaa tatcctcg 28<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4ataatcgttt tcaaccgcaa aattacag 28
权利要求
1.一种扩增DNA片段的方法，其包括将所述DNA片段结合于在基底构件表面上形成的结合部位；并且在所述DNA片段与所述基底构件的表面结合的状况下，通过将所述DNA片段用作模板来合成所述DNA片段的互补链。
2.按照权利要求1的扩增DNA片段的方法，其中构造所述结合部位以与DNA序列结合，所述DNA序列位于扩增目标DNA片段的扩增目标区域的外侧。
3.按照权利要求1的扩增DNA片段的方法，其中所述结合部位包含两种或更多类型的用于固定的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与位于扩增目标DNA片段的扩增目标区域的两个外侧中的DNA序列互补的序列。
4.按照权利要求1的扩增DNA片段的方法，其中所述合成互补链包括将所述模板DNA片段和所述互补链进行变性和分离，并且其中在所述结合所述DNA片段中，所述DNA片段被固定在所述结合部位从而使所述DNA片段在所述变性和分离中不从所述结合部位中分离出来。
5.按照权利要求1的扩增DNA片段的方法，其中构造所述结合部位以与扩增目标DNA片段的扩增目标区域的一部分结合，并且所述方法还包括，在所述合成互补链中，钝化所述DNA片段与所述结合部位的键合。
6.按照权利要求1的扩增DNA片段的方法，其中所述结合部位包括用于固定的寡核苷酸，其具有与扩增目标DNA片段的一部分互补的序列。
7.按照权利要求1的扩增DNA片段的方法，其中在所述结合所述DNA片段中的延伸条件下，所述DNA片段与所述基底构件的表面结合。
8.按照权利要求7的扩增DNA片段的方法，其中通过在所述结合所述DNA片段中将低频电场施加到所述DNA片段上，在延伸条件下，将所述DNA片段与所述基底构件的表面结合。
9.按照权利要求7的扩增DNA片段的方法，其中通过在所述结合所述DNA片段中将高频电场施加到所述DNA片段上，在延伸条件下，将所述DNA片段与所述基底构件的表面结合。
10.按照权利要求1的扩增DNA片段的方法，其还包括在所述结合所述DNA片段后，伸展所述基底构件的表面。
11.按照权利要求1的扩增DNA片段的方法，其中所述扩增目标DNA片段具有等于或大于10kb的长度。
12.一种进行DNA片段扩增的反应装置，其包括基底构件的表面；和结合部位，其在所述基底构件的所述表面上形成并且能够被结合以扩增目标DNA片段。
13.按照权利要求12的反应装置，其中所述结合部位形成于在其间具有一定距离的多个区域上。
14.按照权利要求12的反应装置，其中所述结合部位包括多个形成于所述基底构件表面上的突出部分。
15.按照权利要求12的反应装置，其中所述结合部位包括用于固定的寡核苷酸，其具有与扩增目标DNA片段的部分互补的序列。
16.按照权利要求12的反应装置，其中构造所述结合部位以结合DNA序列，所述DNA序列位于扩增目标DNA片段的扩增目标区域的两侧中。
17.按照权利要求12的反应装置，所述基底构件由能够被伸展的材料组成。
18.一种生产反应装置的方法，所述装置用于进行DNA片段的扩增，该方法包括在基底构件的表面上形成与扩增目标DNA片段结合的结合部位；和使所述扩增目标DNA片段与所述结合部位结合。
19.按照权利要求18的生产反应装置的方法，其中在所述形成所述结合部位中，将用于固定的寡核苷酸固定在所述基底构件的表面上，所述寡核苷酸具有与扩增目标DNA片段的部分互补的序列。
20.按照权利要求19的生产反应装置的方法，其中在所述结合所述DNA片段中，在延伸条件下，将所述DNA片段与所述基底构件的表面结合。
21.按照权利要求19的生产反应装置的方法，其还包括在所述结合所述DNA片段后，拉伸所述基底构件的表面。
全文摘要
一种反应装置(10)包括基底(12)和多个在基底(12)上形成的柱状构件(14)。将用于固定的寡核苷酸(16)粘附于基底(12)和柱状构件(14)的表面上，所述寡核苷酸(16)具有与起始模板DNA(18)的两个末端的序列互补的序列。在延伸条件下，通过引入起始模板DNA(18)，可以将起始模板DNA(18)固定在邻近的柱状构件(14)上。在这种条件中进行PCR。
文档编号G01N33/53GK1761748SQ200480007420
公开日2006年4月19日 申请日期2004年3月17日 优先权日2003年3月18日
发明者佐野亨, 马场雅和, 饭田一浩, 川浦久雄, 井口宪幸, 服部涉, 染谷浩子 申请人:日本电气株式会社