专利名称：白斑症病毒现场检测试纸及其制备、使用方法
技术领域：
本发明涉及养殖病害病原检测技术的改进，具体讲是一种白斑症病毒(white spot syndromevirus，WSSV)现场检测试纸及其制备、使用方法，其属于免疫学和病毒学交叉技术领域。
背景技术：
白斑症病毒病是对虾养殖中危害严重的疾病之一，导致很高的对虾死亡率，给对虾养殖业造成了巨大的损失。鉴于白斑症尚无有效的治疗方法，快速准确的病毒分离检测技术已成为各国学者研究的焦点之一。目前，白斑症病毒病的诊断主要是依靠实验室内对白斑症病毒检测来确诊，现实验室检测方法有PCR法；DNA探针原位杂交法；透射电镜观察法；光镜下HE染色观察法，酶联免疫吸附检测法以及斑点免疫印迹检测法等。这些方法，操作程式较为复杂，需要一定的实验室仪器设备，且耗时较长，整个过程需要几个乃至十几个小时，达不到快速、现场检测的目的。PCR法灵敏度高，可用于无症状病虾的检测，但其高灵敏度易导致假阳性结果；酶联免疫吸附检测法及斑点免疫印迹检测法，是目前常用的检测方法，但被检组织的内源酶可以对其检测结果产生干扰，导致假阳性的出现。因此一种适用于水产养殖病害病原的快速、准确、简便、现场、无假阳性的检测方法的研制势在必行，以期达到早发现、早预防的目的。
发明内容
本发明的白斑症病毒现场检测试纸及其制备、使用方法是针对白斑症病毒病严重危害对虾养殖业的现状，迫切需要一种简便、快速、现场、准确的检测方法和低等水生生物生理特点而设计发明的，以达到快速、简便、现场、准确的检测目的。
本发明的目的是由以下技术方案实现的，研制了一种白斑症病毒现场检测试纸，具包括适当尺寸的不干胶载体板；保减号为CCTCC-C200421杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的、胶体金标记的单克隆抗体E(简称金标单抗E)；保藏号为CCTCC-C200423杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的单克隆抗体F(简称单抗F)和羊抗小鼠1gG(简称羊抗鼠IgG)。在该载体板的两端部，分别设有加样端吸水层和手持端吸水层；在该载体板中部段设有硝酸纤维膜的检测层，在该检测层与加样端吸水层交界处，设有载有金标单抗E的玻璃纤维层块，该层块一端部分设置在加样端吸水层之下，其另一端部分设置在该检测层之上；在与该层块延续的检测层上设有检测线和质控线，该检测线和质控线处分别包被有单抗F和羊抗鼠IgG。
所述的金标单抗E，其制备方法如下(1)胶体金的制备以公知的胶体金的制备工艺将氯金酸溶液与柠檬酸钠混合，加热制成胶体金溶液；(2)金标单抗E的制备将单克隆抗体E加入到上述(1)步的胶体金溶液中，慢搅混匀，加入牛血清白蛋白，离心后的沉淀用含有牛血清白蛋白、叠氮钠的磷酸盐缓冲液悬起，制成金标单抗E液体；(3)载有金标单抗E的玻璃纤维层块的制备将上述(2)步制成的金标单抗E液体，喷在玻璃纤维膜上至液体开始渗出为止，冷冻干燥，4℃保存备用。
一种白斑症病毒现场检测试纸的使用方法首先，使用病毒提取装置，快速地从被检测的虾鳃中提取白斑症病毒，制备检测样品；然后，手持该试纸的手持端，将该试纸的加样端吸水层插入或在其上滴加该检测样品，5分钟内在位于检测层下端的检测线和在位于检测层上端的质控线处显示红色，即双红线，表示白斑症病毒阳性和检测试纸有效。
所述的制备检测样品的过程是使用由试管和捣碎棒组成的病毒提取装置，先将试管中加入液体，然后，取被检虾腮加入至试管中，用捣碎棒将其充分捣碎，使病毒释放于该试管液体中，即制成检测样品。
所述的加入试管中的液体，其是池塘水，蒸馏水，自来水，pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，pH6.0-8.0的Tris-氯化钠缓冲液中的任意一种。
本发明的优点在于本发明以现有技术的实际特点，研制了一种白斑症病毒快速现场检测试纸及其制备、使用方法，采用从靶器官中简单的提取病毒，直接对含病毒的检测样品液进行检测，其原理是白斑症病毒现场检测试纸采用夹心免疫层析原理，即由金标单抗E同检测样品液中的抗原反应，形成由金标单抗E-白斑症病毒复合物，当该复合物层析至硝酸纤维素膜上预先包被在检测线上的单抗F处时，此处的抗体会识别该复合物中抗原，反应的结果便形成了金标单抗E+白斑症病毒抗原+单抗F的夹心结构，最终是单抗E上标记的胶体金颗粒在此固定并累积出现肉眼可见的红色线，未反应的金标单抗E则仍继续层析前行，当到达点预先包被在质控线羊抗鼠IgG处时，抗体类型为IgG的金标单抗E被其结合住，从而在此处也出现由胶体金颗粒固定并累积而显现出肉眼可见的红色线，结果是检测线显示红色表示白斑症病毒阳性；检测线不显示红色，表示白斑症病毒阴性，即检测样品中不含白斑症病毒或是白斑症病毒含量极低。质控线显示红色，表示试纸有效；质控线处不显示红色，说明试纸失效，即或是金标抗体E、或是羊抗鼠IgG失活，检测结果无效。本发明的特点是(1)本发明的白斑症病毒现场检测试纸，具有简便、快速、现场、准确、灵敏等特点，无需专门设施和操作技术，适于普通养殖户池边检测。(2)本发明的白斑症病毒现场检测试纸使用方法中，由小管与捣碎棒组成的快速病毒提取装置，可直接取池塘水或自来水等用于提取病毒的媒介液，无需加入特殊的裂解液；只需将虾鳃捣碎即可，与传统病毒提取研磨、离心等方法相比，此法方法方便、简单、快速，达到现场提取病毒检测的目的。(3)本发明的白斑症病毒现场检测试纸，制备方法简单、稳定性、重复性好。经实际应用证明本发明的白斑症病毒现场检测试纸具有简便、快速、现场、准确、灵敏的特点。
附图及其具体实施方式
本发明的实施例结合附图进一步描述如下
图1白斑症病毒现场检测试纸示意图；图2白斑症病毒现场检测试纸的检测结果示意图。
参见图1，2本发明白斑症病毒现场检测试纸，其包括适当尺寸的不干胶载体板7；保藏号为CCTCC-C200421杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的、胶体金标记的单克隆抗体E(简称金标单抗E)；保藏号为CCTCC-C200423杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的单克隆抗体F(简称单抗F)和羊抗小鼠IgG(简称羊抗鼠IgG)。在该载体板7的两端部，分别设有加样端4吸水层和手持端1吸水层；在该载体板7中部段设有硝酸纤维膜的检测层2，在该检测层2与加样端4吸水层交界处，设有载有金标单抗E的玻璃纤维层块3，该层块3一端部分设置在加样端4吸水层之下，其另一端部分设置在该检测层2之上；在与该层块3延续的检测层2上设有检测线6和质控线5，该检测线6和质控线5处分别包被有单抗F和羊抗鼠IgG。
实施例1.
所述的单抗E胶体金标记方法为(1)胶体金的制备18-20nm胶体金颗粒制备，将0.01％氯金酸溶液100ml与0.1％柠檬酸钠2.5ml混合，加热致100℃制成胶体金溶液，该溶液的pH值用0.2％碳酸钾调至8.0-8.4，备用；(2)金标单抗E的制备将1μl抗体加入1ml胶体金中，混均，加入10％氯化钠100μl，观察颜色变化，如果变蓝，则说明抗体不足，再不断的增加抗体量，直至胶体金颜色不变为准，在此基础上，将此抗体量增加50-100％，此时为1ml胶体金标记的最适单抗量。用此适宜单抗量进行胶体金标记，标记后的胶体金无沉淀、无非特异性吸附，达到实验标准。按此最适单抗量，即单抗E浓度为0.5-2g/L时，1ml胶体金标记的最适单抗量为15-20μl。将单抗E加入到胶体金溶液中，慢搅10min，加入1％牛血清白蛋白，4℃过夜；然后将其在4℃下，18000g离心110min；取离心沉淀，用含有1％牛血清白蛋白、0.02％叠氮钠的0.01M磷酸盐缓冲液(PBSKCI 0.2g，NaCI 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO412H2O 2.9g，蒸馏水1000ml，pH7.4)悬起，制成金标单抗E。
实施例2.
载有金标单抗E的玻璃纤维层块的制备将制成的金标单抗E液体，喷在玻璃纤维膜上至液体开始渗出为止，冷冻干燥，4℃保存备用。
实施例3.
本发明的白斑症病毒现场检测试纸检测层制备方法为辛酸法提纯的抗白斑症病毒单抗F冷冻干燥后，制备成4mg/ml抗白斑症病毒单抗F液，用喷膜机将其喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线6；同样，将羊抗小鼠IgG，制备成300μg/ml，用喷膜机将其喷于硝酸纤维素膜上，形成质控线5。两线相距5mm，质控线5近手持端吸水层，检测线6近加样端吸水层。室温下晾干，再用pH7.4，含10％牛血清白蛋白的0.01M PBS 37℃封闭30min，PBS漂洗晾干。
实施例4.
本发明的分别分泌单抗E和F的两株杂交瘤细胞，其制备与选择的方法如下(1)用提纯的白斑症病毒液为抗原，免疫Balb/c小白鼠；(2)将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，培养得520株杂交瘤细胞；(3)采用间接免疫荧光法筛选出抗白斑症病毒的阳性杂交瘤细胞株；(4)采用有限稀释法对其中30株阳性杂交瘤细胞进行了克隆；(5)通过免疫电镜，筛选出20株抗白斑症病毒囊膜的单抗。
(6)通过不同模式金标免疫层析方法选出2株不同的抗白斑症病毒的单抗E和F，分别作为金标单抗与包被检测线单抗。其具体实验方法为通过免疫电镜选出与病毒囊膜结合位点最多的单抗E，为金标单抗；通过免疫电镜选出与病毒囊膜结合位点较多的4种单抗，单抗C、单抗G、单抗A以及单抗F，分别以同浓度、同体积的这4种单抗为包被抗体，同时检测同一白斑症病毒样本，结果单抗F为包被抗体时，效果最佳(见表1)。因而，选择单抗E作为金标单抗，而单抗F为包被检测线的单抗。
表1不同模式检测白斑症病毒的金标免疫层析结果包被单抗单抗C、单抗G、单抗A单抗F金标免疫层析结果+ + +++注++表示检测线显紫红色为较强阳性；+表示检测线显红色为阳性；实施例5.
本发明的白斑症病毒现场检测试纸的使用方法，即白斑症病毒的检测步骤首先，使用病毒提取装置，快速地从被检测的虾鳃中提取白斑症病毒，制备检测样品；所述的制备检测样品的过程是使用由试管和捣碎棒组成的病毒提取装置，先将试管中加入液体，然后，取被检虾腮加入至试管中，用捣碎棒将其充分捣碎，使病毒释放于该试管液体中，即制成检测样品。具体的操作过程是加池塘水，蒸馏水，自来水，pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，pH6.0-8.0的Tris-氯化钠缓冲液中的任意一种至试管0.5ml刻度处，取1-2只成虾鳃或整只幼虾，放入试管中，充分捣碎，制成检测样品。
然后，将试纸的加样端4吸水层浸入试管的检测样品中，液面不要超过MAX线，5分钟内读结果。
阳性结果检验层2上下呈现两条红色的检测线5和质控线6，表示有白斑症病毒感染；阴性结果检验层2上端部呈现一条红色检测线5，表示无白斑症病毒感染或其病毒含极低；检测结果无效加样5分钟内，检验层2上端质检线5处无红线出现，表示该试纸失效，检测结果无效。(见图2)实施例6.
本发明的白斑症病毒现场检测试纸检测的最低病毒量的测定如下将提纯的白斑症病毒液稀释用白斑症病毒现场检测试纸进行测定，其结果是该试纸检测最低病毒量为1μg/ml，结果见表2。
表2最低病毒量的测定结果病毒含量(μg/ml)包被抗体 抗体含量(mg/ml) 1005010.5 0.10.054G94++ +++-- -注++表示检测线显紫红色为较强阳性；+表示检测线显红色为阳性；-表示检测线无色为阴性。
实施例7.
本发明的白斑症病毒现场检测试纸检测使用方法的重复性与稳定性测定如下(1)本发明的白斑症病毒现场检测试纸检测使用重复性实验选择2种样品，其分别是患白斑症病的虾鳃，正常虾鳃。用同一批次的胶体金标记抗白斑症病毒的单克隆抗体E制备的白斑症病毒现场检测试纸检测以上所选2种样品，结果显示患白斑症病的虾鳃样品为阳性，正常虾鳃样品为阴性。同样样品，用五个不同批次的胶体金标记抗白斑症病毒的单克隆抗体E制备的白斑症病毒现场检测试纸结果同上。
(2)稳定性实验将本发明的白斑症病毒现场检测试纸分别放入4℃与室温下，每15天用室温下存放的该试纸检测以上2种样品一次，每30天用4℃下存放的该试纸检测以上2种样品一次。结果4℃下存放的该试纸有效期12个月。室温下存放的该试纸有效期6个月。
本发明所用仪器及试剂冰冻切片机(购自LEICA公司)；荧光显微镜(购自O1YMPUS公司)；倒置相差显微镜(购自O1YMPUS公司)；喷膜机(购自美国BIODOT公司)；氯金酸(购自中国上海试剂一厂，批号85-01-02，分析纯)；1640(购自GIBCO公司)；胎牛血清(购自HYCLONE公司)；HAT(购自GIBCO公司)；羊抗小鼠IgG抗体(购自SIGMA公司)；牛血清白蛋白(购自SIGMA公司)；硝酸纤维素膜(购自MILLIPORE公司)；二甲亚砜(购自SIGMA公司)。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
权利要求
1.一种白斑症病毒现场检测试纸，其包括适当尺寸的不干胶载体板；保藏号为CCTCC-C200421杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的、胶体金标记的单克隆抗体E(简称金标单抗E)；保藏号为CCTCC-C200423杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的单克隆抗体F(简称单抗F)和羊抗小鼠IgG(简称羊抗鼠IgG)，其特征在于在该载体板的两端部，分别设有加样端吸水层和手持端吸水层；在该载体板中部段设有硝酸纤维膜的检测层，在该检测层与加样端吸水层交界处，设有载有金标单抗E的玻璃纤维层块，该层块一端部分设置在加样端吸水层之下，其另一端部分设置在该检测层之上；在与该层块延续的检测层上设有检测线和质控线，该检测线和质控线处分别包被有单抗F和羊抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述白斑症病毒现场检测试纸，其特征在于所述的金标单抗E，其制备方法如下(1)胶体金的制备以公知的胶体金的制备工艺将氯金酸溶液与柠檬酸钠混合，加热制成胶体金溶液；(2)金标单抗E的制备将单克隆抗体E加入到上述(1)步的胶体金溶液中，慢搅混匀，加入牛血清白蛋白，离心后的沉淀用含有牛血清白蛋白、叠氮钠的磷酸盐缓冲液悬起，制成金标单抗E液体；(3)载有金标单抗E的玻璃纤维层块的制备将上述(2)步制成的金标单抗E液体，喷在玻璃纤维膜上至液体开始渗出为止，冷冻干燥，4℃保存备用。
3.一种由权利要求1所述白斑症病毒现场检测试纸的使用方法，其特征在于首先，使用病毒提取装置，快速地从被检测的虾鳃中提取白斑症病毒，制备检测样品；然后，手持该试纸的手持端，将该试纸的加样端吸水层插入或在其上滴加该检测样品，5分钟内在位于检测层下端的检测线和在位于检测层上端的质控线处显示红色，即双红线，表示白斑症病毒阳性和检测试纸有效。
4.根据权利要求3所述白斑症病毒现场检测试纸的使用方法，其特征在于所述的制备检测样品的过程是使用由试管和捣碎棒组成的病毒提取装置，先将试管中加入液体，然后，取被检虾腮加入至试管中，用捣碎棒将其充分捣碎，使病毒释放于该试管液体中，即制成检测样品。
5.根据权利要求4所述白斑症病毒现场检测试纸的使用方法，其特征在于所述的加入试管中的液体，其是池塘水，蒸馏水，自来水，pH 6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，pH 6.0-8.0的Tris-氯化钠缓冲液中的任意一种。
全文摘要
本发明是白斑症病毒现场检测试纸，包括不干胶载体板；保藏号为CCTCC－C200421杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的、胶体金标记的金标单抗E；保藏号为CCTCC－C200423杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的单抗F和羊抗小鼠IgG。在该载体板的两端部，设有加样端吸水层和手持端吸水层；在该载体板中部段设有硝酸纤维膜的检测层，在该检测层与加样端吸水层交界处，设有载有金标单抗E的玻璃纤维层块，该层块一端部分设置在加样端吸水层之下，其另一端部分设置在该检测层之上；在与该层块延续的检测层上设有检测线和质控线，该检测线和质控线处分别包被有单抗F和羊抗小鼠IgG。该试纸制备方法简单、稳定性、重复性好，具有简便、快速、现场、准确、灵敏的特点。
文档编号G01N33/52GK1664587SQ20051004212
公开日2005年9月7日 申请日期2005年3月7日 优先权日2005年3月7日
发明者战文斌, 王晓洁, 林颖博 申请人:中国海洋大学