专利名称：包括具有凹陷部分电极的杂交检测装置和包括该检测装置的dna芯片的制作方法
背景技术：
本发明涉及一种杂交检测技术，特别涉及一种在作为用于杂交领域的反应区域中使用电力作用的杂交检测装置，以及包括该检测装置的DNA芯片。
近来，称作所谓的DNA芯片或DNA微阵列(在本申请中以下一般称为“DNA芯片”)的用于生物测定的通过微阵列技术精细地设置预定DNA的集成基片已经用于基因突变分析、SNPs(单核苷酸多态性)分析、基因表达频率分析等，且已经开始广泛地应用于新药物的开发、临床诊断、药物基因组学、进化研究、法医学以及其它领域。
DNA芯片特征在于，由于在玻璃基片或硅基片上集成了多种和大量的DNA寡聚链、cDNA(互补DNA)等，所以能够进行全面的杂交分析。
简要描述使用DNA芯片的分析方法的例子，PCR扩增是通过从细胞、细胞组织等提取的mRNA的反转录PCR反应等至保留在玻璃基片或硅基片上的DNA探针且同时引入荧光探针dNTP来进行，且在基片上进行杂交之后，通过预定检测器测量荧光性。
其次，涉及到电场对在液相中的以带电状态存在的物质的作用的技术是已知的。特别地，核酸分子在液相中电场作用下被拉长或移动是已知的。根据其原理，认为形成核酸分子框架的磷酸盐离子(负电荷)，和由磷酸盐离子附近的水离子化产生的氢原子(正电荷)共同形成离子云。由于采用了高频高压，所以通过负电荷和正电荷产生的极化向量(偶极子)整体上指向同一个方向，且从而拉长了核酸分子。另外，当施加其中电力线聚集在一部分的不均匀电场时，核酸分子移动到电力线聚集的部分(见非专利文件1)。
当DNA溶液设置于微电极之间几十至几百μm的沟槽中，且大约1MV/m和大约1MHz的高频电场施加给DNA溶液时，在以无规绕卷曲形式存在的DNA中产生电介质极化。结果，DNA分子拉长为与电场平行的直线的形式。由于这种电力效应称作“介电泳”是已知的，极化的DNA自发地接近电极边缘，然后通过DNA的一端与电极边缘接触固定在电极边缘(见非专利文献2)。
提出一种器件和一种方法，其中在反应区域中提供电极，且通过电极向核酸分子施加电力效应形成电场。例如专利文献1公开了一种通过使用在形成电场的电极和通过电场在核酸中产生的偶极子之间产生的静电吸引力等以铺展核酸复合体(双链)成平面形状的技术，该核酸复合体一部分固定在基片上。
专利文献2公开了一种用于通过将DNA探针固定在相对电极中的一个上，且在电极之间施加直流电压，也通过凝胶电泳使互补链DNA样品和非互补DNA链样品相互分离。
专利文献3提出一种具有其中低聚核苷酸固定在电极管脚上的结构的DNA芯片。Seiichi Suzuki、Takeshi Yamanashi、Shin-ichi Tazawa、OsamuKurosawa和Masao Washizu“Quantitative analysis on electrostaticorientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescenceanisotropy”，IEEE Transaction on Industrial Applications，第34卷，No.1，75至83页(1998)[非专利文献2]Masao Washizu，“DNA handling while viewing”，VisualizationInformation，第20卷，No.76(2000年1月)[专利文献1]日本专利公开号Hei 7-224086[专利文献2]日本专利公开号2002-168864[专利文献3]日本专利公开号2001-242135发明内容简而言之，现在提出的各种DNA芯片技术可以说成是设置提供用于物质之间相互作用区域的反应区域的技术，即，预先在基片上的用于反应的区域，并在反应区域中固定用于检测的核酸如探针DNA等，以分析作为在用于检测的核酸和互补目标核酸之间的相互反应的杂交。
然而，常规的DNA芯片技术存在基本的技术问题在于，固定用于检测的核酸如DNA探针等的操作和杂交花费较长时间。另外，常规DNA芯片技术在检测表面上存在技术问题，在用于检测的核酸如DNA探针等的集成密度(固定密度)中存在偏差且检测的杂交量是非均匀的。
因此希望提供一种杂交检测装置和包括能解决上述技术问题的该检测装置的DNA芯片。
根据本发明的实施例，提供一种杂交检测装置(以下简称为“检测装置”)，包括提供用于检测的核酸和目标核酸之间的杂交区域的反应区域，且设置相对电极以便能向保存或残留在反应区域中的介质施加电场，其中相对电极中的至少一个电极表面具有凹陷部分，和包括至少一个该检测装置的DNA芯片。
在检测装置中的凹陷部分可以用作固定用于检测的核酸的部分或用于制作杂交改进的区域。另外，例如通过在纳米级上在间隔中有规律地设置凹陷部分，可能在用作检测表面的电极表面上同等地固定用于检测的核酸，并使得在电极表面上杂交的检测量均匀。
另外，本发明可通过用绝缘层(例如氧化膜层)涂覆相对电极，来防止离子化溶液的电化学反应，该离子化溶液可在反应区域中残留。当提供绝缘层时，可在绝缘层中形成凹陷部分。在上侧和下侧上设置相对电极，使反应区域插入到相对电极之间，或在右侧和左侧上设置相对电极，使反应区域插入到相对电极之间。在一些情况下该相对电极可同时设置在上侧和下侧上以及右侧和左侧上。另外，如果需要可不考虑相对电极设置的位置而提供多个相对电极。在任何情况下，如上所述凹陷部分形成在一对相对电极中的至少一个上。顺便提及，根据该目的凹陷部分可在形成相对电极的两个电极上形成。
当在上侧和下侧上设置相对电极，使反应区域插入到相对电极之间时，通过使得至少在下侧上的电极为传输预定波长的激发光的电极，能够从反应区域下侧进行光学检波。即，有可能在检测装置下方的区域中集成涉及光学检波器件的器件组，和有可能在反应区域上方的区域内集成用于如滴落介质的器件组。因此可使得器件组紧凑。
相对电极用作在介质中形成电场的装置。根据该目的，可选用直流电场、交流电场、低频电场或高频电场作为电场。特别是当施加高频交流电场时，在不产生由于电解产生气泡的条件下获得了介电泳的电力效应，因此存在于反应区域中的核酸分子可被拉长(伸展)或移动。
特别在凹陷部分的最深部分和最深部分附近的区域，电场聚集且因此形成不均匀电场。因此有可能将用于检测的核酸移动到该区域，同时通过介电泳拉长用于检测的核酸，且由此在短时间内完成固定操作。
另外，通过利用介电泳将目标核酸移动到凹陷部分的最深部分和该最深的区域附近的区域，并由此增加目标核酸的浓度，以及进一步拉长(伸展)目标核酸以调节其高级结构且因此在杂交的时候降低位阻(steric hindrance)，有可能增加杂交效率。即，可使杂交快速进行。
以下将定义本发明中使用的主要技术术语。
“用于检测的核酸”是在保存或残留在反应区域中的介质中以固定状态中或自由状态中存在的核酸分子，且该核酸分子用作检测具有特别是与核酸分子特定相互反应的互补碱基序列核酸分子的探针(传感器)，。典型的例子是DNA探针等的寡聚核苷酸或多聚核苷酸。
“目标核酸”是具有与用于检测核酸互补的碱基序列的核酸分子。
“核酸”指一种由嘌呤或嘧啶碱与糖之间的配糖键产生的核苷磷酸酯聚合物(核苷链)，且广泛地包括寡聚核苷酸和多聚核苷酸，该多聚核苷酸包括DNA探针、通过聚合嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸得到的DNA(其全长或片断)、通过反转录获得的cDNA(cDNA探针)、RNA、聚酰胺核苷衍生物(PNA)等。
“杂交(Hybridization)”指用于在互补碱基序列结构之间形成互补链(双链)的反应。“错配杂交(Mis-hybridization)”指形成互补链的非正常的反应的。
“反应区域”是可提供用于互相反应如杂交等的反应区域的区域，且包括具有例如可存储液相或凝胶的很好形状反应区域。在反应区域中发生的相互反应不仅仅限于本发明所达到的目的和效果。例如，有可能不仅影响单链核酸之间相互反应即杂交，还影响钛(或蛋白质)和从用于检测的核酸形成的所希望的双链核酸之间的相互反应，酶应答反应和其它分子间的相互反应。当使用例如双链核酸时，有可能分析例如在作为转录因子的受体分子如激素受体等和应答元件DNA序列之间的键合。
“相对电极”指设置的至少一对电极以使电极的表面彼此相对。另外，“相对轴”指连接两个彼此相对电极表面中心的直线形成的轴。
“凹陷部分”是指在电极或用于涂覆电极的绝缘层的表面中显微组构形成的凹陷部分，或在表面上形成的突起部分之间的凹部，和指电场集中的部分。
“介电泳”是在不均匀的电场中分子被驱动到较强电场的现象。由于极化极性通过施加电压的极性反向(见Teru Hayashi(作者)，“Micromachinesand Materials Engineering(由CMC公开)”的“Manipulation of Cellsand DNA”，37至46页，第5部分)而反向，所以即使当施加交流电压时，也可以获得与在直流电压的情况下相同的驱动效应。
“DNA”芯片指一种用于杂交检测的基片，其中在基片上DNA探针等用于检测的核酸以自由状态或固定状态精密地设置，且包括DNA微阵列的概念。
根据本发明，能够有效率地集成(固定)基因信息，且在短时间内使得有效率地制作杂交进程。
图1是根据本发明的杂交检测装置的第一实施方案(1a)的主体部分结构的截面图；图2显示用于检测装置(1a)的提供介质装置和光学检波装置的结构的概略图；图3是检测装置(1a)中电极(E1或E2)表面的外形和结构的例子的放大图；图4是在电极(E1或E2)表面上形成的凹陷部分的例子的放大图；图5是在检测装置(1a)中电极表面部分的另一种外形和结构的例子的放大图；图6显示电极表面部分的改进的图；图7显示电极表面部分的另一改进的图；图8显示电极表面部分的另一改进的图；图9显示电极表面部分的另一改进的图；图10是概略地显示在凹陷部分(3)中形成的电场状态的图(沿着图4中的I-I线看的截面图)；图11是概略地显示了在凹陷部分(31)中形成的电场状态的图；图12是概略地显示了在凹陷部分(32)中形成的电场状态的图；图13是根据本发明的检测装置第二实施方案(1b)的主体部分结构的截面图；图14是根据本发明的检测装置第三实施方案(1c)的主体部分的结构的截面图(附加了沿着图中的II-II线看的截面图)；图15显示检测装置(1c)的改进的电极外形的图；图16显示根据本发明的DNA芯片(10)的优选实施方案的实施例的图；图17显示凹陷的和突出表面的电场强度分布的图(绘制代替曲线)；图18显示具有凹陷和突出的电极表面的电场强度梯度分布的图(绘制代替曲线)；优选实施方案详述以下将参考附图描述本发明的优选实施方案。顺便提及，附图中示出的每个实施方案表示本发明的典型实施方案的一个实施例，并且并不解释为缩小本发明的范围。
图1是根据本发明的杂交检测装置(以下缩写为“检测装置”)的第一实施方案的主体部分结构的截面图。图2显示用于检测装置1的介质提供装置和光学检波装置结构的概略图。
在图1中标记1a表示检测装置的主体部分的构成。根据本发明的实施方案的DNA芯片可通过在基片上形成或设置检测装置la而获得。
检测装置1a包括下侧基片A和置于下侧基片A上的上侧基片B。下侧基片A包括基材料层11，层叠于基础材料层11上的导电层12，层叠于导电层12上的绝缘层13，和层叠于绝缘层13上且具有通过预定表面处理形成的很好成形的反应区域2的表面层14。上侧基片B包括下侧绝缘层15，层叠在绝缘层15上的导电层16，和层叠在导电层16上的顶层17。
下侧基片A的基础材料层11可由类似于如CD(光盘)、DVD(数字通用唱片)、MD(小型盘)等的光学信息记录介质的基础材料形成。根据本发明实施方案的基片的形状并不具体限定。例如，该基片可随意地形成为四边形或圆盘形。
基础材料层11用石英玻璃、硅、或如聚碳酸酯、聚苯乙烯等的人造树脂，优选能够被注模的人造树脂模制成希望的形状。与传统地使用的玻璃芯片相比可通过使用不昂贵的人造树脂来模制基片以达到低操作成本。
导电层12希望由能够传送用于杂交检测(见图2)的具有预定波长的激发光P的透光人造树脂形成。例如，导电层12希望由铝或ITO(氧化铟锡)作为具有透光性的导体形成。绝缘层13由无机物质如SiO2、SiC、SiN、SiOC、SiOF、TiO2等形成。顺便提及，绝缘层13(和绝缘层15)用于防止例如可在反应区域2中残留的离子介质的电化学反应。
如图2中所示，下侧基片A的如此结构能通过利用从基片A(基础材料层11)的下侧(背面侧)发射的激发光P照射，而在反应区域2中进行杂交检测。
特别地，基片背面侧的激发光P使得能够通过设置在基片下侧(背面侧)的光学系统器件组(见图2)，检测从在反应区域2中处于杂交状态有荧光标记的目标核酸发出的荧光F，或从插入并结合到形成互补链的碱基对的荧光嵌入剂(nuorescent intercalator)发出的荧光F。
例如，作为信息读取光的激发光P是从图中未示出的激光二极管发出的，通过图中未示出的准直透镜转换为准直光，然后前进并进入设置在将被聚焦的基片下方的聚光透镜L1。图2概略显示了用于聚焦荧光F的聚光透镜，该透镜以标记L2表示，和检测荧光F的检测器，该检测器以标记U表示。
假定设计使对于检验和检测必要的器件组设置在检测装置1a或具有检测装置1a的DNA芯片的周围，包括用于滴下或注入样品溶液的喷嘴N的器件组可设置在位于检测装置1a之上的主体区域中，且用于检测(读出)的光学器件组可设置在位于检测装置1a下方的全体区域中。结果，可使得器件组作为一个紧凑的整体。
形成下侧基片A的表面层14可由例如感光聚酰亚胺树脂形成。该感光聚酰亚胺树脂经受使用光致抗蚀剂的表面处理以形成微小反应区域2。
然而并不具体限定反应区域2的形状和尺寸，反应区域2的长度、宽度和深度每个都是几μm至几百μm。该尺寸值可根据激发光的斑直径和介质M如样品溶液(包括用于检测的核酸溶液或包括目标核酸的溶液)等的最小可滴落的量确定。
顺便提及，介质M通过经由喷嘴N(例如喷墨喷嘴)从形成在上侧基片B且与反应区域2联系的孔21(或22)滴落其预定的数量来提供。进一步，根据使用毛细现象或对介质M的亲合力的原理，可将介质M引进到反应区域2中。
将检测装置1a中的导电层12(下侧基片A的)和导电层16(上侧基片B的)设置在下侧和上侧，以使反应区域2插入到导电层12和导电层16之间(见图1和图2)。导电层12和导电层16用作相对电极E1-E2，该电极通过开关S的开/关操作经过电源G向保存或残留在反应区域2中的介质M施加希望的电场。顺便提及，相对电极E1-E2允许电场强度、交流或直流、或高频电场或低频电场的(对于以下将描述的其它的相对电极同样是正确的)的自由选择是理想的。
相对电极E1-E2起到用于将在介质M中存在的核酸分子(用于检测的核酸或目标核酸)拉长(伸展)成为直链形式的作用，其通过施加高频交流电场，或更具体地通过由大约1×106V/m和大约100KHz至100MHz的电场条件下的正弦波获得的介电泳的电力作用移动核酸分子至电极表面电力线集中的部分，或移动或拉动核酸分子同时拉长(伸展)核酸分子。顺便提及，由于交流电场不产生由于电解产生的气泡，所以较直流电场更理想，这样对反应系统有较小影响。
杂交一般在以无规卷曲或混乱状态下卷曲的单链核酸分子之间进行。因此，当位阻等影响杂交时，互补结合的效率降低，且倾向于发生错配杂交。
然而，经由相对的电极E1-E2施加的电场可调节处于拉长(伸展)状态的核酸分子的高级结构，或将核酸分子移动到预定区域以增加核酸分子的结合(即，浓缩)的可能性。
在处于被施加电场的状态的杂交不受位阻影响，以致于杂交的效率和准确性可以显著增加。因此，有可能实现高速杂交并降低错配杂交。
顺便提及，“位阻”指一种现象，在该现象中因为在分子或反应分子的三元结构(高级结构)内的反应中心等附近的大体积取代基的出现，使得反应发生的其它分子很难接近反应分子，而使得所希望的反应(在这种情况下是杂交)不容易发生。
在本发明中，设计电极表面的外形或结构以更有效地获得上述的电力作用，以适合本发明的目的。更具体地，形成电极E1和E2的两个或一个电极表面以使凹陷部分3规则地设置在纳米级的间隔处。顺便提及，当通过把用于检测的核酸D如DNA探针固定在电极E1和E2上，在电极E1和E2上都形成凹陷部分3时，有可能在电极E1和E2上使得杂交改进，从而增加检测的荧光量。
以下将参考图3至9描述电极表面的优选实施方案。图3是检测装置中的电极表面的形状和结构的实施例的放大图。图4是在电极表面上形成的凹陷部分的实施例的放大图。图5是检测装置中电极表面部分的另一个形状和结构的实施例的放大图。图6至9显示形式和结构的改进的图组。
首先，如图3中所示，可向形成以面对反应区域2的与电极表面(E1或E2)对应的绝缘层13(或15)的部分提供具有如图4中所示的圆锥状(V-形截面)的连续凹陷部分3，例如在电极的整个表面之上，或者可以如在如图5中所示的绝缘层13(或15)的仅仅一部分中连续提供的凹陷部分3。
或者，可以使用如图6中所示的实施方案中的结构，其中预先在用作电极的层中形成凹陷部分3，即，导电层12(或16)本身，和用绝缘层13(或15)包被导电层12(或16)以使通过凹陷部分3形成的凹陷和突起的外形出现在表面上。这对于图7至9中所示的以下实施方案是正确的。
进一步，可能适当地采用例如如图7中所示的其中具有V-形截面的凹陷部分3以预定间隔形成的结构，如图8中所示的其中具有矩形截面的凹陷部分31以预定间隔形成的结构，或如图9中所示的其中具有U-形截面的凹陷部分32以预定间隔形成的结构。
顺便提及，在电极表面上形成凹陷部分3等的不平表面的处理方法可以通过使用公知的例如溅射淀积技术、外延淀积技术和蚀刻技术来进行。然而，并不具体限定方法本身。
如通过参考图10-12可以理解，电场显著地集中且因此在如上所述的凹陷部分3、31或32的底部、弯曲部等处的小空间部分内形成电场梯度(即形成不均匀电场)。
图10是概略显示在凹陷部分3内形成的电场状态的图(沿着图4中的I-I线看的截面图)。图11是概略示出在凹陷部分31中形成的电场状态的图。图12是概略显示在凹陷部分32中形成的电场状态的图。在图10至12中显示的标记Z表示概略描绘的电场强度的分布。
由电场梯度产生的驱动力作用于在核酸分子中产生的偶极子，借此核酸分子移动到凹陷部分3、31或32中(到其中电场集中的部分中)。当核酸分子为用于检测的核酸D时，核酸分子被拉到凹陷部分3等的表面，且此时通过预定化学键固定在拉长和对齐的状态中。
图10示出了在反应区域2中的处于自由状态的目标核酸分子T通过介电泳效应向用于检测且固定在凹陷部分3底部的并被电场拉长的核酸分子D移动。
通过有规律地在电极(E1或E2)表面上这样设置凹陷部分3(或31或32)，有可能消除用于检测的核酸如DNA探针等的集成密度(固定密度)中的偏差。进一步，由于在电极(E1或E2)表面上有规则地设置的凹陷部分3(或31或32)改进了杂交，所以可以使得在电极(E1或E2)表面上检测的杂交的量均匀。
顺便提及，可通过测量来自荧光物的荧光强度来检测杂交，通过荧光物标记目标核酸或具有特异性的发射荧光的荧光嵌入剂，该嵌入剂插入且结合到双链核酸的碱基对部分。该荧光嵌入剂可与目标核酸同时加入到反应区域2，或可在杂交进行之后加入。荧光嵌入剂的使用具有能够省略通过冲洗从反应区域2去除多余目标核酸的操作的优点。
图13是根据本发明的检测装置的第二实施方案的主体部分结构的截面图。
根据第二实施方案的检测装置1b的特征在于，形成相对电极中的一个(该情况下是E1)以具有比在另一侧上的电极(这种情况下是E2)更小的表面。
该结构使得电场(电力线)更集中且因此在具有更小表面区域(见图13中的标记Z)的电极E1处形成不均匀电场。因此核酸分子通过介电泳向电极E1移动。图13作为典型的实施例概略示出了其中用于检测的处于自由状态的核酸D移向电极E1的状态。
因此，在反应区域2中以自由状态广泛伸展的核酸分子可以集中在电极E1周围的区域中，借此核酸分子的浓度可以保持在高的水平。进一步，核酸分子可以随后移动到在电极E1表面上的每个凹陷部分3(31或32)中的电场更集中(其中存在电场强度梯度的部分)的局部部分。
图14是根据本发明的的检测装置的第三实施方案的主体部分的结构的截面图。在图14中，加入了在图中沿着II-II线看的截面图(见图14中的下面的图)。
根据第三实施方案的检测装置1c的特征在于相对电极E3-E4位于反应区域2的左侧和右侧。图15显示了检测装置的改进，其改进特征在于形成用作牵引核酸分子的电极的电极(该情况下为E3)以具有比另一个电极E4更小的表面区域。
如在上述的检测装置1b中，在图15中示出的该修改中，电场更集中且由此在具有更小表面区域的电极E3处形成不均匀的电场(见图15中的电力线Z)。因此在反应区域2中以自由状态散布的核酸分子(用于检测的核酸分子D或目标核酸T)通过介电泳移向电极E3。即，有可能在电极E3周围区域中增加核酸分子的浓度，且同样将核酸分子牵引到凹陷部分3(31或32)中。
顺便提及，尽管在图中未明确示出，设置在上侧和下侧的相对电极E1-E2和设置在左侧和右侧的相对电极E3-E4可以同时设置。在这种情况下，相对电极E1-E2可以用作施加高频电场以调节用于检测的核酸D的高级结构或提高杂交效率的装置，以及相对电极E3-E4可以用作用于施加电场以有力地去除妨碍杂交检测(例如多余的用于检测的核酸D、多余的目标核酸T、多余的嵌入剂等)的多余物质和从检测表面部分至另一区域的错配杂交产生的核酸分子。使用这样的电场去除操作是一种可以代替使用水溶液的冲洗去除操作的技术，其中冲洗去除操作是现在普遍使用的。
上述电极E1、E2、E3和E4(形成面对反应区域2的相对电极)的表面能用作用于固定用于检测的核酸D如DNA探针等的表面。
为了固定所希望的用于检测的核酸D如DNA探针等，例如可预先利用多聚赖氨酸溶液或含有氨基的硅烷偶联剂溶液的对电极表面进行了表面处理。当由人造树脂制成的基片经受表面处理时，在等离子体处理和DUV(DeepUV，远红外辐射)照射处理之后，用含有氨基的硅烷偶联剂溶液处理基片的表面。
另外，可将铜、银、铝或金喷射在电极表面上以形成膜，和表面层可用具有如氨基、硫醇基、羧基或类似物、半胱胺、抗生物素蛋白(如抗生蛋白链菌素)等的官能团(活性基)的物质包被。
用抗生物素蛋白进行表面处理的检测表面适用于固定近微生物素化DNA探针末端(biotinylated DNA probe terminal)。或者，利用硫醇(SH)基处理的检测表面适用于固定具有由硫醇基通过二硫键(-S-S键)修饰的末端的用于检测的核酸D如探针DNA等。
接下来将参考图16描述根据本发明的DNA芯片的优选实施方案的实施例。
图16中显示的DNA芯片10具有在具有类似于CD的圆盘形状的基片上在环绕方向，例如以螺旋的形式或者以辐射的方式，设置的上述的检测装置1a(或1b或1c)。可通过图中未示出的插入到中心孔10a中的载流夹具和基片中设置的引线，向每一个检测装置1a中提供的相对电极施加电场。
旋转DNA芯片10，当操作伺服系统时检测位置，且可以通过滴液等的方式从基片之上至预定反应区域2提供介质M。另外，杂交检测可以通过检测荧光来进行，该荧光通过利用激发光从基片下(基片的背面测)附着预定反应区域2而得到。
在杂交检测方法中，为了核实电极表面的外形以能够有效地把核酸分子通过介电泳现象拉到电极表面，进行了一个实验，计算电极表面附近的电场强度等。
在作为计算模型的检测装置中，ITO层(下电极)作为具有250nm厚度的导电层在玻璃基片上形成，并且SiO2层(具有150nm厚度且介电常数ε＝5)作为绝缘层形成在ITO层上。另外，在下电极(凹陷和突起形成的角度是90°)的表面形成具有±5至15nm的高度和深度的凹陷和突起。具有5μm厚度的聚酰亚胺树脂层叠在SiO2(二氧化硅)层上以形成好形状的反应区域2(尺寸100μm)。上电极(材料SiO2(100nm)/Al(100nm)/玻璃)位于反应区域2上方以覆盖反应区域2。
当1V的电压施加到作为计算模型的检测装置的上和下相对电极之间时，计算在电极表面的电场强度分布。在该实验中，当交流电场施加到电极之间时，在用于电场强度分布控制趋势的有限目的的计算中，认为电场是静电场。关于电场计算所需要的材料的介电常数，SiO2的介电常数是ε＝5，含有核酸分子(DNA)的缓冲溶液的介电常数是ε＝78，该溶液被认为基本上与水相同。
在电极表面的凹陷和突起附近的电场强度的分布的计算证明，与具有如图10中示出的电场梯度的上部区域相比，在凹陷底部电场强度是梯度增长的。另一方面，其证明在突起基部的电场强度高于在突起顶部的电场强度。即，证明了在从平坦部上升至突起部的部分形成了类似于凹陷部分的电场梯度。
图17和图18是凹陷和突起表面电场强度分布和电场强度梯度分布的图。在图17和图18中的横坐标轴表示在水平方向上从凹陷部分或突起部分的最大深度的距离(单位μm)。图17中的纵坐标轴表示电场强度(单位V/μm)。图18中的纵坐标轴表示电场强度梯度。在图17和图18中，P＝5、10和15nm，每个表示从突起部分的参考表面的高度位置，而p＝-5、-10和-15nm，每个表示从凹陷部分的参考表面的深度位置。
如图17中所示，可清楚地理解，在凹陷部分的底部的电场强度明显地最大化，且电场强度的值不取决于深度。从图18中也可以理解，电场强度梯度在凹陷部分的底部也最大化了。因此，由于介电泳力与电场强度梯度的面积成比例地增长，因此很显然，DNA的吸引力在凹陷部分的底部最大。
也应该理解，在通过介电泳力吸引DNA方面形成凹陷部分较形成突起部分有效。并且，由于电场强度和电场强度梯度并不取决于凹陷部分的深度，所以其足够形成具有对应于核酸分子的长度的几至几十nm深的凹陷部分，其中精确地检测核酸分子的杂交。
因此，作为电极表面，例如通过使用其中凹陷部分如上述的图3和图5至图9中所示规则设置的外形的形式，有可能在电极表面上以相等间隔集成(固定)核酸分子。从而减小了位阻等，并缩短了在电极表面上的杂交时间，且使得在电极表面上的检测量均匀。
当不施加电场时，完成杂交要花费大约四个小时或更多，但是当施加电场时在大约五分钟内获得了等于杂交完成时的荧光信号。即，能够得到高速杂交。
因此，认为通过在电极表面上的凹陷部分形成的不均匀电场在目标核酸上产生介电泳效应，以至于在电极表面区域中的目标核酸的浓度增长，其中DNA探针作为用于检测的核酸固定在该电极表面区域上，且因此加速了该杂交反应。
在杂交检测中，可使用嵌入剂和荧光物，也可使用分子信号，通过嵌入剂和荧光物标示目标核酸。
电极表面上的凹陷部分的深度和角度并不局限，根据被吸引(移动)的核酸分子的数量、种类和分子长度的基础上希望选择合适的值是理想的。并且，电场的密度和频率并不特别局限，根据核酸分子的种类、分子长度等的基础上选择合适的值是理想的。另外，波形不限为正弦波，可以是方波等。
本发明能使杂交检测在短时间内以高检测准确性进行。本发明对于检测在DNA芯片等上的杂交检测技术尤其有用。
本领域技术人员可以理解，在所附的权利要求或其等价物的范围内，依据设计需求和其它因素所作的各种改进、组合、再组合以及改变都在本发明的范围内。
权利要求
1.一种杂交检测装置，包括反应区域，用于提供用于检测的核酸和目标核酸之间杂交的区域；和设置的相对电极，以使可向反应区域中保存或残留的介质施加电场；其中所述相对电极中的至少一个电极表面具有凹陷部分。
2.如权利要求1中所述的杂交检测装置，其中所述凹陷部分是用于固定所述用于检测的核酸的部分。
3.如权利要求1中要求的杂交检测装置，其中用绝缘层包被所述相对电极。
4.如权利要求3中所述的杂交检测装置，其中所述的凹陷部分在所述的绝缘层中形成。
5.如权利要求1中所述的杂交检测装置，其中有规则地设置所述凹陷部分。
6.如权利要求1中所述的杂交检测装置，其中在上侧和下侧上设置所述相对电极，将所述反应区域插入到所述相对电极之间。
7.如权利要求6中所述的杂交检测装置，其中在所述相对电极中至少一个上形成所述凹陷部分。
8.如权利要求6中所述的杂交检测装置，其中至少下侧上的所述电极是传送预定波长的激发光的电极。
9.如权利要求1中所述的杂交检测装置，其中在右侧和左侧上设置所述相对电极，将所述的反应区域插入到所述的相对电极之间。
10.如权利要求1中所述的杂交检测装置，其中形成所述相对电极，以能够向所述介质施加高频交流电场。
11.一种DNA芯片，至少包括权利要求1中的杂交检测装置。
全文摘要
这里公开了一种杂交检测装置，包括用于提供在用于检测的核酸和目标核酸之间杂交的区域的反应区域，设置相对电极以使得可以向在反应区域中保存或残留的介质施加电场，其中相对电极中的至少一个电极表面具有凹陷区域。
文档编号G01N37/00GK1876834SQ20051011995
公开日2006年12月13日 申请日期2005年6月7日 优先权日2004年6月7日
发明者瀬川雄司, 平田达司郎 申请人:索尼株式会社