专利名称：肽的稳定的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及在生物学样品中，例如来自哺乳动物的血浆或血清样品中，稳定温度敏感型分析物，尤其是蛋白质和肽，包括激素和酶，免于降解的领域。
背景技术：
分析生物学样品，尤其是血清和血浆样品中的分析物时遭遇的一个问题涉及有些蛋白质和肽的稳定性差。小肽尤其对酶降解敏感。稳定性差要求马上测试样品，或者保存在低温环境中，诸如冰箱中。然而，即使在低温贮存下，稳定性常常还不够。如果需将这样的样品保存许多天，必须将它们包装在干冰中。这当然相当不方便。
胃泌素-17是由胃窦G细胞在受到刺激后分泌的肽激素。所述刺激是蛋白质丰富膳食后蛋白质分解的结果。胃的拉伸同样导致胃泌素，尤其是胃泌素-17的分泌。
胃泌素肽形成自一个胃泌素原分子。多数肽激素是通过使激素原进行蛋白水解切割和酶促修饰而合成的。胃泌素加工可分成三类胃泌素原、甘氨酸延伸的衍生物，和羧基酰胺化的胃泌素。可从人胃分离得到几种不同的生物学活性胃泌素形式，其中最重要的是胃泌素-34和胃泌素-17。另外，已经从血浆分离得到胃泌素-71，它是最大的有生物活性的胃泌素，以及胃泌素-52和胃泌素-14。胃泌素-17是最强的盐酸刺激物。胃泌素-17以两种形式存在，非磺化形式(胃泌素I)，和其中酪氨酸发生磺化的磺化形式(胃泌素II)。这两种形式同样有效。胃泌素-17的活性形式是酰胺化的胃泌素-17，其中肽的最后一个氨基酸苯丙氨酸含有额外的酰胺基团。非活性形式是所谓的甘氨酸延伸的胃泌素-17。
已知用于测定个体中胃粘膜状况的多种方法和试剂盒。基于这样的测量，有可能不需要个体在场就可以测定个体发生胃癌的风险。此种方法的实例在例如下列专利和专利申请中加以描述EP 804 737、EP 990 992、EP02716100、和本申请人的PCT/FI03/000653。
在这些方法中，通常从样品中，诸如来自个体的血清或血浆样品，测定至少下列分析物或标志物胃蛋白酶原I、胃泌素-17和幽门螺旋杆菌感染标志物，以及通常还有胃蛋白酶原II。
与所述测定方法和样品处理相关的，由于胃泌素-17在样品中迅速分解，胃泌素-17的稳定性差成为问题。三小时之后，血清样品中胃泌素-17的浓度开始明显下降，而且在冷藏条件下一天后，它完全降解。这与胃蛋白酶原I和II及幽门螺旋杆菌抗体相反，胃蛋白酶原I和II的活性在室温能保持许多天，幽门螺旋杆菌抗体在冰箱条件下至少保持三天。
胃泌素-17先前作为所谓的冷样品加以采集，即血清样品的凝固在冰浴上进行。样品的运送或分派(持续很多天)以冷冻的形式进行。
由于不仅是胃泌素型肽，同样还有许多其它蛋白质和肽，包括激素和酶，其稳定性不令人满意所带来的问题，人们已经在努力寻找稳定这些敏感分析物的手段。对于令人满意的稳定性以用于可令人接受的实验室操作，最低要求是在室温或环境温度，和冰箱温度下，即约+4℃至25℃的温度范围内，至少稳定三天。
发明概述依照本发明，现在已经发现二甲基亚砜(DMSO)是哺乳动物生物学样品中，尤其是血清或血浆样品中，蛋白质和肽，尤其是胃泌素和胃泌素相关肽的非常有效的稳定剂，为所述蛋白质和肽提供稳定效果，该稳定效果在环境温度和冰箱温度下都持续至少三天。
因此，本发明一方面涉及DMSO用于在哺乳动物生物学样品，诸如血清或血浆样品中稳定胃泌素和胃泌素相关肽免于降解或失活的用途。另一方面，本发明还涉及在哺乳动物生物学样品，诸如血清或血浆样品中稳定此类肽免于降解或失活的方法，依照此方法向含有所述待稳定肽的样品中加入稳定量的DMSO。
发明详述依照本发明使用的稳定剂是有机溶剂二甲基亚砜，DMSO；其已知用于多种工业、医学和实验室用途。DMSO的分子量是78.1，它与水互溶，熔点18.5℃，沸点189℃。它是造纸工业的副产品，其中它衍生自树木中的粘合物质木质素。
在细胞培养中，在冷冻细胞时常规使用DMSO的10％溶液。在这种应用中，DMSO作为降低渗透损伤的保护剂，因为细胞对细胞内冰形成非常敏感。DMSO迅速穿透细胞膜并取代其中的水。因此，DMSO同样迅速穿透皮肤，并能够容易地将其中溶解的成分，诸如低分子成分，转运过皮肤。为此，DMSO用作佐剂，以促进药物分子吸收和转运。还有报道说DMSO具有广泛的药理学应用，包括减轻疼痛和肿胀、松弛肌肉、抗炎和抑菌特性等。
依照本发明，DMSO设想用于稳定温度敏感型肽，即胃泌素和胃泌素相关肽，其在生物学样品中在几天，诸如三天的一段时间里易受快速分解的影响，甚至当被保存于冷藏条件时。
本发明尤其可用于稳定胃泌素和胃泌素相关肽，诸如缩胆囊素和促胰液素，且尤其用于稳定胃泌素-17。本发明尤其适用于下述方法，如在用于筛选胃粘膜状况的测试法中，其中胃泌素-17将与来自生物学样品，诸如血清、血浆样品的分析物胃蛋白酶原I和任选的胃蛋白酶原II，以及幽门螺旋杆菌的标志物一起测定。
在实验过程中，证明了向此类样品中加入DMSO对胃泌素发挥稳定效果，同时对待化验的其它标志物没有不良影响。
用于获得稳定效果的DMSO的量可有所变化，但是通常是1-10％(体积/体积)的数量级，尤其是约4-6％(体积/体积)，根据待测样品计算。
在本发明的内容中，与哺乳动物生物学样品中的分析物肽相联系的“温度敏感的”，是指所述肽倾向于快速降解，尤其是在室温或环境温度下。依照本发明，将要被稳定的温度敏感分析物，是指在室温或环境温度，通常是约+18至25℃的温度范围，保存时间少于三天(72小时)的分析物。
依照本发明，加入到待稳定的哺乳动物生物学样品中的DMSO的量为分析物肽提供稳定性，所述稳定性为在上述温度范围至少三天(至少72小时)的稳定性。
实验在研究过程中进行的实验显示，即使在室温下，胃泌素-17在5％(体积/体积)DMSO/血清或血浆溶液中保持至少三天，所述研究是关于胃泌素-17在血浆和血清样品中稳定性的研究。这可从下表中呈现的测试结果中看出来。
表1描述了通过向所述样品中加入5％(体积/体积)DMSO，在长达三天的一段时间里，对三种EDTA-血浆样品测试胃泌素-17稳定性的测试的结果。参照实施例未添加DMSO。结果显示，与不含DMSO的样品相比，含有DMSO的样品中，三天后胃泌素-17的稳定性有所改善。
表2显示了在室温下向五种EDTA-血浆样品中加入DMSO的稳定效果。测试了添加DMSO对胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽门螺旋杆菌抗体和胃泌素-17的效果。显示了第0天和第3天的结果。结果显示，对胃蛋白酶原I和II以及幽门螺旋杆菌抗体的活性基本上没有影响，而与获自未添加DMSO的样品的结果相比，观察到胃泌素-17的稳定性有所改善。
表3是对应于表2中的测试的测试，只是其中所要测试的十种样品是血清样品，而不是血浆样品。结果显示添加5％(体积/体积)DMSO的样品中胃泌素-17普遍保留活性。结果还显示DMSO对胃蛋白酶原和幽门螺旋杆菌抗体的活性没有有害作用。
表4显示了样品的稳定性测试结果，其中分析物是U-INTP(胶原I氨基末端端肽)。该表显示了室温下，即刻(“即刻”)、以及三天后，不添加和添加稳定剂的结果，也用百分比表示。每份样品进行两次平行测试。
表1
表2
表3
表权利要求
1.DMSO用于在哺乳动物生物学样品中稳定胃泌素和胃泌素相关肽免于降解的用途。
2.依照权利要求1的用途，其中所述样品是血清或血浆样品。
3.依照权利要求1或2的用途，用于稳定胃泌素-17。
4.用于在哺乳动物生物学样品中稳定胃泌素和胃泌素相关肽免于降解的方法，依照所述方法将稳定量的DMSO加入所述样品。
5.依照权利要求4的方法，其中所述样品是血清或血浆样品。
6.依照权利要求4或5的方法，用于稳定胃泌素-17。
7.依照权利要求6的方法，其中在含有选自胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II和幽门螺旋杆菌抗体的一种或多种分析物的血清或血浆样品中测定胃泌素-17。
全文摘要
本发明涉及DMSO用于在哺乳动物生物学样品，诸如血清或血浆样品中稳定温度敏感型肽，即胃泌素和胃泌素相关肽，免于降解的用途。
文档编号G01N33/68GK1950398SQ200580014974
公开日2007年4月18日 申请日期2005年5月9日 优先权日2004年5月10日
发明者奥斯摩·索瓦尼米, 奥利·林纳拉 申请人:拜奥希特公司