专利名称：孢子特异性抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及孢子特异性的抗体。本发明提供该抗体相关的组合物与方法以及产生它们的杂交瘤。与细胞的营养形式相比，本发明的抗体对炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)孢子具有相对特异性。与其它芽孢杆菌孢子和细胞相比，这些抗体也(只)对(炭疽芽孢杆菌)孢子具有相对特异性。采用本文提供的方法可用这些抗体检测是否存在炭疽芽孢杆菌孢子。本发明还涉及可用于本发明检测方法中含有这些抗体的制品以及试剂盒。
背景技术：
炭疽芽孢杆菌(炭疽的致病因子)是一种能形成孢子、革兰阳性、不溶血杆状细菌。炭疽主要是食草动物的人兽互通病；然而，人类通过与受感染的食草动物接触直接获得此病，或者通过它们的产物，例如毛发、羊毛和皮革间接获得此病。孢子是常见的感染形式。取决于感染途径，炭疽在临床上存在三种不同的综合征皮肤、胃肠和吸入性疾病。皮肤炭疽是人类最常见的天然形式。然而，虽然只是在天然获得性感染中罕见到吸入性炭疽，但它是涉及气雾化孢子排放情形中最令人关注的。1979年前在苏联Sverdlovsk，气雾化孢子的意外排放(Meselson等，1994)和2001年10月在美国，遭受炭疽信袭击中气雾化孢子的有意排放(Jernigan等，2001)证明了这一点。在接触(孢子)24-48小时内给予合适的抗生素可缓解吸入性炭疽的高死亡率。然而，在接触(孢子)超过24-48小时后给予抗生素通常导致接受致死剂量孢子的个体死亡。
炭疽芽孢杆菌的孢子外被膜和外壁曾是研究的焦点。当炭疽芽孢杆菌营养细胞的基本营养物质耗尽时(“饥饿”)，触发其开始合成内生孢子(“孢子”)。当营养细胞饥饿时依次发生以下情况1)饥饿的营养细胞发生不对称分离，形成母细胞和前孢子；2)母细胞吞食前孢子，用相对的两层细胞膜围绕前孢子；3)在两层细胞膜之间合成一厚层修饰的肽聚糖(“皮质”)；和4)母细胞中合成的蛋白质形成包被皮质的多层孢子外被膜。
孢子外被膜形成一些种类的芽孢杆菌，例如枯草芽胞杆菌(B.subtilis)孢子的最外层。然而，在其它种类，例如炭疽芽孢杆菌中，孢子由称为外壁的额外一层所包围，这是一种含有蛋白质、脂质和碳水化合物的松散球状层。Charlton等(“蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)外壁的特征鉴定”(Characterization of theexosporium of Bacillus cereus)，J.App.Microbiol.，87241-245，1999)描述了对蜡状芽孢杆菌的外壁的研究。关系密切的苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)的孢子也有外壁。许多学者曾鉴定了炭疽芽孢杆菌的孢子外被膜和外壁抗原。Lai等(“枯草芽胞杆菌和炭疽芽孢杆菌的孢子外被膜的蛋白质组学分析”(Proteomic analysis of the spore coats of Bacillus subtilis andBacillus anthracis)，J.Bact.，185(4)1443-1454，2003)采用SDS-PAGE分离和2-维电泳分离相联合的蛋白质组学分析，然后用衬质辅助激光解吸与电离-飞行时间(MALDI-TOF)鉴定到38种枯草芽胞杆菌的孢子蛋白(其中12种是已知的孢子外被膜蛋白)和11种炭疽芽孢杆菌的孢子蛋白(其中6种鉴定为候选外被膜或外壁蛋白)。Lai等从他们比较枯草芽胞杆菌和炭疽芽孢杆菌孢子蛋白的研究中得出结论“枯草芽胞杆菌和炭疽芽孢杆菌外被膜具有大致相似数量的蛋白质，此二种微生物之间共有一组核心的外被膜蛋白质种类，包括主要的形态发生蛋白”。然而，对每种细菌而言，外被膜蛋白的数量显然可能是独特的(加了下划线；参见Lai等的摘要)。
Steichen等(“鉴定炭疽芽孢杆菌外壁的免疫优势蛋白质和其它蛋白质”(Identification of the immunodominant protein and other proteins of theBacillus anthracis exosporium)，J.Bact，185(6)1903-1910，2003)在纯化的炭疽芽孢杆菌外壁中鉴定到5种主要的蛋白质，包括胶原样糖蛋白Bc1A，他们将该蛋白描述为外壁毛发样绒毛的结构组分。这些学者得出结论Bc1A是炭疽芽孢杆菌孢子表面的免疫优势抗原，因为针对孢子或纯化的外壁所产生的20种单克隆抗体中有12种能与Bc1A反应。Steichen等鉴定的另四种蛋白质是丙氨酸销旋酶、过氧化物岐化酶与和其它蛋白质明显不相似的称为BxpA和BxpB的两种蛋白质。
此外，Todd等(“蜡状芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌编码外壁蛋白质的基因”(Genes of Bacillus cereus and Bacillus anthracis encoding proteins of theexosporium)，J.Bact.，185(11)3373-3378，2003)评估了蜡状芽孢杆菌的外壁蛋白质。蜡状芽孢杆菌是蜡状芽孢杆菌家族的一员，该家族包括苏云金芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌，它们均具有外壁而且是近亲。其它相关的芽孢杆菌包括枯草芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌(B.globigii)、短小芽孢杆菌(B.pumilis)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。Todd等鉴定了10株蜡状芽孢杆菌的外壁蛋白。根据蜡状芽孢杆菌蛋白质序列与从炭疽芽孢杆菌基因组序列预测的蛋白质序列的比较分析，他们得出结论“从可得到的但尚未完成的序列看，蜡状芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌之间的大多数新Exs蛋白是紧密保守的，但有两个例外，即炭疽芽孢杆菌可能不表达ExsB的一个局部区域和整个ExsC蛋白”(参见第3378页，整个第一段)。他们还指出他们“鉴定到的基因绝非代表了所有的外壁蛋白质组分；三分之一的蛋白质留在不可溶组分中，17个条带的7个未产生清晰的N-末端数据”(参见第3378页，整个第四段)。
在有关炭疽芽孢杆菌的孢子外被膜或外壁蛋白的文献中，所开发的唯一单克隆抗体针对炭疽的免疫优势芽孢杆菌胶原样蛋白质，Bc1A(参见，Sylvestre等，“胶原样表面糖蛋白是炭疽芽孢杆菌外壁的结构组分”(A collagen-likesurface glycoprotein is a structural component of the Bacillus anthracisexosporium)，Molec.Microbiol.，45(1)169-178，2002；和Steichen等)。本文所述的本发明孢子特异性单克隆抗体不与此蛋白质反应。Longchamp等(“炭疽芽孢杆菌孢子抗体的分子识别特异性”(Molecular recognitionspecificity of Bacillus anthracis spore antibodies)，J.App.Microbiol.，87246-249，1999)描述了能识别与相关种类芽孢杆菌起交叉反应的广泛孢子表面表位的多克隆血清的特征。他们还描述了两种不与孢子表面表位反应的单克隆抗体。Lee等(WO 01/49823)描述了针对炭疽芽孢杆菌表面阵列蛋白的抗体，而下文所述的本发明23a-14G9单克隆抗体不与此蛋白反应。
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发明概述本发明涉及与炭疽芽孢杆菌的营养或活跃生长形式以及相关种类芽孢杆菌相比，对炭疽芽孢杆菌孢子具有特异性的单克隆抗体或多克隆抗体。这些抗体可以精确和特异的方式优选用于快速检测和鉴定炭疽芽孢杆菌的方法、工艺、试验或检验中。
第一方面，本发明提供能与炭疽芽孢杆菌孢子特异性抗原相结合，鉴定为23a-14G9的小鼠单克隆抗体。与细胞的营养形式相比，此抗体对炭疽芽孢杆菌的孢子具有相对特异性。与其它芽孢杆菌孢子和细胞相比，这些抗体也对孢子具有相对特异性。
本发明也提供单克隆抗体的其它形式，包括但不限于该抗体的能与炭疽芽孢杆菌的孢子相结合的结合片段以及该抗体的杂合、嵌合、改变的、重组或人源化形式。抗体片段的非限制性例子包括二价F(ab′)2片段，例如用胃蛋白酶消化所产生的那些片段和单价Fab片段，例如用木瓜蛋白酶消化所产生的那些片段。
第二方面，本发明提供能与23a-14G9所识别的相同孢子特异性抗原相结合的其它单克隆和多克隆抗体。可用本领域已知的常规方法制备这些其它抗体而无需了解孢子特异性抗原的身份。一种方式是采用含有孢子特异性抗原和与23a-14G9形成复合物作为免疫原来制备其它抗体。这些原始抗体可用于制备表达各单克隆抗体的杂交瘤细胞。然后可筛选或选择杂交瘤中经鉴定表达能结合/识别孢子特异性抗原而不是23a-14G9的单克隆抗体的那些杂交瘤。所鉴定的抗体应对孢子特异性抗原具有特异性，它们可以和本文所述23a-14G9相同的方式使用或应用。也可单独用所鉴定的抗体与孢子特异性抗原形成的其它复合物来产生其它抗体，然后再筛选或选择这些抗体中对该抗原而非复合物中所用抗体的特异性抗体。
另一方面，本发明也提供含有单克隆和多克隆抗体以及它们的其它形式的组合物。这些组合物包括含有一种或多种抗体和它们的其它形式的制品以及试剂盒。这些组合物还可含有检测炭疽芽孢杆菌或其它芽孢杆菌种的一种或多种其它试剂。所述制品的非限制性例子包括检验装置，如检测炭疽芽孢杆菌的板、碟和孔。本发明的试剂盒包括含有用于检测炭疽芽孢杆菌的其它试剂的那些(试剂盒)。非限制性例子包括适合用于本发明检测方法的那些(制品)。
在还有另一方面，本发明提供利用本文所述抗体和它们的其它形式来检测是否存在炭疽芽孢杆菌孢子的方法。本发明方法不限于形式或构思。这些方法可定量或定性检测炭疽芽孢杆菌。本发明的一示范性实施方案提供检测样品中，例如取自某对象的医学材料样品(包括该对象的皮肤或衣物)中是否存在炭疽芽孢杆菌孢子的方法。或者，所述样品可以是环境样品，例如土壤或空气样品，或怀疑含有孢子的材料样品，例如可疑的粉末。该方法包括检测本发明抗体或其其它形式与所述样品的组分结合所形成的结合复合物。所述抗体或其其它形式与所述组分(与该抗体结合的炭疽芽孢杆菌抗原)接触将导致结合。
本发明还提供能产生23a-14G9抗体的杂交瘤细胞。细胞由ATCC于2004年5月19日保藏，ATCC登录号为PTA-6004。可在体外培养该杂交瘤以产生抗体，经任选纯化或分离步骤后可如本文所述使用。或者，可将杂交瘤注入动物体内产生腹水，进而获得抗体液。得到的抗体经任选的纯化或分离步骤后可如本文所述使用。
附图简述
图1显示与营养细胞相比，23a-14G9在捕获ELISA测定中对炭疽芽孢杆菌孢子具有相对特异性。
图2显示与其它芽孢杆菌孢子相比，23a-14G9对炭疽芽孢杆菌孢子具有相对特异性。
图3显示23a-14G9对苏云金芽孢杆菌的一种分离物(亚种.Kurstaki ATCC33679)的孢子具有部分交叉反应性。用23a-14G9检测炭疽芽孢杆菌时所产生的信号一般至少是Kurstaki分离物的两倍。
图4说明产生本发明抗体的方法。A部分显示利用23a-14G9抗体和孢子特异性抗原(SSA)的复合物免疫动物。然后动物产生了如本文所述的本发明抗体。代表性抗体包括能与23a-14G9和SSA某确定区域结合的Ab1，能与23a-14G9不结合的SSA的第一部分结合的Ab2，能与23a-14G9不结合的SSA的第二部分结合的Ab3。B部分显示将含Ab3和SSA的复合物作为免疫原注入动物体内产生本发明的其它抗体。代表性的抗体包括在没有23a-14G9抗体时能与可得到的SSA某区域结合的Ab4；以及与Ab1相同，能与SSA一部分结合的Ab5。如B部分所示的方法当然也可能产生23a-14G9抗体或产生能结合23a-14G9同样表位的另一种抗体。
本发明实施方式详述本发明涉及能结合与识别炭疽芽孢杆菌孢子特异性抗原的抗体。本发明的抗体包括能识别孢子特异性抗原而不识别炭疽芽孢杆菌孢子中存在的其它炭疽芽孢杆菌抗原的多克隆和单克隆抗体。这些抗体也能识别结合该抗原的其它抗体所识别的抗原。本发明也提供含有与孢子特异性抗原相结合的抗体的复合物。该复合物可以如本文所述分离或固定。
本发明也提供与炭疽芽孢杆菌细胞的营养形式相比，对炭疽芽孢杆菌孢子具有相对特异性，鉴定为23a-14G9的小鼠单克隆抗体。因此，可用该抗体及其与炭疽芽孢杆菌抗原的结合形式来区分性检测炭疽芽孢杆菌孢子和营养细胞。与苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌的孢子相比，该抗体对炭疽芽孢杆菌的孢子具有相对特异性。因此，本发明也利用该抗体及其其它形式来区分性检测炭疽芽孢杆菌孢子和其它芽孢杆菌孢子。
也检验了23a-14G9抗体对全世界不同地理区域(美国、加拿大、中国、德国、南非、英国、巴西、土耳其、澳大利亚和纳米比亚)的12种毒性炭疽芽孢杆菌分离物孢子的作用。这些分离物源自人或动物，列于表1。所有毒性孢子制备物利用23a-14G9作为检测抗体，家兔多克隆抗-炭疽芽孢杆菌IgG作为捕获抗体检验呈强烈阳性反应。
表1
本发明的单克隆抗体可称为对炭疽芽孢杆菌孢子具有“特异性”或“特异免疫反应性”。这些术语指该抗体在结合反应中能与炭疽芽孢杆菌孢子，或者这些孢子中发现的同源抗原反应。该反应可测定其它蛋白质、孢子或细胞中是否存在炭疽芽孢杆菌孢子或其含量。在技术人员所需的试验条件下(包括本文所述的非限制性条件)，该抗体择优与炭疽芽孢杆菌孢子，或在该孢子中发现的同源抗原相结合，而不以显著或可检测的方式与样品中其它因子相结合。本发明优选实施方案中所采用的条件应使该抗体或其其它形式选择性结合，所产生的信号是背景信号或噪声的至少两倍、优选至少10倍到100倍。所述背景信号或噪声包括与其它孢子，例如苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种孢子低水平交叉反应所产生的信号。
在其它实施方案中，本发明提供能识别或结合23a-14G9抗体所结合的炭疽芽孢杆菌孢子特异性抗原的抗体。就一些抗体而言，这种结合可以是该抗原特异性的。而其它抗体可与23a-14G9抗体所结合的孢子特异性抗原复合物中存在的某表位相结合。或者，这些抗体可以只与23a-14G9抗体相结合，但是当然不能根据它们能与孢子特异性抗原相结合而使用，而是根据它们能检测出结合的23a-14G9抗体而使用。因此，这种23a-14G9结合性抗体可用作结合23a-14G9的二抗来检测是否存在23a-14G9，例如检测具有其同源炭疽芽孢杆菌孢子特异性抗原的复合物中是否存在23a-14G9。
采用本领域已知的方法不难制备本发明其它形式的孢子特异性抗原结合抗体和IgG类的23a-14G9单克隆抗体。(本领域)熟知能制备抗体的抗原结合片段，并可为本文所述应用产生二价F(ab′)2和单价Fab片段。本文所用的“Fab”指至少含有功能性完整的轻链和重链可变结构域的抗体双链结合片段。此外，本领域也已知产生杂合。嵌合。改变、重组(包括单链)或人源化形式抗体的方法。可认为这些抗体形式是本文所述单克隆抗体的衍生物。
其它衍生形式包括与其它化学部分偶联的本发明抗体及其其它形式。非限制性例子包括标记的抗体或其其它形式。术语“标记”、“可检测标记”或“用可检测标志来标记”指能产生表明存在该标记分子的可检测信号的抗体组合物。合适的标记包括放射性同位素、染料、胶体金或类似的可检测标志、核苷酸生色团、酶、底物、荧光分子、化学发光成分、磁性颗粒、生物发光成分等，包括适合于间接检测的标记，例如生物素。例如，标记物是可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的任何组合物。可利用化学接头连接标记物。示范性标记是能产生可目测检测的可见信号的标记。
也可通过已知的方法和装置使本发明抗体及其其它形式与固相支持物相偶联，例如但不限于玻璃、塑料、合成膜相偶联。其它非限制性例子包括珠、颗粒、浸渍片、纤维、滤膜、培养皿、ELISA(酶联免疫吸附测定)板、微滴定板、硅烷或硅酸盐支持物，例如载玻片和碟、孔或容器以及它们的侧壁。抗体的这种固定形式可用于本文所述的检测方法中。它们也可用于炭疽芽孢杆菌蛋白质或孢子的免疫亲和层析。
本发明抗体及其其它形式也可配制成组合物。这些组合物还可含有检测炭疽芽孢杆菌或其它种类芽孢杆菌的一种或多种其它试剂。非限制性例子包括抗体与其同源炭疽芽孢杆菌孢子特异性抗原相结合的复合物，与该抗体和用于抗体检测方法中其它试剂的混合物。其它例子包括含有其它炭疽芽孢杆菌结合抗体或检测试剂的混合物。该抗体及其其它形式和其它检测试剂的组合也可构成用于检测炭疽芽孢杆菌的制品，例如检验装置的一部分。
用于检测是否存在炭疽芽孢杆菌的方法不受构思的限制。非限制性例子包括利用本文所述的本发明抗体和它们的其它形式，基于以下原理的方法Western印迹或其它免疫印迹、ELISA、侧流装置(lateral flow devices)、夹心试验、显微镜观察、竞争性和非竞争性免疫测定、免疫酶试验、免疫荧光法、免疫磁性选择和流式细胞术(包括通过多种颜色色流式细胞术(polychromatic flow cytometry)检测)。其它免疫测定形式描述于Harlow和Lane，(1988)，《抗体，实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Publications，New York。本发明方法可用于定性或定量检测样品或“测试样品”中是否存在炭疽芽孢杆菌孢子。
本文所用“样品”或“测试样品”指从感染或怀疑感染了炭疽芽孢杆菌孢子的个体分离的样品，或怀疑含有炭疽芽孢杆菌孢子的环境样品。或者，这些术语指已知含有炭疽芽孢杆菌孢子，在本发明的检测方法中用作对照或用于所述检测方法中以证实存在炭疽芽孢杆菌孢子或定量测定其含量的样品。可通过任何合适的方法收集样品，包括收集动物或人外层皮肤或头发以及衣物的样品；收集环境样品，如从空气、纸张、土壤或其它固体的样品，例如从怀疑含有炭疽芽孢杆菌孢子的部位取样。医学样品也包括收集对象体表，包括但不限于收集鼻腔和口腔的样品或擦拭液。其它样品形式包括水或食物样品。样品也可以是怀疑含有炭疽芽孢杆菌孢子的粉末或颗粒状物质。本发明的样品也可以是炭疽芽孢杆菌孢子的提取物或含有孢子或怀疑含有炭疽芽孢杆菌孢子的物质的提取物。在本发明的一些实施方案中，在测定之前可用样品稀释剂稀释样品。稀释剂可以是技术人员所需的任何合适溶剂。
对于空气或气体样品，非限制性的例子是用气旋收集装置收集的样品。这种装置收集一定体积的空气或气体，将其中所含的颗粒物沉积到潮湿的表面上或液体介质中。
在一个实施方案中，本发明提供的检测方法根据利用能与炭疽芽孢杆菌孢子相结合并与其形成复合物的捕获试剂。捕获试剂可以是本文所述的单克隆抗体或其其它形式。或者，试剂可以是能与炭疽芽孢杆菌孢子相结合的另一种抗体，包括但不限于能与多种芽孢杆菌的孢子和细胞结合的多克隆或重组抗体。在另一实施方案中，该捕获试剂至少能与除炭疽芽孢杆菌以外的苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌和巨大芽孢杆菌的孢子结合。如在本发明抗体(部分)所述的，可将该捕获试剂固定于固相支持物，然后与炭疽芽孢杆菌孢子接触。该试剂无需与本发明23a-14G9抗体所结合的同一表位结合。当然，可与孢子(或孢子特异性抗原)和孢子特异性抗体形成的复合物，而非只与抗体结合的捕获捉试剂也可用于实施本发明。
无论是否与捕获试剂联用，本发明也提供能与炭疽芽孢杆菌孢子结合从而直接或间接显示它们的存在或含量的检测试剂。检测试剂优选能与23a-14G9所结合的孢子特异性抗原相结合的本发明抗体或其其它形式。结合时，该检测试剂与其结合伴侣形成结合复合物。该检测试剂可以用可检测标记物标记从而在其结合后可通过该标记物发出的信号显示同源结合伴侣，如炭疽芽孢杆菌孢子的存在或含量。或者，该检测试剂本身能与可检测标记物标记的第二试剂相结合。在该检测物质是23a-14G9的非限制性例子中，用可检测标记物标记的抗-小鼠IgG抗体可用于检测23a-14G9和进而检测炭疽芽孢杆菌孢子。
当与捕获试剂联用时，形成了含有该试剂、炭疽芽孢杆菌孢子或孢子提取物组分和该检测试剂的夹心复合物。此夹心复合物的形成是先形成含有捕获试剂和炭疽芽孢杆菌孢子或孢子提取物组分的复合物，该复合物再与检测物质接触形成夹心复合物。或者，此夹心复合物的形成是先形成含有检测试剂和炭疽芽孢杆菌孢子或孢子提取物组分的复合物，该复合物再与捕获试剂接触形成夹心复合物。捕获试剂、检测试剂或二者导致夹心复合物以及其它形式复合物的特异性。因此，本发明的实施方案包括利用以下混合物
本发明方法(无论是否用夹心形式)优选用于检测是否存在浓度至少在0.02μg/ml以上的炭疽芽孢杆菌孢子或23a-14G9抗体的同源结合伴侣。在其它实施方案中，这些方法可检测的浓度(μg/ml)在0.08以上、0.30以上、0.5以上、1以上或1.25以上。或者，可用本发明方法分析含以下浓度的孢子的等份样品，或其稀释液来检测是否存在浓度(cfu/ml)至少为1010、至少为109、至少为108、至少为107、至少为106或至少为105的炭疽芽孢杆菌孢子。所述等份样品体积的非限制性例子包括500μl、450μl、400μl、350μl、300μl、250μl、200μl或150μl样品体积。
本发明的检测方法也包括竞争性结合试验作为实施方案。这些方案包括利用竞争与本文所述检测试剂和/或捕获试剂相结合的炭疽芽孢杆菌孢子或孢子提取物组分的标记形式，和类似于本领域已知的竞争性测定方法。本发明提供的这些方法也可完全或部分自动(进行)。
用于本发明方法的物质可理想地适用于制备按熟知方法制备的试剂盒。因此，本发明提供的试剂盒装有检测和/或定量测定本文所述样品中炭疽芽孢杆菌孢子或其提取物或裂解形式的试剂。这种试剂盒任选装有(检测)试剂和/或(捕获)试剂以及关于试剂盒在本发明方法中的应用、或适用性的鉴定书或标签或使用说明书。这种试剂盒可装有容器，每个容器含有(本发明)方法所用的各种(检测)试剂和/或(捕获)试剂的一种或多种(任选以浓缩的形式)，这些试剂包括，例如检测试剂和/或预固定形式的捕获试剂。一般也包括一套使用说明书或试剂标识符。为实施本发明，其它示范性试剂盒装有装置或固相支持物，例如但不限于侧流装置、检测条带、珠、膜，或容器、碟或孔的包被表面。
这些试剂盒也可任选装有对照样品，例如免疫反应性炭疽芽孢杆菌孢子，或与检测试剂和/或捕或试剂相结合的同源抗原的已知样品。对照(样品)的含量已知，从而可用稀释样品的样品稀释剂来稀释，并用作外部对照；或者可将其加入实际样品并用作内部对照，任选用于测定该试验对所检验样品的灵敏度。这些试剂盒可装有一次试验或多次试验(所需)的材料。
本发明还提供能产生23a-14G9抗体的杂交瘤细胞。此细胞由ATCC于2004年5月19日保藏，ATCC登录号为PTA-6004。可在体外培养该杂交瘤以产生抗体，所述抗体经任选的分离步骤后可如本文所述使用。或者，可将该杂交瘤注入动物体内产生腹水，再从腹水中制备抗体液。得到的抗体经任选的分离步骤后可如本文所述使用。“分离”指制备主要含有该抗体的组合物，该抗体以摩尔计在组合物中的含量比其它非溶剂物质更丰富。以摩尔计，相对于其它非溶剂物质，“分离的抗体”优选含有至少约50、至少约60、至少约70、至少约80或至少约90％的抗体。通过除去污染性分子实体，可将抗体分离纯化为接近，或基本上均质。
可采用制备23a-14G9的方式制备其它单克隆抗体。简言之，使小鼠与炭疽芽孢杆菌孢子接触而产生免疫应答和产生抗体。分离表达抗体的细胞，与所选择的无限增殖细胞相融合，然后筛选表达炭疽芽孢杆菌孢子特异性抗体的细胞。用有限稀释法克隆阳性细胞群，然后选择以获得产生23a-14G9的杂交瘤细胞系。
可利用与23a-14G9抗体所识别的炭疽芽孢杆菌孢子特异性抗原相结合的抗体复合物来产生其它抗体。图3，A部分所示的一个非限制性例子是利用与其同源孢子特异性抗原相结合的23a-14G9抗体复合物免疫动物(例如联用本领域已知的合适佐剂)来产生针对该复合物的抗体。动物可以是本领域已知用于产生抗体的动物，包括小鼠、大鼠、家兔和山羊。在一些实施方案中，用含23a-14G9的复合物(免疫)BALB/C小鼠，有利于降低或消除只与23a-14G 9相结合的抗体产生，因为它(23a-14G9)是BALB/C小鼠产生的。因此，23a-14G9在BALB/C小鼠中可视作“自身物质”。这有利于提高针对孢子特异性抗原而非针对23a-14G9抗体的抗体产生。
得到的抗体可用作与该复合物结合的多克隆抗体。因此，在一些实施方案中，这些多克隆抗体可用作复合物的“捕获抗体”。这种多克隆抗体是异质群体，至少包括1)与23a-14G9抗体某表位相结合的抗体；2)与该复合物中外露的孢子特异性抗原某表位相结合的抗体；和3)与该复合物中但在23a-14G9抗体或抗原中没有发现的某表位相结合的抗体。可根据异质性将此异质群体(抗体)分成(上述)三组分。一个非限制性例子是，可将针对23a-14G9的抗体作亲和纯化以产生与抗原或复合物的表位而非23a-14抗体本身相结合的多克隆抗体。
也可筛选产生该异质(抗体)群的细胞来选出能与上述三组分之一结合的抗体。一个非限制性例子是，可用本领域已知方法利用这些细胞来制备杂交瘤，然后用23a-14G9抗体筛选，从表达与孢子特异性抗原相结合或与该复合物相结合的抗体的杂交瘤中选出产生能与23a-14G9抗体相结合抗体的杂交瘤。类似地，可筛选这些杂交瘤来鉴定表达能与炭疽芽孢杆菌的孢子而非用于产生异质(抗体)群的23a-14G9抗体或复合物相结合的抗体的那些杂交瘤。用此法获得的杂交瘤表达的抗体是23a-14G9所结合的孢子特异性抗原的特异性抗体。当然，这种抗体可以和本文所述23a-14G9相同的方式使用，包括用于产生其它抗原结合性抗体。参见图4，B部分。
此外，可用检测到交叉反应性的任何芽孢杆菌或孢子或其它分子筛选这些抗体和/或杂交瘤。相对于能与所述交叉反应性菌株或其它分子起反应的其它抗体而言，此法能选出对炭疽芽孢杆菌特异、或特异性更强的抗体。在本发明的一些实施方案中，可选择相对于苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种，例如ATCC33679的孢子的抗体或杂交瘤，这些孢子与23a-14G9抗体的交叉反应性水平低。也可相对于ATCC 35866进行选择。
也可根据与所述复合物结合而不与23a-14G9和炭疽芽孢杆菌孢子结合来选出能与该复合物相结合的抗体。这种抗体优选用于结合或检测所述复合物，例如当用作捕获试剂来固定所述复合物时。
现已对本发明作了整体描述，参考以下实施例更易于理解本发明，除非另有指定，这些实施例是为说明目的而提供而非限制本发明的范围。
实施例实施例123a-14G9识别孢子特异性抗原材料与方法(1)抗原制备孢子使炭疽芽孢杆菌在TSA板上中生长3天成为汇合培养物以使营养细胞有足够时间消耗培养基中的基本营养从而形成孢子。用无菌磷酸缓冲盐水(PBS)将细菌/孢子从板上洗下，在水浴中于60℃培养1小时杀死剩余的营养细胞，而不影响孢子。然后在4℃，3400rpm离心10分钟洗涤孢子两次。用孔雀绿染色制备物的等份试样来观察孢子，证实该制备物主要含孢子，几乎不存在营养细胞。
营养细胞抗原在通气液体培养基中培养炭疽芽孢杆菌营养细胞过夜。离心沉淀营养细胞，然后用含有高盐和洗涤剂的TRIS-EDTA缓冲液裂解。用PBS透析上清液。
(2)捕获ELISA为进行捕捉ELISA，利用以炭疽芽孢杆菌孢子和营养细胞免疫的家兔的经蛋白G纯化的兔多克隆IgG作为捕获抗体，以10μg/ml浓度包被在ELISA板上。根据标准方法用含有5％脱脂奶的封闭溶液封闭ELISA板。将孢子或营养细胞抗原的两倍连续稀释液与ELISA板一起温育1小时。充分洗涤板，然后加入10μg/ml的单克隆抗体(mAb)23a-14G9，温育1小时。充分洗涤板。加入偶联了辣根过氧化物酶的山羊抗-小鼠IgG抗体，然后加入底物ABTS来显色ELISA反应。用ELISA板读数仪读取该板的OD405nm值。
结果结果见图1，该图明确显示23a-14G9与炭疽芽孢杆菌孢子抗原强烈反应，但根本不与炭疽芽孢杆菌营养细胞中存在的抗原反应。因此，23a-14G9是识别炭疽芽孢杆菌的孢子特异性抗原的单克隆抗体。
实施例223a-14G9的特异性炭疽芽孢杆菌孢子特异性单克隆抗体23a-14G9的特异性如下所述。利用家兔多克隆IgG作为捕获抗体，炭疽芽孢杆菌孢子特异性单克隆抗体作为检测抗体进行捕获ELISA。以下芽孢杆菌的孢子用作抗原炭疽芽孢杆菌(B.anthracis Sterne)；苏云金芽孢杆菌ATCC 35646；蜡状芽孢杆菌ATCC33018；短小芽孢杆菌ATCC 72；枯草芽胞杆菌ATCC 6051和巨大芽孢杆菌ATCC 25833。
如图2所示，单克隆抗体23a-14G9只与炭疽芽孢杆菌的孢子反应。该抗体不与苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或枯草芽胞杆菌的孢子反应。因此，单克隆抗体23a-14G9对炭疽芽孢杆菌特异，可用于检测和区分炭疽芽孢杆菌孢子与其它芽孢杆菌孢子。
采用相同的条件，用以下芽孢杆菌分离物的孢子检验了23a-14G9抗体蜡状芽孢杆菌ATCC 9620、蜡状芽孢杆菌ATCC 14579(菌株类型)、蜡状芽孢杆菌ATCC 49064、蜡状芽孢杆菌ATCC 10702、蜡状芽孢杆菌ATCC7004、蜡状芽孢杆菌ATCC 33019、苏云金芽孢杆菌ATCC 19267、苏云金芽孢杆菌ATCC 10792、苏云金芽孢杆菌以色列亚种ATCC 39152、，苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种ATCC 33679和苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种ATCC 35866。除了与ATCC 33679有部分交叉反应性以外，该抗体对所有这些蜡状芽孢杆菌分离物和苏云金芽孢杆菌分离物均为阴性(参见图3)。对ATCC 33679抗原浓度2.5μg/ml以上和对炭疽芽孢杆菌抗原浓度0.04μg/ml时该抗体阳性。
无论以前是否专门纳入，本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请和出版物全文纳入本文作为参考。
现对本发明作了完全的描述，本领域的那些技术人员应该知道无需过多实验就可用广泛的等价参数、浓度和条件来实施相同的发明而不脱离本发明的构思和范围。
虽然已结合具体实施方案描述了本发明，但应该理解本发明可作进一步改进。本申请要覆盖总体上根据本发明主旨对本发明作出的任何改变、应用或适应范围并包括与本文内容有差别的这些内容，因为这些是本发明所属领域内已知或惯常实施的，可应用于上述基本特征。
权利要求
1.一种名为23a-14G9的单克隆抗体，
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体由ATCC于2004年5月19日保藏，ATCC登录号为PTA-6004的杂交瘤细胞系产生。
3.一种含有如权利要求1所述单克隆抗体的组合物。
4.一种如权利要求1所述抗体的片段，其中所述片段与炭疽芽孢杆菌孢子相结合。
5.如权利要求4所述的片段，其特征在于，所述片段是二价F(ab′)2片段或单价Fab片段。
6.一种结合被权利要求1所述抗体结合的炭疽芽孢杆菌孢子特异性抗原的抗体。
7.如权利要求6所述的抗体，其特征在于，所述抗体是单克隆的。
8.一种杂合、嵌合、改变的、重组或人源化形式的如权利要求7所述的单克隆抗体。
9.一种杂合、嵌合、改变的、重组或人源化形式的如权利要求1所述的单克隆抗体。
10.一种检测样品中是否存在炭疽芽孢杆菌孢子的方法，所述方法包括使所述样品与权利要求1、2和6-9中任一项所述的单克隆抗体接触，然后检测所述抗体与所述样品组分结合所形成的结合复合物。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述抗体能够结合炭疽芽孢杆菌孢子。
12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述样品被怀疑含有炭疽芽孢杆菌孢子。
13.如权利要求10或11或12所述的方法，其特征在于，所述组分与任选固定在固体支持物上的捕获试剂相结合，所述单克隆抗体用可检测标记物标记。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述捕获试剂是抗体。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗体是与炭疽芽孢杆菌孢子相结合的多克隆抗体。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体也与苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌和巨大芽孢杆菌的孢子相结合。
17.如权利要求10-16中任一项所述的方法，其特征在于，该方法检测浓度至少在0.02μg/ml以上的所述组分。
18.如权利要求10-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测还包括使结合复合物与结合所述组分或所述复合物的可检测试剂相接触。
19.一种检测样品中是否存在炭疽芽孢杆菌孢子的试剂盒，所述试剂盒含有如权利要求1、2和6-9中任一项所述的抗体。
20.一种含有如权利要求1、2和6-9中任一项所述的与炭疽芽孢杆菌孢子特异性抗原相结合的抗体的复合物。
全文摘要
本发明涉及孢子特异性抗体。提供了这些抗体的相关组合物和方法以及产生这些抗体的杂交瘤。与炭疽芽孢杆菌细胞的营养形式相比，这些抗体对孢子具有相对特异性。与其它芽孢杆菌孢子和细胞相比，这些抗体也只对炭疽芽孢杆菌孢子具有特异性。采用本文提供的方法可用这些抗体检测是否存在炭疽芽孢杆菌孢子。本发明也涉及可用于本发明检测方法中的含有这些抗体的制品以及试剂盒。
文档编号G01N33/577GK101031587SQ200580020209
公开日2007年9月5日 申请日期2005年5月11日 优先权日2004年5月12日
发明者B·L·曼戈尔德, J·L·埃尔德瑞琪 申请人:泰树公司