抗胸苷激酶单克隆抗体的抗癌活性的制作方法

专利名称：抗胸苷激酶单克隆抗体的抗癌活性的制作方法
技术领域：
本发明的实施方案涉及利用针对S期调节特异性蛋白——特别是胸苷激酶——的单克隆抗体治疗癌症。
背景技术：
S期是细胞周期的一部分，DNA复制即发生于S期。DNA复制相关基因的表达在S期早期最高。组蛋白mRNA在S中期达到峰值，细胞增殖相关基因在S期是激活的。
TK-1是参与DNA合成“补救途径”的细胞酶。在正常生长细胞中，胸苷激酶1 mRNA在G1-S期交界处附近上升，在S早期呈最高水平，在G2回落至近似G1早期的水平。它在细胞周期的G1/S期被激活，已显示其活性与肿瘤细胞增殖活性相关。恶性细胞似乎丧失了在正常细胞中所观察到的对TK1的严格调节。TK活性是细胞增殖的主要生物化学标志，一些研究显示在恶性肿瘤中TK水平升高。升高的TK活性是由于TK1同工酶的增加。恶性肿瘤中的TK1水平的升高并不简单地为细胞增殖的结果，而是由组成型表达TK1 mRNA的癌细胞中的调节机制的改变而直接导致的。
使用MAb特异靶向恶性细胞是一种使正常或者未感染的组织或细胞免于损伤的手段。MAb可用于形成对某种细胞群具有选择性的治疗试剂。任选地，MAb或其它靶向细胞的蛋白质与生物活性部分连接，以形成被称作免疫连接物、免疫毒素或融合蛋白的生物治疗试剂，它可将靶向部分的选择性与生物活性部分的效力结合。本发明的实施方案涉及抗TK1抗体在合成和表达TK1的细胞例如癌细胞中抑制细胞增殖的用途。
美国专利5,698,409描述了一种来自Raji细胞的纯化的哺乳动物胸苷激酶1(TK1)和一种TK1单克隆抗体，该专利通过引用的方式纳入本文。该单克隆抗体与TK1结合并抑制TK1的活性。TK1单克隆抗体被用于癌症的诊断。

发明内容
本发明优选的实施方案涉及一种通过向所述哺乳动物给予包含针对S期调节性蛋白的抗体或其片段、足以抑制哺乳动物细胞增殖的量的药物组合物来治疗哺乳动物的癌症的方法。在优选的实施方案中，该抗体是一种抗TK1单克隆抗体。更优选地，该抗TK1单克隆抗体是CB001。在优选的实施方案中，抗TK1抗体是嵌合的、人源化的、或完全人单克隆抗体。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还可包括第二种抗癌剂。优选地，所述第二种抗癌剂为核苷类似物。更优选地，所述核苷类似物为5，-氟尿嘧啶、氟达拉滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、吉西他滨、卡培他滨、曲沙他滨、齐多夫定/拉米夫定(Combivir)、恩曲他滨(Emtriva)、恩曲他滨(Epivir)、扎西他滨(Hivid)、齐多夫定(Retrovir)、阿巴卡韦/齐多夫定/拉米夫定(Trizivir)、去羟肌苷(Videx、VidexEC)、替诺福韦延胡索酸双异丙酰氧基甲酯(tenofovir disoproxil fumarate)(Viread)、司他夫定(Zerit)或阿巴卡韦(Ziagen)。
在某些优选的实施方案中，所述抗TK1抗体与细胞毒性剂连接。更优选地，细胞毒性剂为美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白树毒蛋白、肥皂草毒蛋白或α-帚曲霉素。
在某些优选的实施方案中，在给予药物组合物之前，哺乳动物用足量的辐射处理，以上调TK1表达。
在优选的实施方案中，所述药物组合物还包括适于肠胃外给药的可药用液体载体。优选地，液体载体包括等渗盐水。
本发明优选的实施方案涉及一种诊断哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括以下步骤从哺乳动物中获取样本；将样本与抗TK1抗体或其片段一同培养；检测抗体-TK1复合物的量；通过将抗体-TK1复合物的检出量与由使用已知量的TK1而产生的标准曲线比较从而对TK1的浓度定量；和基于样本中的TK1的浓度来诊断哺乳动物中癌症的存在。
本发明优选的实施方案涉及TK1的单克隆抗体。优选地，TK1为病毒或哺乳动物的TK1。更优选地，TK1为人TK1。在某些优选实施方案中，所述抗体特异性针对活性TK1。在另外的优选实施方案中，所述抗体特异性针对无活性TK1。在某些优选实施方案中，所述抗体特异性针对TK1的多聚体形式。在另外的优选方案中，所述抗体特异性针对TK1的单体形式。在某些优选实施方案中，所述单克隆抗体不与TK1的100kD亚单位反应。在某些优选实施方案中，所述单克隆抗体可与TK1结合，但不影响TK1的酶活性。在优选的实施方案中，所述单克隆抗体为嵌合的、人源化的或完全人单克隆抗体。
本发明优选的实施方案涉及一种制备抗TK1的单克隆抗体的方法，该方法包括化学合成的TK1或其片段用作抗原的步骤。优选地，化学合成的TK1包括如SEQ ID NO2所示序列的至少一部分。
本发明优选的实施方案涉及一种制备抗TK1的单克隆抗体的方法，该方法包括在宿主细胞表达编码TK1的基因的至少一部分的步骤。优选地，编码TK1的基因如SRQ ID NO1所示。
本发明优选的实施方案涉及一种确定患者体内瘤组织的部位和扩散的方法，该方法包括以下步骤向患者给予被标记的TK1抗体；可视化被标记的TK1抗体；和确定患者体内瘤组织的部位和扩散的程度。
优选地，可视化通过PET、MRI、CT或SPRCT实现。优选地，用放射性染料或不透射线染料标记TK1抗体。在优选的实施方案中，将确定患者体内瘤组织的部位和扩散程度的步骤用于外科手术方法，可使医生目视区分瘤组织和正常组织。
本发明进一步的内容、特征和优点将从以下对优选实施方案的详细叙述中显而易见。


通过参考优选实施方案的附图来描述本发明的上述或其它特征，这些附图旨在说明而非限制本发明。
图1表示蛋白质印迹分析，表明14F2克隆的TK1特异性。如材料和方法部分所述，用非变性或部分变性的12％聚丙烯酰胺凝胶分离样品(使用类似于制备MAb的方法)。然后将多肽转移至硝酸纤维滤膜上并用来自14F2克隆的MAb探测。含山羊抗鼠IgG(H1L链)辣根过氧化物酶的结合抗体溶液用于可视化MAb的结合。(a)泳道1，纯化的TK1，非变性样品，丽春红S染色；泳道2，纯化的TK1，非变性样品，蛋白质印迹；(b)泳道1，纯化的TK1，部分变性的样品，丽春红S染色；泳道2，纯化的TK1，部分变性的样品，蛋白质印迹；泳道3，Raji细胞提取物，部分变性的样品，蛋白质印迹；泳道4，Hela细胞提取物，部分变性的样品，蛋白质印迹。
图2表示抗TK1的CB001 MAb对TK1酶活性的作用。
图3表示10×放大倍数下的CB001 Ab染色的Raji细胞。
图4表示10×放大倍数下的CB001 Ab染色的Raji细胞。
图5表示50×放大倍数下的CB001 Ab染色的Raji细胞。
图6表示50×放大倍数下的CB001 Ab染色的Raji细胞。
图7表示40×放大倍数下的CB001 Ab染色的MD-MBA-231细胞。
图8表示40×放大倍数下的CB001 Ab染色的MD-MBA-231细胞。
图9表示10×放大倍数下的CB001 Ab染色的MD-MBA-435细胞。
图10表示10×放大倍数下的CB001 Ab染色的MD-MBA-435细胞。
图11表示40×放大倍数下的CB001 Ab染色的MD-MBA-435细胞，视野中有气泡。
图12表示40×放大倍数下的CB001 Ab染色的MD-MBA-435细胞。
图13表示10×放大倍数下的CB001抗体染色的PANC-1(胰的)细胞。
图14表示10×放大倍数下的CB001抗体染色的PANC-1(胰的)细胞。
图15表示40×放大倍数下的CB001抗体染色的PANC-1(胰的)细胞。
图16表示40×放大倍数下的CB001抗体染色的PANC-1(胰的)细胞。
图17表示40×放大倍数下的CB001抗体染色的Hep-G2(肝细胞的)细胞(视野内细胞极少)。
图18表示40×放大倍数下的CB001抗体染色的Hep-G2(肝细胞的)细胞(视野内细胞极少)。
图19表示光学显微镜10×下的CB001抗体染色的正常人淋巴细胞。
图20表示荧光显微镜10×下的CB001抗体染色的正常人淋巴细胞。
图21表示荧光显微镜50×下的CB001抗体染色的正常人淋巴细胞。
图22表示借助流式细胞术的淋巴细胞的细胞计数。淋巴细胞对照；抗TK1的CB001 MAb染色的淋巴细胞；和抗TK1的14f2 MAb染色的淋巴细胞。
图23表示借助流式细胞术的BJAB癌细胞的细胞计数。BJAB对照；抗TK1的CB001 MAb染色的BJAB细胞；和抗TK1的14f2 MAb染色的BJAB细胞。
图24表示借助流式细胞术的人伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤(RAJI)细胞的细胞计数。RAJI对照；抗TK1的CB001 MAb染色的RAJI细胞；和抗TK1的14f2 MAb染色的RAJI细胞。
图25表示无血清的CB001抗体结合的Raji细胞——1.1×106个细胞/ml。
图26表示含血清的CB001 Ab结合的Raji细胞。
图27表示无血清的CB001抗体结合的人淋巴细胞。
图28表示含血清的CB001抗体结合的人淋巴细胞。未检测到溶解。
图29表示10×放大倍数下的HELA细胞(人乳头瘤病毒16转化的子宫颈癌细胞)。
图30表示40×放大倍数下的HELA细胞(人乳头瘤病毒16转化的子宫颈癌细胞)。
具体实施例方式
虽然所描述的实施方案代表本发明的优选实施方案，但应理解的是，在不背离本发明精神的情况下本领域技术人员可作出任何变换。因此，本发明的范围仅由随附的权利要求确定。
给出以下定义，以明确它们在本说明书和权利要求书中的用法的意图和范围。
本文所用术语“纯化的胸苷激酶1”或“TK1”是指从任何生物体，尤其是从哺乳动物分离而来的TK1，所述生物体包括但不限于正常状况或疾病状况下的哺乳动物的身体器官、组织、细胞、液体等，以新鲜或保存的标本、细胞组织培养物、细胞系、杂交瘤等形式存在。由病毒或病毒性感染的细胞制得的TK1也明确地包括在术语“TK1”中。还可通过在适宜的宿主细胞中重组的方法或化学合成的方法制备TK1。包括人TK1序列信息的TK1序列为已知的并可获得。本发明的纯化的TK1提供了足以制备单克隆抗体的产量的纯化的TK1。
本文所使用的术语“哺乳动物”是指人或分类上属于哺乳动物的其它动物。
本文所使用的术语哺乳动物的“身体样本”是指从哺乳动物得到的样本，包括但不限于正常或疾病状况下的身体器官、组织、细胞、液体等，以新鲜或保存的标本形式存在。
本文所使用的术语“体液”是指任何从哺乳动物获得的液体，例如，血液、血清、尿、脊髓液、眼泪等。
本文所使用的术语“身体组织”是指从哺乳动物获得的任何正常的或疾病组织，例如器官组织、活体组织、肿瘤等。身体组织可以新鲜或保存的(例如冷冻的)样品、组织切片标本等形式存在。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”通常用以包括多克隆和单克隆抗体，及其呈现所需结合特异性和亲和性的片段，而不论来源或免疫球蛋白的类型(即IgG、IgE、IgM等)。本文使用的术语“针对TK1的抗体”、“TK1抗体”或者“抗TK1抗体”是指可与TK1结合的抗体或其片段。术语“单克隆抗体”与其通常的含义相符，用于表示从细胞(例如杂交瘤细胞、编码同质免疫球蛋白的DNA所转染的真核宿主细胞、编码同质免疫球蛋白的DNA所转化的原核宿主细胞等)的单一克隆的增殖中得到的同质免疫球蛋白，所述同质免疫球蛋白通常以单一类或亚类的重链、和单一型的轻链为特征。本发明考虑到在某些用法中，本发明的针对纯化的TK1的多克隆抗体可代替本发明的抗TK1单克隆抗体使用。注意一点，不是所有的TK1抗体均抑制TK1酶活性，因为不是所有的表位均位于催化位点。获得的某些抗体与TK1结合但并不抑制TK1的酶活性。
本发明所使用的术语“治疗用途”是指TK1、单克隆抗TK1抗体或多克隆抗TK1抗体的靶向疾病组织的任何用途，其中所述疾病组织的增生被靶向、可视化、减弱或消除。本发明考虑到本发明的治疗用途可与其它已知或还未发现的治疗用途结合使用或独立于它们使用。
术语“治疗剂或生物治疗剂”按其通常意义使用，包括MAb、药物、蛋白质或肽、核酸等治疗或预防哺乳动物例如人的疾病或其它异常状态的用途。
本文所使用的术语“补体介导的溶解作用”是指一个由抗体-抗原复合物激活的血清蛋白系统，该系统有助于通过直接引起所选择的细胞溶解或通过促进它们的吞噬来清除所选择的细胞。
术语“嵌合的”、“人源化的免疫球蛋白”或“人源化的抗体”按它们的通常意义使用，包括其中至少一部分是人源的、至少部分在非人的哺乳动物中产生的任意免疫球蛋白或抗体或其片段。
涉及细胞增殖的S期蛋白，即细胞周期蛋白、癌蛋白质、生长因子、涉及信号转导的蛋白质和DNA修复和/或合成蛋白，它们为利用MAb靶向靶蛋白的癌症疗法提供潜在靶点。潜在靶点包括S期调节蛋白，例如胸苷激酶1(TK1)、脱氧胞苷激酶、胸苷酸激酶(TmpK)、腺苷酸激酶(AmpK)、尿苷单磷酸/胞苷单磷酸激酶(Ump/CmpK)、鸟苷酸激酶(GmpK)、核苷二磷酸激酶(NDK)、Epstain Barr胸苷激酶和1型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-TK)。针对S期调节蛋白的单克隆抗体用于提供癌症治疗。例如TK1等的S期蛋白存在于例如癌症细胞等的增殖细胞表面。因正常细胞不表达TK1，针对TK1的MAb将优先与癌症细胞结合。当抗TK1 MAb已结合至癌细胞时，这些细胞就容易经ADCC和CDC而被破坏。或者，癌细胞可被与抗TK1抗体结合的免疫毒素杀死。因此，给予一种生物治疗剂——该生物治疗剂含有针对一种或多种S期调节蛋白的Mab——可抑制细胞增殖并且可用作癌症的治疗。所述MAb可与例如免疫毒素的第二种试剂或者第二种治疗癌症的疗法结合使用。在优选的实施方案中，S期调节蛋白为TK1。
以下所述的制备抗TK1的实施方案在所有方面应被认为是示例性的而非限制性的。在优选的实施方案中，本发明考虑了各种抗体的制备，所述抗体包括特异性针对活性TK1、非活性TK1、源于TK1基因元件的合成肽、多聚体TK1和单体TK1的抗体。另外，在优选的实施方案中，本发明考虑了特异性针对各种TK1表位的各种抗TK1抗体的制备。因此，不应将本文公开内容的范围理解为将本发明限于有限数目的抗体或限于TK1的有限数目的表位。
本发明的发明人令人意外地发现，TK1存在于增殖细胞例如癌细胞和病毒感染的细胞的表面，而不存在于正常细胞表面。癌细胞和病毒感染的细胞表面的TK1的表达使这些细胞易受ADCC和CDC影响。癌细胞中以及在哺乳动物细胞的病毒转化或感染过程中，TK1表达增加6-30倍。将这些观察结果用于本文公开的用胸苷激酶的抗体治疗癌细胞的方法中。基于所观察到的机制，属于治疗病毒感染的细胞的方法公开于2004年4月30日提交的美国临时申请60/567,344中，通过引用的方式将该申请纳入本文。
已证实在例如癌细胞的转化的细胞中TK1 mRNA及蛋白上调并且组成型表达。在休眠细胞中检测不到TK1水平。通过用本发明优选实施方案的抗TK1抗体治疗患者，使癌细胞经补体依赖性溶解作用(CDC)或抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)被选择性靶向并杀伤。
在某些实施方案中，TK1的细胞毒性被对患者首先使用放射疗法治疗而加强，已有显示放射疗法使TK1表达上调(因为DNA损伤需要产生用于DNA修复的新的核苷酸)。TK1表达上调后，用可与细胞表面TK1结合的TK1抗体治疗患者。即使存在抗体对肿瘤部位的毒性，通过聚焦放射疗法，我们也可限制这种毒性。
另外，本发明考虑使用可用于靶向治疗的抗TK1抗体。例如，将抗TK1抗体用于抑制TK1水平的升高和恢复TK1的正常水平，由此帮助减少细胞复制。抗TK1抗体可用于在肿瘤细胞中抑制升高的TK1酶活性的水平和恢复其正常水平，由此可以减少细胞增殖并阻止疾病扩散。
该实施方案的一个实例包括将抗TK1的单克隆抗体用作治疗剂，它可以与癌症患者中的TK1结合并减少增殖。因为TK1是补救途径的酶，抗TK1单克隆抗体的治疗应对正常组织的作用很小，从而允许所有按正常途径增殖的细胞正常分裂，并且不会使非增殖细胞受损伤。借助胸苷激酶(TK)的dTTP的生物合成对于DNA合成而言不是必需的。dTMP的从头合成是通过复杂的一系列反应来完成的，在这一系列反应中，天冬氨酸和氨甲酰磷酸是dUDP生物合成的起始构件，dUTP被胸苷酸合成酶(synthatase)转变为dTMP。为了使细胞存活，分裂的细胞需要大量的细胞内dTTP。对于细胞可获得的资源而言，dTTP的从头合成消耗很大。通过TK直接将胸苷转变为dTMP则避免了从头合成途径。这种核苷酸的重复利用已被称为“补救途径”。
本发明的实施方案提供一种针对TK1的单克隆抗体的生物治疗剂。在某些实施方案中，该生物治疗剂是包含特异性针对TK1的单克隆抗体的免疫连接物或免疫毒素，所述抗体与有效量的具有生物活性的部分例如多肽或毒素相连接。可用的生物活性部分的实例包括蓖麻毒蛋白A链免疫毒素、肥皂草毒蛋白、白树毒蛋白、假单胞菌外毒素或美洲商陆抗病毒蛋白或它们的活性片段。美洲商陆抗病毒蛋白制品的活性可按美国专利6,372,217中所述方法测定，该专利通过引用的方式纳入本文。然而需要强调的是，TK1与免疫毒素的连接并不是必需的。单独使用TK1的单克隆抗体，则通过激活补体介导的溶解作用特异地杀死癌细胞。
优选地，本发明的抗TK1生物治疗剂使用了TK1的单克隆抗体或其生物活性亚单位、片段或衍生物，它们可与例如癌细胞的活跃增殖细胞表面存在的TK1结合。单克隆抗体的“生物活性”亚单位或片段具有单克隆抗体结合活性的至少约1％，优选至少约10％，更优选至少约50％。这些生物治疗剂在体外和体内均有活性，并可用于治疗疾病，例如某些癌症。本文所使用的术语单克隆抗体(MAb)包括其片段、亚单位和衍生物。优选地，MAb为抗TK1 MAb。
本发明提供一种对哺乳动物治疗癌症或抑制癌细胞增殖的方法。该方法包括用有效量的TK1的抗体或包含TK1的抗体的免疫结合物治疗例如人的哺乳动物或在体内或体外治疗哺乳动物细胞。
在某些实施方案中，首先用无免疫学活性的TK的MAb治疗患者。该MAb与癌细胞上的TK结合，它也可与表达TK1的任何正常细胞上的TK1结合。之后，用免疫活性的抗TK1抗体治疗患者，由于预期的癌细胞的高水平的TK1表达和正常细胞或分裂细胞中低水平或不存在的TK1表达间的差异，抗体将特异地仅与癌细胞表面的TK1结合。然后通过CDC或ADCC杀死癌细胞。需要强调的是，仅当抗TK1抗体与正常细胞存在一些交叉反应性时本方法才是必要的。
在某些实施方案中，将抗TK1生物治疗剂与抗癌剂或抗病毒剂结合使用。所述抗癌剂或抗病毒剂可以是核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂(核苷类似物)，例如5’-氟尿嘧啶、氟达拉滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、吉西他滨、卡培他滨、曲沙他滨、齐多夫定/拉米夫定(Combivir)、恩曲他滨(Emtriva)、恩曲他滨(Epivir)、扎西他滨(Hivid)、齐多夫定(Retrovir)、阿巴卡韦/齐多夫定/拉米夫定(Trizivir)、去羟肌苷(Videx、VidexEC)、替诺福韦延胡索酸双异丙酰氧基甲酯(Viread)、司他夫定(Zerit)或阿巴卡韦(Ziagen)。
不拘囿于任何理论，据推测以上抗癌剂通过类似于抗TK1 MAb的机制起作用。也就是细胞增殖需要复制。与抗TK1抗体类似，这些抗癌剂干扰转化细胞的复制能力，因此可被用于治疗癌症和病毒感染的方法。本文所述方法通常可用于治疗异常细胞增殖，尤其是由于癌症或病毒感染的异常细胞增殖。
因此，在另外的实施方案中，将例如核苷类似物的抗癌剂用于治疗癌症。这些方法基于上述机制相同的机制。也就是细胞增殖需要复制。与抗TK1抗体类似，这些抗癌剂干扰转化细胞的复制能力，因此可被用于治疗癌症和病毒感染的方法。本文所述方法通常可用于治疗异常细胞增殖，尤其是由于癌症或病毒感染的异常细胞增殖。
单克隆抗体通过将脾淋巴细胞和骨髓原发性肿瘤的恶性细胞(骨髓瘤)融合产生单克隆抗体(MAb)。Milstein，Sci.Am.，243，66(1980)。通过该方法得到由单个融合细胞杂交体或克隆所产生的杂交细胞系或杂交瘤，所述融合细胞杂交体或克隆同时具有淋巴细胞和骨髓瘤细胞系的特征。与淋巴细胞(取自事先注入羊红细胞作为抗原的动物)类似，融合的杂交体或杂交瘤分泌与抗原反应的抗体(免疫球蛋白)。而且，与骨髓瘤细胞系类似，该杂交细胞系为永生的。特别地，源于接种动物的抗血清为可变的、不能相同地再次产生的抗体混合物，而杂交瘤分泌的单一类型的免疫球蛋白，对拥有多重抗原性分子亚结构或者多个决定簇(表位)的复杂分子的抗原，也仅仅特异性针对该抗原的一个且仅一个抗原决定簇。因此，对于抗单一抗原而产生的单克隆抗体，可根据诱导它们形成的决定簇来彼此区分。然而，既定克隆所产生的所有抗体均相同。而且，杂交瘤细胞系可无限繁殖，且易于在体内和体外繁殖，而且可产生极高浓度的单克隆抗体。
单克隆抗体已广泛用于临床上癌症的诊断和治疗，为治疗自身免疫性疾病和移植物抗宿主疾病(GVHD)和为预防同种异体移植排斥的用于产生免疫抑制作用的免疫应答调节。人单克隆抗体还可在临床上用于抗乳腺癌、血液癌症、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeru ginosa)、大肠埃希氏菌(Escher ichia coli)及肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的各种特异血清型。
使用已知的杂交瘤融合技术(G.Kohler and C.Milstein，Eur.J.Immunol.，6，511(1976)；M.Shulnlan et al.，Nature，276，269(1978))制备可用于本发明的单克隆抗体。如上所述，本发明优选的实施方案使用直接针对TK1的单克隆抗体。
可按美国专利5,698,409所述的方法制备TK1，该专利通过引用的方法纳入本文。美国专利5,698,409描述了一种源于Raji细胞的纯化的哺乳动物胸苷激酶1(TK1)。Raji细胞是一种永生化的人淋巴瘤细胞系，该细胞系可作为#CCL-86细胞系从ATCC获得。美国专利5,698,409还描述了一种TK1的单克隆抗体。
还可通过公布的蛋白质的全部或部分序列的化学合成来制备该蛋白质。例如，已通过全长cDNA确定了人TK1的蛋白质序列(MGC ProgramTeam，″Generation and initial analysis of more than 15,000full-length human and mouse cDNA sequences″PNAS(December 24，2002)vol.99(26)16899-16903)。该公布的蛋白质序列可用于产生包括完整的TK1蛋白的全部或部分的肽。然后可通过本文所述方法将这些肽用于产生MAb。
此外，可使用TK1核苷酸序列重组产生TK1蛋白。人TK1的核苷酸序列和相应的蛋白质序列分别如SEQ ID NO1和2所示。
在某些实施方案中，优选将抗TK1 MAb人源化。人源化抗体可包括来自具有所需特异性的非人源例如小鼠来源的免疫球蛋白部分，和来自人源的免疫球蛋白序列部分(例如嵌合免疫球蛋白)，它们可通过常规技术(例如合成)化学连接，或使用基因工程技术(例如，编码嵌合抗体的蛋白质的各部分的DNA可表达产生连续多肽链)以连续多肽形式制备。本发明的人源化免疫球蛋白的另一个实例为这样一种免疫球蛋白，它含有一个或多个包括非人源CDR(例如非人源抗体的一个或多个CDR)和源于人来源(例如框架改变或未改变的CDR移植的抗体)的轻链和/或重链的框架区的免疫球蛋白链。术语人源化免疫球蛋白还包括嵌合的或CDR移植的单链抗体。
本发明还包括表面修饰的或重构的人源化抗体。例如，将啮齿动物的可变区与其所属的蛋白质序列亚群的共有序列进行对比，用担当框架的人恒定区与其家族的共有序列进行对比。用更通常存在的人残基替换异质性残基。
使用合成的和/或重组的核酸以制得编码所需人源化链的基因，从而可产生所述人源化免疫球蛋白。例如，使用PCR诱变方法改变例如来自先前人源化可变区的DNA模板的编码人或人源化链的DNA序列，从而构建编码人源化可变区域的核酸序列(参见例如Kamman，M.，et al.，Nucl.Acids Res.，175404(1989)；Sato，K.，et al.，CancerResearch，53851-856(1993)；Daugherty，B.L.et al.，NucleicAcids Res.，19(9)2471-2476(1991)；和Lewis，A.P.and J.S.Crowe，Gene，101297-302(1991)))。还可以通过使用上述或其它合适的方法而容易地得到各种变异体。在一个实施方案中，可诱变处理克隆的可变区，并且可以选择编码具有所需特异性的变异体的序列(例如，源于噬菌体库；参见例如Krebber et al.，美国专利5,514,548；Hoogenboom et al.，WO 93/06213，公开于1993年4月1日；Knappiket al.，WO 97/08320，公开于1997年3月6日)。
此外，如美国专利5,476,996所述，可通过下述方法方便地制备人源化抗体，所述方法即向已接受成人外周血白细胞异种移植物的SKID小鼠或其它SKID动物注射纯化的TK1，该专利通过引用的方式全文纳入本文。通过该处理，将人免疫功能引入可用于产生人源化抗体的SKID动物中。
免疫毒素本发明的某些实施方案包括与抗TK1 MAb连接的免疫毒素的用途。为使免疫毒素有效，其必须满足一些要求。首先，免疫毒素应为特异性的，并且不应与不表达靶抗原的组织反应而达到对目标动物造成伤害的程度。Pastan et al.，Cell，47，641(1986).可通过除去例如植物糖蛋白毒素或抗病毒剂的生物治疗部分的非特异性天然细胞结合亚单位或结构域，来减少与不表达抗原的组织结合。此外，由于植物糖蛋白毒素含有可结合网状内皮系统细胞的甘露糖寡糖，并且在某些情形中还含有被肝细胞受体识别的岩藻糖残基，所以可能需要对植物毒素去糖基化以避免快速清除和对这些细胞的潜在细胞毒性作用。第二，毒素与抗体的连接不应明显损害抗体与抗原结合的能力。第三，必须使免疫毒素有效地内在化入内体小泡(endosomi cvesicle)。因此借助单克隆抗体导向正常内在化的表面受体的毒素可比导向非内在化的细胞表面分子的毒素活性更高。第四，毒素的活性部分须转移至细胞质中。最后一点，对于体内治疗，当免疫毒素穿过哺乳动物的组织到达其作用的细胞位点时，MAb和毒素间的连接须足够稳定以保持完整。
通过测定其杀死表面存在靶抗原的细胞的能力，初步评价免疫毒素的活性。因为毒素在细胞内起作用，所以通过胞吞作用自然地进入细胞的受体和其它表面蛋白通常是免疫毒素的合适的靶，但固定于细胞表面的表面蛋白不是合适的靶。然而，如果可获得识别相同细胞表面蛋白的不同表位的多种抗体，则将它们全部进行测试是有益的。这是因为有些抗体可能通过引起靶蛋白构象改变，来更有效地诱导内在化或引导出毒素转移至适宜位置的细胞内路径。May et al.，Cell Immunol.，135，490(1991).另外，如果受体被有效内在化，就有可能使用由制备免疫毒素所需的化学修饰所致的无法与受体紧密结合的免疫毒素。Willingham et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，2474(1987)。
毒素大量细菌和植物来源的毒素已被偶联至MAb用于制备出免疫毒素。该策略是选择一种天然细胞毒素蛋白，然后修饰该细胞毒素蛋白，使其不再不加区分地结合并杀死正常细胞，而是取而代之地仅杀死表达与MAb结合的抗原的细胞。由于对于既定的MAb而言，细胞表面的受体位点有限，为了起到最佳作用，上述方法要求相对少量的细胞毒性分子的内在化就应使靶细胞致死。由某些细菌和植物产生的使细胞蛋白质合成失活的毒素可达到该要求，与以化学计量方式发挥作用的大多化学治疗剂不同，它们通过催化作用发挥致死活性。通常，细胞的胞质中不到十个毒素分子就足以杀死细胞。
使蛋白质合成失活的两类毒素已广泛用于免疫毒素的构建。第一类是由完整的毒素构成，例如完整的蓖麻毒蛋白。这类毒素由于其致死毒性而不能安全地用于体内。第二类毒素是指半毒素。半毒素共价修饰核糖体，这样它不再与延长因子2高效地相互作用，从而以补体方式致命性地抑制蛋白质合成。后一类毒素包括美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白树毒蛋白、肥皂草毒蛋白和α-帚曲霉素。源于植物的核糖体失活蛋白由包括结合链和催化链的两条链组成(例如蓖麻毒蛋白)，或者仅由单一的催化链组成(例如PAP或肥皂草毒蛋白)。
在某些实施方案中，本发明方法所使用的抗TK1抗体免疫毒素是通过将有效细胞毒性或抗癌量的免疫毒素分子与每个抗TK1抗体分子连接形成。例如，可用于本发明实施的试剂包括每个抗TK1抗体分子一至两个免疫毒素分子。优选地，本发明的组合物包括约1∶1的下述物质的混合物a)每个抗TK1抗体分子一个免疫毒素分子，和b)每个抗TK1抗体分子两个免疫毒素分子。优选地，本发明组合物主要包含每个完整的抗TK1单克隆抗体分子1或2个免疫毒素分子、游离的抗TK1单克隆抗体和游离的免疫毒素。
抗TK1 MAb或抗TK1抗体免疫毒素的给药方式可将本发明的抗TK1 MAb或抗TK1抗体免疫毒素或其混合物制成药物组合物并将其给予患有癌症的人或其它哺乳动物，优选制成包含与可药用载体或赋形剂和/或与其它治疗剂混合的有效量的一种或多种抗TK1 MAb或抗TK1抗体免疫毒素的单位剂型。
剂型优选本发明的抗TK1 MAb或抗TK1抗体免疫毒素以通过输注或注射的肠胃外方式给药，即静脉或皮下给药。可在水中或生理盐溶液例如等渗盐水或PBS中，任选地与无毒表面活性剂混合，制备生物治疗剂的溶液或悬液。
虽然如上所述优选以液体组合物形式给予抗TK1 MAb或抗TK1抗体生物治疗剂，但也可与各种其它载体一同给药。例如，还可在甘油、液态聚乙二醇、DMA、植物油、乙酸甘油酯及其混合物中制备分散系。在普通贮存和使用条件下，这些制剂可含防腐剂以防止微生物生长。另外，抗TK1 MAb或抗TK1抗体生物治疗剂更专一地向肺的给药可通过气溶胶送递系统完成。
适于注射或输注的组合物包括无菌水溶液或分散系或者无菌粉末，所述无菌水溶液或分散系或者无菌粉末中含有适用于无菌可注射或可输注溶液或分散系的临时制剂的抗TK1 MAb或抗TK1抗体生物治疗剂。对于所有情况，最终组合物在生产和贮存条件下必须是无菌、液态和稳定的。液体载体或赋形剂可以是包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯、脂质(例如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dimyristoyl phosphatidyl choline))及其适宜混合物的溶剂或液体分散介质。例如通过形成脂质体、就分散系而言通过维持所需的粒径、或者通过使用无毒表面活性剂来保持适宜的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、乙基汞硫代水杨酸钠等来防止微生物作用。在许多情况下，可能需要包括等渗物质，例如糖类、缓冲剂或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收剂例如单硬脂酸铝水凝胶和明胶，可使可注射组合物吸收延长。
通过在适宜的溶剂中将所需量的抗TK1 MAb或抗TK1抗体生物治疗剂与各种其它以上列举的成分混合，然后按需要过滤灭菌，来制备无菌可注射或可输注溶液。对于用于制备无菌可注射或可输注溶液的无菌粉末，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，由该方法产出活性成分以及任何存在于先前灭菌过滤溶液中的其它所需成分的粉末。
此外，本发明抗TK1 MAb或抗TK1抗体生物治疗剂的适当制剂包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括眼部和舌下)或阴道给药的制剂或以适于吸入或吹入给药的形式存在的制剂。所述制剂可通过药学领域任意已知方法制备。所述方法包括下述步骤使生物治疗剂与液态载体或细粉状的固态载体结合或者与这两者结合，然后如果需要的话，将产品制成所需剂型。
适于口服给药的药物剂型可方便地以不连续单位的形式存在，例如胶囊、囊剂或片剂，各个均含有预先确定量的活性成分；也可为散剂或颗粒剂；溶液、混悬剂或乳剂。活性成分还可为大丸剂、药糖剂或糊剂形式。用于口服给药的片剂或胶囊可含有常规赋形剂，例如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或湿润剂。根据本领域公知方法可对片剂包衣。口服液体制剂可为例如水性或油性混悬液、溶液、乳浊液、糖浆或酏剂形式，或者可为在使用前与水或其它适宜媒介物组配的干燥制品的形式。这类液体制剂可包含常规添加剂例如助悬剂、乳化剂、非水介质(可包括可食用油)或防腐剂。
还可将本发明生物治疗剂进行配制用于鼻内或眼部给药。对于这种给药形式，活性成分可以液态喷雾或可分散粉末或滴剂形式使用。可使用同时还含有一种或多种分散剂、增溶剂或助悬剂的水性或非水基质配制滴剂，例如滴眼剂。液体喷雾可从加压容器方便地进行送递。
对于吸入给药，生物治疗剂可方便地从吹入器、喷雾器或加压容器或借助其它送递气溶胶喷雾的便利手段进行送递。加压容器可包含合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。就加压的气溶胶而言，可通过装备阀门以送递定量剂量来确定剂量单位。
另外，就吹入剂的吸入给药而言，生物治疗剂可采用干燥粉末组合物的形式，例如为该化合物或者例如乳糖或淀粉的适宜粉末基质的粉末混合物。粉末组合物可以单位剂型形式存在，例如为胶囊或弹药型制剂或例如其中的粉末可在吸入器或吹入器的帮助下给药的明胶或发疱药包装形式。
此外，本发明的抗TK1 MAb或抗TK1抗体生物治疗剂非常适于配制成控释剂型。可组配制剂以使其仅在或优选在特定的生理部位、任选在一段时间内释放活性干燥成分。可由例如聚合物或蜡制得包衣、包膜和保护性基质。还可经用于经皮投药、皮下植入物、输注泵的贴剂来送递组合物或者经植入的长效持续释放剂型贮库的释放来送递组合物。
剂量根据哺乳动物的身体大小、年龄及状态和疾病，本发明组合物中生物治疗剂的剂量可在很大范围内变化。在既定患者中，以基于抗TK1 MAb和抗TK1抗体生物治疗剂的血浆半衰期的频率给予药量。在某些情况中可使用较高的剂量，并且可容易地对这些剂量进行调节以向儿童提供合适量的生物治疗剂。
实施例实施例1Raji细胞的TK1活性测定一种制备TK1和TK1单克隆抗体的方法基本描述于美国专利5,698,409中，该专利通过引用的方式纳入本文。如下所述由Raji细胞(人伯基特氏淋巴瘤，美国典型培养物保藏中心(ATCC)CCL 86)制备细胞粗提物。将生长培养基离心，收集大约1011至1012个指数生长的Raij细胞。将片状细胞沉淀与上清液分离，并重悬于1-2ml含有0.02M Tris-HCl，pH 7.8，0.05M MgCl2和0.2mM KCl的提取缓冲液中。细胞悬液经历三个在液氮和37℃水浴中的冷冻-解冻的循环。然后将破裂细胞的悬液在4℃下以30,000×g离心30分钟，使细胞碎片聚集沉淀。将含有大约50mg/ml的包括TK和其它可溶性酶的蛋白质的上清液轻轻倒出，与沉淀分开，并于-20℃冷冻保存。
为进行TK测定，将0.2ml粗提物与等量的(0.2ml)含有0.02MTris-HCl(pH 7.8)，2×10-6M[3H]-胸苷(每mmol 85居里)、0.002M MgCl2、0.2M KCl、0.1M NH4Cl、0.005M巯基乙醇和0.004M ATP(三磷酸腺苷)的测定混合物混合。
在37℃水浴中培养测定反应。30分钟和60分钟的培养时间后，取出0.025ml样品并点在Whatman DE-81膜上，使其干燥。用0.01M甲酸将滤膜洗涤三次，每次5分钟，用蒸馏水冲洗5分钟，然后用甲醇冲洗，然后转移至装有4ml用于测量3H放射性的闪烁计数液的闪烁小管中。
实施例2TK1的部分纯化利用DEAE纤维素阴离子交换色谱，从实施例1的Raji细胞粗提物中部分纯化TK1酶。为获得最大量的TK蛋白，需要在细胞处于指数生长期时收获细胞。使用公知的Bradford测定法测定粗提物的蛋白质含量。将总量大约1.0-2.0克的粗提物中的蛋白质加至DEAE纤维素柱中，用10个外水体积的0.1M Tris-HCl(pH8.0)，以重力流速冲洗。用0.5M Tris-HCl(pH8.0)洗脱柱，并收集1.0ml流分。
得到280nm处测量的吸光度作为洗脱时间的函数的色谱图。收集的流分的整分试样用于如实施例1概括所述的TK1的活性测定。将多次跑柱的流分合并，并使用Amicon蛋白质浓缩器将其浓缩。
实施例3FPLC纯化将0.1ml上述浓缩的DEAE纤维素流分上样于FPLC柱(PharmaciaMONO-Q5/5阴离子交换柱)，该流分含约1mg蛋白质，用10体积的缓冲液A(50mM Tris-HCl pH8.0)过柱。设定程式梯度使20分钟内缓冲液B(1.0M NaCl，50mM Tris-HCl，pH8.0)的浓度从0至100％逐渐增加，恒定流速为1.0ml/min。
当蛋白质从柱上洗脱下来时，利用280nm处的吸光度检测蛋白质。收集含280nm处吸收峰的流分，如本文先前所述测定TK1活性。
收集多次过柱的具有TK1活性的流分，将其合并浓缩。然后将此部分纯化、合并的样品以较低梯度再次过MONO-Q柱。将含1mg蛋白质的十分之一毫升部分的合并样品如前上样于MONO-Q柱。对于第二次过柱，梯度为开始5％的缓冲液B，35分钟后至40％的缓冲液B，流速为1.0ml/min。
得到第二次的顺序MONO-Q过柱的吸光度相对洗脱体积的色谱图。再次收集含1.0ml洗脱液的流分，并用TK1活性测定来验证。
从以上第二次过柱得到的沉淀和合并的蛋白进行第三次的顺序MONO-Q过柱。通过减慢流速以及进一步减小梯度来进一步改变过柱条件。过柱梯度为5％的缓冲液B至30％的缓冲液B，流速为0.5ml/min。此次过柱收集0.5ml流分。
实施例4与TK1结合的单克隆抗体的产生产生与TK1结合的抗体的杂交瘤细胞系由本领域通常已知但作了某些改进的方法得到。对使用具体的杂交瘤细胞系产生单克隆抗体的说明仅为示例性说明。本发明的实施方案考虑了通过各种方法例如使用杂交瘤细胞系和其它重组技术而产生的一系列克隆的用途。
如上所述制备TK1。将悬于50μl磷酸缓冲盐溶液(PBS)的100μg剂量的TK1和50μl剂量的完全弗氏佐剂腹膜内(I.P.)给予各组的每只5-6周龄的雌性BALB/c小鼠。
用半纯TK1第二次免疫后两周，脾内注射给予含有10μg悬于100μl PBS中的纯的活性TK1(如上所述制备)的注射液。用戊巴比妥钠(65mg/ml)麻醉小鼠，所述戊巴比妥钠通过向93.3ml PBS中加入6.7ml进行稀释。每只小鼠I.P.给予10μl/g体重。使用解剖刀和镊子进行手术干预，轻轻挑起脾用于给予抗原。向脾的多个部分注射以确保抗原分布一致。使用金属缝线封闭伤口，将小鼠置于加热灯下1-2小时。
脾内注射后72小时，使用乙醚将小鼠处死，取出脾。处死小鼠前取血，检测血清以确保小鼠对TK1蛋白产生免疫反应。从脾分离B细胞用于与永生的骨髓瘤细胞系融合。
用于形成融合的其中一部分的细胞系为购自ATCC的名为FO的自身融合Sp2/0系。它是P3-X63-Ag8的衍生物。该细胞系为快速生长且非分泌型(重链或轻链免疫球蛋白)的永生的骨髓瘤小鼠细胞系。通常按本领域已知内容进行FO和激活的脾细胞的融合。每次融合使用含大约1×108个细胞的脾。融合结束后，将融合细胞悬液接种于在前一天每孔已接种3000至6000个作为饲养细胞的小鼠巨噬细胞的96孔微量滴定板中。
HAT选择培养基用于选择融合产物。标记生长的各孔，逐渐摒弃HAT而加入常规培养基。至此时，仅有的存活细胞为通过B细胞和FO细胞融合得到的杂交瘤细胞。每次融合得到总共大约500个代表融合产物的克隆。
为了用于检测患者样品，将所选择的产生抗体的细胞系传代，无菌收集上清液三个月。通过用硫酸铵沉淀上清液，然后使用凝胶过滤色谱或者使用DEAE纤维素色谱(二乙氨基乙基纤维素，获自WhantmanInternational，Maidstone，Kent，UK，商品名为SEPHADEX)纯化抗体。该抗体用标准方法纯化，并与HRP-过氧化物酶或者碱性磷酸酶(Bio-Rad)偶联。上述方法已描述于ANTIBODIESALaboratory Manual，by Harlowe and Lane，1988中。
上述方法可用于任何作为抗原的TK1蛋白，所述TK1蛋白包括通过由例如SEQ ID NO2所描述的蛋白质序列等已知蛋白质序列的化学合成产生的TK1，或由使用全部或部分例如SEQ ID NO1所示的TK1编码序列的已知方法所产生的重组蛋白质。
实施例5
与TK1结合的人源化单克隆抗体的产生如美国专利5,476,996所述，向SCID小鼠腹膜内注射人外周血白细胞，该专利通过引用的方式纳入本文。大约2周后，用人TK1免疫SKID小鼠。然后按以上实施例4所述或者利用重组技术获得MAb。
实施例6融合的杂交瘤集落的初步筛选针对部分纯化的TK1(如实施例2所制备)，使用ELISA对由一次融合而得的500个集落进行初步筛选。开始用半纯TK1对自杂交瘤培养物收集而来的上清液进行筛选，所述半纯TK1为由将Raji细胞粗提物过DEAD纤维素以部分纯化TK1而制备的。因此，将这种初步筛选用作与TK1免疫反应的抗体的初级检测。
用每孔1.0μg(微克)的悬于50μl PBS的选定的TK1蛋白制备物包被多孔板，并使其干燥过夜。然后该板用每孔200μl的PBS-TWEEN20-EDTA-1％乳脂处理30分钟以封闭非特异型结合。用200μl PBS-TWEEN20-EDTA(PBST2E)将该板洗涤三次。(TWEEN-20为Bio-Rad实验室(Richmond，Calif.)市售的阴离子洗涤剂，用于减少非特异型抗体-抗原结合而不干扰一抗与抗原的结合或者抗原和硝酸纤维素的结合)。
在收集杂交瘤培养物上清液前三天不更换杂交瘤细胞培养物的生长培养基，以使培养基中抗体饱和。对于各杂交瘤，向平行试验两孔的每孔加入80μl上清液。然后将多孔板在37℃培养一个半小时。将上清液轻轻倒出，各孔用PBST2E洗涤六次。
然后，加入用PBST2E以1∶3000稀释的、过氧化物酶偶联山羊抗小鼠IgG(重链和轻链特异性)(获自Bio-Rad)。每孔加入十分之一毫升，将该板按前文所述培养。各孔再在PBST2E中洗涤，并加入200μl底物即四甲基联苯胺，培养1小时。每孔加入50μl的2M硫酸终止底物反应，从而导致颜色从蓝色变为黄色。将多孔板置于多孔板分析仪上进行450nm处的O.D.测量扫描。为背景O.D.至少两倍的O.D.读数认为呈阳性。50次融合所获得的约25000个克隆中，在初步筛选中有35个被测试为阳性。使用来自Hyclone，Logan，Utah(目录号为#EK-5051)的试剂盒将阳性集落归于同种型，测定阳性集落产生IgG1、IgG2a、IgG3和IgM种类的抗体。
实施例7TK1特异性杂交瘤的再次筛选对在初步筛选中测试为阳性的35个克隆进行更严格的筛选。对多孔板的5对平行孔进行如下包被A、B孔用源于Raji细胞的TK1粗提物包被；C、D孔用经DEAE纤维素柱所制备的TK1包被；E、F孔用来源于借助如实施例4中的FPLC而制备的峰400的纯化TK1包被；G、H孔用由第二次FPLC过柱的308、310流分而得的TK1蛋白质包被；J、K孔用表达PET载体中的TK1基因的E.coli细胞提取物包被。就纯化的样品而言，每孔使用1.0μg蛋白质。
基本按照初步筛选中所述进行ELISA。在测试的35个克隆中，有一个克隆证实仅与活性形式的TK1结合。在405nm处进行一个板的120个孔的吸光度读数，一个板上筛选出10个克隆。将经初步筛选测试为最高阳性的克隆专门群集于该板上。对由4个孔得到的背景ABS取平均值，为约0.058(J11、J12和K11、K12孔)。
很明显，在列2和列5的所有孔中、在除了C、D行的列1所有孔中、在列3、4和7的J、K行的孔中、在列4和7的A、B行的孔中观察到阳性结合(吸光度显著高于背景水平)。也就是说，列1-5和7的克隆全部测试为TK1结合阳性。在这些克隆中，克隆2和5对所有测试的TK1制备物的结合测试为阳性，而克隆1与除了半纯化的DEAE纤维素制备物外的所有TK1制备物结合。克隆4和7与粗的Raji细胞的TK1提取物结合，与在E.coli中由基因工程产生的TK1结合。克隆3仅与由E.coli产生的TK1结合。剩余的25个克隆为TK1抗体阴性。
实施例8蛋白质印迹分析利用蛋白质印迹法进行进一步表征。通过类似于CurrentProtocols in Immunology，Vol.1，publ.Wiley-Interscience，NewYork(1991)所述的方法进行蛋白质印迹分析。图1显示为表明14F2克隆的TK1特异性的蛋白质印迹分析。使用非变性和部分变性的12％聚丙烯酰胺凝胶分离样品。然后将多肽转移至硝酸纤维素膜上并用来自克隆14F2的MAb探测。用含山羊抗鼠IgG(H1L链)辣根过氧化物酶的偶联抗体溶液可视化MAb的结合。(a)泳道1，纯化的TK1，非变性样品，丽春红S染色；泳道2，纯化的TK1，非变性样品，蛋白质印迹。(b)泳道1，纯化的TK1，部分变性的样品，丽春红S染色；泳道2，纯化的TK1，部分纯化的样品，蛋白质印迹；泳道3，Raji细胞提取物，部分变性的样品，蛋白质印迹；泳道4，Hela细胞提取物，部分变性的样品，蛋白质印迹。
实施例9利用选择的单克隆抗体抑制TK1活性通过以1500rpm离心10分钟收获Raji细胞(1×106)。弃去上清液后，向细胞中加入1ml酶混合物(1∶100.02％β-巯基乙醇Tris-HCl pH 7.5)。将混合物在液氮中冷冻，然后使细胞在37℃水浴中解冻。重复冷冻/解冻步骤三次。最后，使混合物在4℃，以14000rpm离心75分钟，以除去细胞膜。弃去沉淀物。
在6个eppendorf管中每管分装25μl Raji细胞提取物。使新鲜杂交瘤培养液杂交瘤上清液以总125μl按以下比例1∶2、1∶4、1∶16、1∶32、1∶64稀释。用125μl杂交瘤培养液作对照。向6个eppendorf管的各管加入稀释液或者对照液。使用实施例1中所述的胸苷激酶放射性测定法测定样品的胸苷激酶活性。在杂交瘤上清液中抗体产生的抑制作用越强，则胸苷激酶活性越小。
实施例10膜结合蛋白染色方案以下方案用于使淋巴细胞和其它类型细胞着色。对于淋巴细胞，将血液收集于肝素管中，用平衡盐溶液(PBS)以1∶2稀释。将5ml phicol置于15ml锥形小管底部(每7ml稀释的血液于一个锥形小管中)。将含淋巴细胞的锥形小管以1300rpm离心20分钟。离心后，用吸管除去挂于phicol表面的棕黄(buffy)层。将至多7ml的淋巴细胞溶液转移至新的15ml锥形小管中，再次用PBS以1∶2稀释。样品再次以1500rpm离心10分钟。此洗涤步骤重复2次。
对于细胞系而言，将20ml生长至5×105至1×106的浓度的细胞转移至锥形小管中，以1500rpm离心10分钟。将细胞沉淀物悬浮于2ml PBS中。重复该洗涤步骤两次。
就染色而言，将细胞洗涤两次后，使细胞重悬于3％甲醛溶液中，冰上培养10分钟(该步骤使细胞固定并抑制细胞激活和相互作用)。10分钟后，以1500rpm将细胞离心10分钟。吸出上清液，将包含细胞的沉淀物重悬于2ml PBS中，再以1500rpm离心10min。细胞在PBS中再洗涤两遍。洗涤第二次后，倾出上清液，余留少量液体于锥形管底。向细胞加入10μl FC区段，并将细胞重悬于少量PBS和FC区段中。
将细胞在冰上培养10min。然后，加入2ml PBS并将细胞以1500rpm离心10min。重复该洗涤过程两次。第二次洗涤后，将细胞重悬于10ml来自杂交瘤细胞系的上清液中，在冰上避光培养1.5小时。然后以15rpm将细胞离心10min，并洗涤2次。
稀释二级抗体(例如10μl的2mg/ml二级抗体于820μl PBS中)，向最后洗涤后的各细胞沉淀加入200μl。使二级抗体与处理过的细胞在冰上避光培养1小时。1小时后，细胞从冰上移开，用2ml PBS稀释。将细胞离心，吸除上清液。将细胞洗涤三次。将细胞重悬于100μl PBS中，保存于溶液中至准备观察。取10μl至洁净的显微镜的载玻片上，盖上盖玻片以便观察。
使用前述的免疫荧光技术得到图3-21和29-30。如图所示，由于癌细胞表面存在TK1，癌细胞例如Raji细胞、MD-MBA-435、MD-MBA-231、PANC-1(人胰腺癌细胞系)、HEP-G2(人肝癌细胞系)和HELA细胞(人乳头瘤病毒16转化的子宫颈癌细胞)被抗-TK1抗体强烈标记。而正常淋巴细胞不被标记。
实施例11流式细胞仪其它测定证实所选的单克隆抗体与产生TK1的细胞特异性结合。利用流式细胞仪绘图进一步表示抗TK1抗体特异性靶向癌细胞的能力的特征。
使用本领域已知方法得到流式细胞仪绘图。使用试管法，将每种样品置于两个带标记的12×75mm的试管中，一个用于单克隆抗体，另一个用于合适的对照。随后，将源于单核细胞制备物的1×106个细胞置于各试管中，以400-450×g于2-8℃下离心4min。将上清液吸出并弃去。然后将200μL单克隆抗体工作溶液或者200μL对照工作溶液置于适当标记的试管中。将反应轻微涡旋。将反应在2-8℃培养30-35min。培养后，各反应混合物用1mL 2-8℃的洗涤培养液洗涤，并于2-8℃下以400-450×g离心4分钟。小心吸出反应物并弃去上清液。然后，进行涡旋以使沉淀细胞破裂。重复培养步骤后的的洗涤步骤。第二次洗涤后，小心吸出样品，弃去上清液。然后向各细胞沉淀中加入200mLGAM-FITC工作溶液或者抗生物素蛋白d-FITC工作溶液(用于生物素标记的)。利用涡旋轻轻地使沉淀细胞破裂。细胞于2-8℃下培养30-35min。在30min末，用1mL 2-8℃的重悬培养液将细胞洗涤三次。每次离心在2-8℃下以400-450×g进行4min。然后小心吸出样品，弃去上清液。然后利用涡旋轻轻地使沉淀细胞破裂。第二次培养后的步骤重复两次。三次洗涤后，向每个试管中加入1mL 2-8℃的重悬培养液使细胞重悬。将样品转移至合适的容器中用于流式细胞术或荧光显微术分析。为确保最大活力，立即进行染色细胞分析。
从未患癌症的对照患者中抽血，以建立用于比较正常细胞和已知癌细胞系的基线水平(图22)。我们首先使不含抗体的对照淋巴细胞通过流式细胞仪，流式细胞仪计数为10.1％或44477总细胞的4510个，由此设定基线水平，以便比较未着色的正常淋巴细胞与抗体着色的淋巴细胞。结果显示，当正常淋巴细胞与CB001单克隆抗体一同培养时，流式细胞仪计数仅为12.1％的对照淋巴细胞或者20628个细胞中的2494个，这与对照数目的10.1％没有显著差异，由此说明正常淋巴细胞表面的TK1并未被CB001单克隆抗体检出。
由BJAB细胞产生另外的流式细胞仪绘图(图23)。使不含抗体的BJAB对照细胞通过流式细胞仪，流式细胞仪计数仅为6.64％或20302个总细胞中的1448个，由此设定基线水平，以便比较未着色的BJAB细胞和抗体着色的BJAB细胞。结果显示，当BJAB细胞与CB001单克隆抗体细胞一同培养时，流式细胞仪计数为34.8％的BJAB细胞或20302个细胞中的7055个，将该结果与对照数目的6.64％比较，说明癌性BJAB细胞系表面的TK1被检出。
由人伯基特氏淋巴瘤(RAJI)细胞产生另外的流式细胞仪绘图(图24)。使不合抗体的RAJI对照细胞通过流式细胞仪，流式细胞仪计数仅为10.3％或1992个总细胞中的2051个，由此设定基线水平，以便比较未着色的RAJI细胞和抗体着色的RAJI细胞。结果显示，当RAJI细胞与CB001单克隆抗体细胞一同培养时，流式细胞仪计数为76.3％的RAJI细胞或者13301细胞中的10144个，将该结果与对照数目的10.3％比，说明癌性RAJI细胞系表面的TK1被检出。
使用包括由抗化学合成的TK1片段而产生的两种TK1单克隆抗体的其它TK1单克隆抗体也得到类似结果，所述化学合成的TK1片段是由来自TK1的C末端的15个氨基酸制备而来的。
实施例12抗TK1用于补体介导的溶解作用在抗TK1单克隆抗体的一种治疗性应用中，抗TK1抗体用于靶向肿瘤治疗。该结合的抗TK1抗体用于启动破坏癌细胞的补体介导的溶解作用。该实施方案特别有效，因为抗TK1抗体与表达大量TK1的肿瘤细胞特异性结合。因为抗TK1抗体与表达大量TK1的肿瘤细胞特异性结合，它就特异靶向于肿瘤细胞，因此通过补体介导的溶解作用的杀肿瘤细胞作用比杀正常细胞的作用相对更强。另外，TK1不同于仅特异性针对一种癌症类型的其它癌症标记，它在许多类型的癌症中均作为有用的癌症标记而起作用。补体介导的溶解作用是本领域公知的过程。对适宜的补体途径的选择在本领域技术人员的知识范围以内，并且不必花费不当的实验即可完成。
通过抗TK1而靶向的补体介导的溶解作用的方案的一个实例具有以下步骤。首先，从每ml培养物有5×105至1×106个细胞的培养物中取2ml Raji细胞。以1600rpm将细胞离心10分钟。弃去上清液。随后用PBS将细胞洗涤3次。杂交瘤上清液用PBS按1∶2的稀释倍数稀释。然后将稀释的上清液中的细胞在冰上培养1小时。1小时后将细胞洗涤3次并重悬于1ml PBS中。然后向细胞加入3ml血清，向对照细胞中加入3ml PBS。将细胞置于3℃水浴中1小时。随后将细胞从水浴中取出置于显微镜玻片上以便观察。图25和26为使用前述方案得到的照片。
图25和26说明当TK1抗体结合至表面时，补体使得癌性B细胞(Raji)溶解。图25为对照Raji细胞的图，图26为被补体介导的溶解作用破坏的癌性B细胞(Raji)的图。细胞溶解大于96％。
图27表示有CB001抗体存在而无血清的非癌性人淋巴细胞。图28表示同时有CB001和血清存在的非癌性人淋巴细胞。可观察到，即使存在血清和抗体，如果细胞不是癌性的也没有溶解作用。仅有癌性细胞由于TK1的表达而遭到破坏。
实施例13使用抗TK1靶向并破坏癌性细胞基于TK1存在于癌性细胞表面的认识，多种治疗性应用成为可能。例如，抗癌药物可能选择性靶向并杀死细胞表面表达TK1的细胞。癌症的治疗例证了这项策略，所述治疗即利用编码病毒TK1基因的质粒、使用腺病毒感染细胞，由此这些细胞被靶向，从而通过干扰DNA合成被杀死。抗TK1抗体的治疗应用进一步例证了本实施方案，所述抗TK1抗体包括与抗肿瘤剂偶联的抗TK1抗体。将抗肿瘤剂偶联到抗TK1抗体上，增强了抗TK1抗体的细胞毒效应，由此杀死肿瘤细胞而非杀死正常细胞。
实施例14治疗位点导向手术本发明所考虑到的另一种治疗应用就是抗TK1抗体还可用于位点导向手术的用途。染料和同位素导向手术是本领域技术人员已知的技术。由于抗TK1抗体粘附于癌性细胞表面，本发明还考虑使用抗TK1抗体清楚地标出癌性组织，以便外科医生可目视或以其它方式鉴别出感染组织，然后外科医生才能地利用最低限度的侵入性手术技术切除或破坏组织。使合适的染料与抗TK1 MAb结合。例如，用PET同位素(18F、124I或76Br)或者不透射线染料例如碘化合物，钡或硫酸钡或者泛影葡胺制剂(gastrografin)等。
可注射抗体还具有诊断和预后用途。在一个实施方案中，向患者注射放射性或不透射线染料标记的抗TK1抗体。抗TK1抗体与瘤组织结合后，使用已知技术例如PET、MRI、CT、SPECT等(参见Molecular Imagingof Gene Expression and Protein Function In Vivo With PET and SPECT，Vijay Sharma，PhD，Gary D.Luker，MD，and David Piwnica-Worms，MD，Ph.D.，JOURNAL OF MAGNETIC RESONANCE IMAGING 16336-351(2002))使其可视化。疾病的部位和扩散程度有助于癌症类型、部位和阶段的医学诊断。
实施例15用于治疗目的的使用单克隆抗体的试剂盒另外，本发明还考虑用于实行上述方法的使用方法和试剂盒。实行上述方法的试剂盒可包括一种或多种单克隆抗TK1抗体。在一个实施方案中，单克隆抗体可与其它试剂偶联或与其它试剂一起包装，所述其它试剂为当其被使用时对预期患者具有治疗作用的试剂例如免疫毒素或市售补体。
本领域技术人员应理解的是，在不脱离本发明的精神的情况下可作出多种和各种变换方案。因此，应得到明确理解的是，本发明的各种形式仅为说明性而非意在限制本发明的范围。
权利要求
1.一种治疗哺乳动物的癌症的方法，包括向所述哺乳动物给予包含针对S期调节蛋白的抗体或其片段的、足以抑制所述哺乳动物细胞增殖的量的药物组合物。
2.权利要求1的方法，其中所述抗体为抗TK1单克隆抗体。
3.权利要求2的方法，其中所述抗TK1单克隆抗体为CB001。
4.权利要求2的方法，其中所述抗TK1抗体为嵌合的、人源化或完全人单克隆抗体。
5.权利要求2的方法，其中所述药物组合物还包括第二种抗癌剂。
6.权利要求5的方法，其中所述第二种抗癌剂为核苷类似物。
7.权利要求6的方法，其中核苷类似物选自5，-氟尿嘧啶、氟达拉滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、吉西他滨、卡培他滨、曲沙他滨、齐多夫定/拉米夫定(Combivir)、恩曲他滨(Emtriva)、恩曲他滨(Epivir)、扎西他滨(Hivid)、齐多夫定(Retrovir)、阿巴卡韦/齐多夫定/拉米夫定(Trizivir)、去羟肌苷(Videx、VidexEC)、替诺福韦延胡索酸双异丙酰氧基甲酯(Viread)、司他夫定(Zerit)和阿巴卡韦(Ziagen)。
8.权利要求2的方法，其中所述抗TK1抗体与细胞毒性剂偶联。
9.权利要求8的方法，其中所述细胞毒性剂选自美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白树毒蛋白、肥皂草毒蛋白和α-帚曲霉素。
10.权利要求2的方法，其中在给予所述药物组合物前，所述哺乳动物用足量辐射处理以上调TK1表达。
11.权利要求2的方法，其中所述药物组合物还包含适于胃肠外给药的可药用液体载体。
12.权利要求11的方法，其中所述液体载体包括等渗盐水。
13.一种诊断哺乳动物的癌症的方法，包括从所述哺乳动物中获取样本；将所述样本与抗TK1抗体或其片段一同培养；检测抗体-TK1复合物的量；通过将抗体-TK1复合物的检出量与由使用已知量的TK1而产生的标准曲线比较从而对所述样本中的TK1的浓度定量；和基于所述样本中的TK1的浓度来诊断所述哺乳动物中癌症的存在。
14.一种针对TK1的单克隆抗体。
15.权利要求14的单克隆抗体，其中TK1为病毒的或哺乳动物的TK1。
16.权利要求14的单克隆抗体，其中TK1为TK1。
17.权利要求14的单克隆抗体，其中所述抗体特异性针对活性TK1。
18.权利要求14的单克隆抗体，其中所述抗体特异性针对无活性TK1。
19.权利要求14的单克隆抗体，其中所述抗体特异性针对TK1的多聚体形式。
20.权利要求14的单克隆抗体，其中所述抗体特异性针对TK1的单体形式。
21.权利要求14的单克隆抗体，其中所述抗体不与TK1的96kD亚单位反应。
22.权利要求14的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体可与TK1结合，但不影响TK1的酶活性。
23.一种制备抗TK1的单克隆抗体的方法，所述方法包括化学合成的TK1或其片段用作抗原的步骤。
24.权利要求23所述的方法，其中所述化学合成的TK1包括如SEQID NO2所示序列的至少一部分。
25.一种制备抗TK1的单克隆抗体的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码TK1的基因的至少一部分的步骤。
26.权利要求25的方法，其中所述编码TK1的基因如SEQ ID NO1所示。
27.权利要求14的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体为人源化的或完全人单克隆抗体。
28.一种确定患者体内瘤组织的部位和扩散的方法，包括向患者给予被标记的TK1抗体；可视化被标记的TK1抗体；和确定患者体内瘤组织的部位和扩散的程度。
29.权利要求28的方法，其中所述可视化通过PET、MRI、CT或SPECT实现。
30.权利要求28的方法，其中所述TK1抗体用荧光、放射性或不透射线染料标记。
31.权利要求28的方法，其中将确定患者体内瘤组织的部位和扩散程度的步骤用于外科手术方法，可使医生目视区分瘤组织和正常组织。
全文摘要
本发明公开了用于检测、诊断和治疗癌症的方法的胸苷激酶I的单克隆抗体。
文档编号G01N33/573GK101027085SQ200580024832
公开日2007年8月29日 申请日期2005年5月23日 优先权日2004年5月21日
发明者N·拉廷 申请人:杨伯翰大学