专利名称：D－二聚体测定用标准物质的制作方法
技术领域：
本发明涉及临床检查领域，特别是可以在D-二聚体测定中使用的D-二聚体测定用标准物质。
背景技术：
临床检查，特别是血液凝固-纤溶检查领域中，已知有测定D-二聚体的方法。D-二聚体是血液凝固分子标志物之一，通过对此的测定，对于获得凝血、纤溶系统亢进的各种栓塞症或DIC(弥漫性血管内凝血综合症)的诊断、上述疾病的病态把握或治疗效果判断等的指标是重要的。
所谓D-二聚体(D-dimer)，是血液中的纤维蛋白原受凝血酶等的作用而凝固形成的聚合物——稳定化纤维蛋白被纤溶酶之类的酶分解所得的纤维蛋白降解物，是DD/E级分和以此为基本单位的多聚体(XDP)的总称。DD/E级分的多聚体包括DXD/YY级分(DD/E级分的3聚体)、YXY/DXXD级分(DD/E级分的5聚体)、DXXD/YXXY级分(DD/E级分的7聚体)等。
在临床检查领域中，一般来说，是采用标准物质获得标准曲线，或者是使用精度管理用试剂以提高检查可靠性。在D-二聚体的检查中，由于是以人血浆作为检体，希望所使用的标准物质或者精度管理用试剂的反应性与人血浆处于同样程度。而且，由于优选使得作为测定对象的检体中的D-二聚体浓度处于定量点的范围内，为获得标准曲线的标准物质的浓度，为了使得也可以测定含有高浓度的D-二聚体的检体，很多情况下设定在正常值的上限以上。
以往，已知是把从人采取的血浆直接用作为标准物质或者精度管理用试剂。这样的标准物质，虽然从反应性相同这一方面是优选的，但是D-二聚体的浓度不稳定，或者其浓度低，对于获得期望的标准曲线来说还不够。此外，来自人的原料在稳定供应方面也存在问题。
栓塞症患者血浆中的D-二聚体，以往据认为是以分子量约23万的DD/E级分为主成分，不过近年来逐步发现，实际上是以DXD/YY级分、YXY/DXXD级分、DXXD/YXXY级分等分子量较高的多聚体为主成分的(参见非专利文献1和2)。但是，根据以往的D-二聚体级分的纯化方法(参见非专利文献3和4)得到的D-二聚体标准物质，是较多含有DD/E级分的物质，为适应实际的栓塞症患者的临床举动，希望获得较多含有高分子量的多聚体的D-二聚体测定用标准物质。
非专利文献1Dempfle CE，Zips S，Ergul H，Heene DL；FibrinAssay Comparative Trial study group.The Fibrin AssayComparison Trial(FACT)evaluation of 23 quantitative D-dimerassays as basis for the development of D-dimer calibrators.FACTstudy group.Thromb Haemost.(2001)85671～678非专利文献2Francis CW，Marder VJ，Martin SE；Plasmicdegradation of crosslinked fibrin.I.Structural analysis ofthe particulate clot and identification of new macromolecular-soluble complexes.Blood.1980 Sep；56(3)456～4非专利文献3Gaffney PJ，Edgell T，Creighton-KempsfordLJ，Wheeler S，Tarelli E；Fibrin degradation product(FnDP)assaysanalysis of standardization issues and target antigensin plasma.Br J Haematol.1995 May；90(1)187～19非专利文献4Olexa SA，Budzynski AZ；Primary solubleplasmic degradation product of human cross-linked fibrin.Isolation and stoichiometry of the(DD)E complex.Biochemistry.1979 Mar 20；18(6)991～995发明内容发明要解决的课题
为此，本发明的目的在于提供与人血浆的反应性达到同等程度的较多含有高分子量的D-二聚体的D-二聚体测定用标准物质。
解决课题的方法本发明是含有如下的纤维蛋白降解物的D-二聚体测定用标准物质，含有的分子量50万以上的纤维蛋白降解物的量，在通过凝胶过滤层析进行的分子量分析中，占总峰面积的70％以上。
本说明书中，所谓“纤维蛋白降解物”，是纤维蛋白被酶作用所得的降解物，包括DD级分、DD/E级分(分子量约23万)、DXD/YY级分(DD/E级分的3聚体)、YXY/DXXD级分(DD/E级分的5聚体)、DXXD/YXXY级分(DD/E级分的7聚体)之类的多聚体。
发明的效果本发明可以提供与栓塞症患者的临床举动相一致的D-二聚体测定用标准物质和D-二聚体测定用精度管理试剂，可以提高DIC或深部静脉血栓/肺栓塞症(DVT/PE)的诊断灵敏度和特异性。
图1图1所示为在获得本发明的D-二聚体测定用标准物质的级分步骤中凝胶过滤层析的280nm波长下的图示。
图2图2所示为本发明的D-二聚体测定用标准物质的凝胶过滤层析中280mm的波长下的图示。
图3图3所示为使用本发明的D-二聚体测定用标准物质和来自DIC患者的血浆，通过胶乳凝聚法测定D-二聚体量时的结果。
图4图4所示为本发明的D-二聚体测定用标准物质与来自栓塞症患者的血浆进行Western印迹的结果。
具体实施例方式
本发明的D-二聚体测定用标准物质，包含在通过凝胶过滤层析进行的分子量分析中，分子量50万以上的纤维蛋白降解物占总峰面积的70％以上、优选75％以上、更优选80％以上的纤维蛋白降解物。
作为分子量50万以上的纤维蛋白降解物，例如可举出DXD/YY级分、YXY/DXXD级分、DXXD/YXXY级分等，但不限于此。另外，这样的纤维蛋白降解物的分子量上限不特别限定，通常为200万左右。
上述通过凝胶过滤层析进行的分子量分析的条件如下。
柱Sephacryl S-300HR(Amersham Pharmacia Biotech公司制)、1.6×70cm洗脱液含有0.1M NaCl的50mM Tris-醋酸缓冲液、pH7.1流速＝0.375mL/分检测波长280nm流分容量1.5mL峰面积计算Peak Fit软件本发明的D-二聚体测定用标准物质可以通过包括以可分解纤维蛋白的酶作用于纤维蛋白的步骤(以下称为分解步骤)和所得的纤维蛋白降解物使用凝胶过滤层析级分的步骤(以下称为级分步骤)的方法得到。
作为原料所使用的纤维蛋白，可以使用市售品，也可以由纤维蛋白原加以制备。或者，也可以采用从纤维蛋白的氨基酸序列出发通过基因工程方法而制备者。作为由纤维蛋白原制备的方法，可以举出将含有纯化纤维蛋白原的溶液用凝血酶、XIII因子和钙盐作用的方法。该方法所得的纤维蛋白为凝胶状，可以直接用于分解步骤，也可以用冷冻干燥法等去除水分，再粉碎，将成为粉末形状的纤维蛋白用于分解步骤。
作为可分解纤维蛋白的酶，优选纤溶酶、尿激酶和弹性蛋白酶，也可以使用其中的2种以上的组合。
分解步骤中纤维蛋白和酶的混合比，优选纤维蛋白每1mg混合1～100mU的酶、更优选1～75mU、再优选5～50mU、特别优选10～20mU。
分解步骤中，纤维蛋白与酶的反应时间，优选1～24小时左右，更优选4～10小时左右。反应温度可以根据所用的酶的最适温度而适当选择，在使用纤溶酶、尿激酶和弹性蛋白酶的情况下，优选为约37℃。
在上述分解步骤的最终阶段，优选终止分解反应。作为终止分解反应的方法，只要是可以抑制酶活性的方法，没有特别限定，例如可以举出向反应体系中添加酶抑制剂的方法。作为优选的酶抑制剂，可以举出抑肽酶。
级分步骤中，作为凝胶过滤层析中所用的凝胶粒子，只要是蛋白质分离中通常所用者，就不特别限定，优选排阻限为分子量104～106者，特别优选Sephacryl S-300HR(Amersham Pharmacia Biotech公司)。
凝胶过滤层析中所用的洗脱溶剂，可以根据柱的种类适当选择，在使用上述的Sephacryl S-300HR的情况下，可以使用pH6～9左右的缓冲液，例如可举出Tris-醋酸缓冲液。
将所得的洗脱液以一定量的流分级分，通过在280nm波长下测定各流分的吸光度、确认流分中所含的蛋白质的分子量、分离高分子量的级分，可以获得期望的纤维蛋白降解物。确认蛋白质分子量的方法，只要是迄今公知的方法，则不特别限定，例如可举出非变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法、凝胶过滤层析法等。
所得的纤维蛋白降解物中的D-二聚体收率优选在30％以上，更优选40％以上、特别优选在50％以上。
本发明的D-二聚体测定用标准物质，可以以如上所得的纤维蛋白降解物本身、或者通过用适当的稀释液稀释、或者浓缩，将浓度适当调整而使用。此外，如上所得的纤维蛋白降解物也可以进行冷冻干燥，在使用时添加缓冲液而使用。
本发明的D-二聚体测定用标准物质可以含有缓冲液、蛋白质稳定剂(例如牛血清白蛋白(BSA)等)、pH调节剂、防腐剂(例如叠氮化钠、抗生素等)等。
作为缓冲液，优选在pH5～10、优选在pH6～9具有缓冲作用者，可以举出磷酸缓冲液、咪唑缓冲液、三乙醇胺-盐酸、GOOD缓冲液等。作为GOOD缓冲液，可以举出MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、Bis-Tris-Propane、ACES、MOPS、MOPS0、BES、TES、HEPES、HEPPS、Tricine、Tris、Bicine、TAPS等各种缓冲液。特别优选Tris。
本发明的D-二聚体测定用标准物质在D-二聚体的测定中，可以作为标准物质或者精度管理用试剂中的任一种而使用。
D-二聚体的测定法，只要是本领域通常所用的方法，没有特别限制，可以举出胶乳凝聚法、ELISA等。
实施例以下举出实施例对本发明进行具体说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例中使用以下的测定方法。
蛋白质浓度测定通过在280nm下测定吸光度，用生理盐水将蛋白质溶液的蛋白质浓度稀释为100～700μg/mL，可以使用吸光度法(系数1.37；《初步重组蛋白质纯化手册》(はじめての組換え蛋白质の精製ハンドブツク)、Amersham Pharmacia Biotech出版)、Lowry法(Bio-Rad公司制试剂盒，Lowry OH，Rosebrough NJ，Farr AL，Randall RJ.Proteinmeasurement with the folin phenol reagent.J Biol Chem(1951)193265～275)或者Bradford法(Bio-Rad公司制试剂盒；《DC蛋白质分析的操作方法》(DCプロテインアツセイの操作法)，日本Bio-Rad公司出版)的任一种方法进行测定。作为标准品，使用来自BSA由来的标准品(Bio-Rad公司制)。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使用5～10％梯度聚丙烯酰胺凝胶、MINI-PROTEIMI电泳装置(Bio-Rad公司制)，在非还原下进行。蛋白质染色使用考马斯亮蓝(CBB)试剂盒(Bio-Rad公司制)进行。高分子量蛋白质与低分子量蛋白质的比例采用PhotoCaptMW(Ver99.03)软件，通过图像解析算出。
实施例1(1)纤维蛋白的制备由起始原料的人纤维蛋白原出发，按以下次序制备纤维蛋白块。精制纤维蛋白原原料(Enzyme Research Laboratories公司制)溶于50mM TBS(Tris 50mM、NaCl 0.15mM、pH7.4)使浓度达到5mg/mL，加入氯化钙(最终浓度25mM、Kishida化学公司制)、XIII因子(最终浓度10μg/ml、Fibrogammin制剂)后，添加人凝血酶(最终浓度2U/ml、三菱ウエルフア一マ公司制)。将此混合物在37℃温育18小时，得到凝胶状的纤维蛋白。所得凝胶用50mM的TBS(pH 7.4)洗1小时，去除水分后，移入玻璃茄形瓶中，用PE2049型冷冻干燥装置(目本真空技术公司制)冷冻干燥、粉碎，得到纤维蛋白粉末。
(2)分解步骤所得的纤维蛋白粉末700mg加入50mL容量聚丙烯容器中，添加50mM TBS(pH7.4)35mL，溶解纤维蛋白使其浓度达到20mg/mL。向该溶液中添加纤溶酶(P4895、Sigma公司制)(最终浓度10mU/mL)、在37℃搅拌6小时。加入抑肽酶(拜耳公司制)使之最终浓度为1000U/ml后，以10,000×g、9℃离心分离15分钟，得到上清(粗D-二聚体级分)。
(3)级分步骤上述分解步骤得到的粗D-二聚体级分上SephacrylS-300HR柱(1.6×70cm120mLl Amersham Pharmacia Biotech公司制)，所述柱已经用3倍柱容量的Tris-醋酸(pH7.1)缓冲液(流速0.375mL/分)平衡化，蛋白质上样量为80mg。以含有抑肽酶100KIU/mL和0.1M NaCl的50mM Tris-醋酸(pH7.1)缓冲液作为洗脱液，流速0.375mL/分进行洗脱。其中，使用蓝色葡聚糖(blue dextran)(Amersham PharmaciaBiotech公司制)作为空白标志物。按1.5mL进行级分，对所得流分在280nm波长下测定吸光度。所得结果如图1所示。
预先使用已知分子量的蛋白质考察分子量与流分的关系时，在流分号30、40、50和60时，分别洗脱出分子量约100万、分子量约50万、分子量约20万和分子量约10万的蛋白质。
此外，按照上述(1)～(3)同样方式重复3次，凝胶过滤柱层析后所得洗脱图显示完全相同的模式(图1)，确认上述操作次序的重现性。
蓝色葡聚糖洗脱后，回收280nm吸光度从最初峰到第3根的流分(图1中流分27～39)，得到D-二聚体测定用标准物质。测定所得的D-二聚体测定用标准物质中蛋白质的量，为42.4mg，收率为53％。
此外，将此D-二聚体测定用标准物质以同级分步骤相同的条件进行凝胶过滤层析。对所得的流分测定280nm波长下的吸光度的结果如图2所示。
在预先使用已知分子量的蛋白质考察分子量与流分关系时，在流分号30、40、50和60，分别洗脱了分子量约100万、分子量约50万、分子量约20万和分子量约10万的蛋白质。因此，到流分号40为止的峰面积用Peak Fit软件计算时、为总峰面积的83％。
试验例1实施例1所得的D-二聚体测定用标准物质用含3％(w/v)BSA的磷酸缓冲液(pH7.5)分别梯度稀释到1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32，用以下的胶乳凝聚法测定D-二聚体量。同样，30μg/mL左右的浓度DIC患者血浆(3检体)梯度稀释，用以下的胶乳凝聚法测定D-二聚体量。
以胶乳凝聚法测定D-二聚体量的方法首先，制备用识别D-二聚体的单克隆抗体致敏的胶乳粒子。将10％(w/v)聚苯乙烯胶乳悬浮液(积水化学公司制，粒径0.245μm)0.5mL加入含有通过保藏编号FERMP-19867的、在独立行政法人产业技术综合研究所保藏的杂交瘤细胞所产生的识别D-二聚体的单克隆抗体——DD-M1653抗体的磷酸缓冲液(pH7.5)2.0mL(抗体浓度0.625mg/mL)中，用Vortex混合器混合。将该混合液离心分离(25,000×g、20分钟)，悬浮于含1％(w/v)BSA的MOPSO缓冲液(pH7.1)2.5mL中。该悬浮液离心分离(25,000×g、20分钟)，悬浮于含2％(w/v)BSA的MOPSO缓冲液(pH7.1)40mL中，得到含有固定了DD-M1653抗体的胶乳粒子的试剂。
本发明的D-二聚体测定用标准物质用含3％(w/v)BSA的磷酸缓冲液(pH7.5)稀释的溶液和作为阴性对照的含3％(w/v)BSA磷酸缓冲液(pH7.5)各14μL，与含聚乙二醇MOPSO缓冲液(pH7.1)84μL混合，37℃反应5分钟。向其中添加上述含有单克隆抗体结合胶乳粒子的试剂84μL，在800mm波长下，测定每1分钟吸光度的变化量。
结果如图3所示。
图3中所用试样及其稀释前的浓度如下来自DIC患者的检体DIC患者A浓度33μg/ml；DIC患者B浓度28μg/ml；DIC患者C浓度31μg/ml；本发明的D-二聚体测定用标准物质DD标准物质A浓度32μg/ml；DD标准物质B浓度31μg/ml；DD标准物质C浓度32μg/ml。
从图3结果可见，本发明的D-二聚体测定用标准物质可以用于采用胶乳凝聚法进行的D-二聚体量的测定，而且，可以获得与稀释比例相应的标准曲线。进一步可见，对从DIC患者的血浆所得的结果也显示同样的标准曲线模式。
另外，对于按实施例1操作方法重复3次得到的3批不同批次的D-二聚体测定用标准物质(DD标准物质A、B和C)，胶乳凝聚法均获得同样结果(图3)。
试验例2本发明的D-二聚体测定用标准物质与栓塞症患者血浆中的D-二聚体级分电泳模式的比较使用实施例1所得的D-二聚体测定用标准物质和诊断为栓塞症患者的血浆用クロツト分离器(希森美康公司制)血清化后的试样，将其用1％(w/v)SDS溶液稀释4倍在含0.1％(w/v)SDS的7.5％聚丙烯酰胺凝胶上用60伏特的恒电压展开2.5小时。缓冲液使用含0.02％(w/v)SDS的25mM Tris-192mM甘氨酸缓冲液(pH7.5)。
该凝胶上贴合PVDF(聚偏氟乙烯)膜(Amersham PharmaciaBiotech公司制)，通以1mA/cm2的电流，用3小时转移蛋白质。之后，将膜浸在含有封闭液(5％脱脂乳、1％(w/v)BSA、0.1％(w/v)叠氮化钠的PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、8.1mM Na2HPO4))，振荡30分钟。弃去封闭液，用含0.05％(w/v)Tween20的PBS(洗涤液)5分钟、洗3次。将膜浸入含有作为1次抗体的兔抗纤维蛋白原多克隆抗体(グコサイトメトリ-公司制)100μg/mL和0.05％(w/v)Tween20的PBS中，振荡60分钟。用洗涤液洗5分钟、3次后，将膜浸入含作为2次抗体的HRP(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗兔抗体(グコサイトメトリ一公司制)100μg/mL和0.05％(w/v)Tween20的PBS，振荡60分钟。将膜用洗涤液洗5分钟、3次后，使用4-氯-1-萘酚和过氧化氢，用HRP标记试剂盒(Bio-Rad公司制)使蛋白质的条带可视化。
结果如图4所示。
图4所示检体如下带1分子量标志物；带2本发明的D-二聚体测定用标准物质；带3纤维蛋白降解物中，X级分、Y级分、D级分、E级分和DD级分(森永生化学研究所社制)；带5～22来自栓塞症患者的检体。
从图4结果可见，本发明的D-二聚体测定用标准物质，显示与栓塞症患者的检体近似的D-二聚体分布。
工业实用性根据本发明，可以提供使D-二聚体标准化的物质，对D-二聚体测定的临床检查的精度管理或测定误差的判断有贡献。
权利要求
1.含有在通过凝胶过滤层析进行的分子量分析中，总峰面积的70％以上为分子量50万以上的纤维蛋白降解物的D-二聚体测定用标准物质。
2.权利要求1的标准物质，其中，还含有缓冲液。
3.权利要求1的标准物质，其中，所述缓冲液具有5～10的pH。
4.权利要求1的标准物质，其中，还含有蛋白质稳定剂。
5.权利要求4的标准物质，其中，所述蛋白质稳定剂是BSA。
6.权利要求1的标准物质，其中，所述纤维蛋白降解物在通过凝胶过滤层析进行的分子量分析中，总峰面积的75％以上为分子量50万以上。
7.权利要求1的标准物质，其中，所述纤维蛋白降解物在通过凝胶过滤层析进行的分子量分析中，总峰面积的80％以上为分子量50万以上。
8.权利要求1的标准物质，其中，所述纤维蛋白降解物是纤维蛋白被选自纤溶酶、尿激酶和弹性蛋白酶至少之一的酶作用所得的。
9.权利要求1的标准物质，是用作为D-二聚体测定精度管理用试剂的。
10.如下所述的D-二聚体测定用标准物质的制造方法使纤维蛋白被分解纤维蛋白的酶作用的分解的步骤；对所得的纤维蛋白降解物，采用凝胶过滤层析使得分子量50万以上的成分含有70％以上的级分步骤；和使用级分了的纤维蛋白降解物制备D-二聚体测定用标准物质的步骤。
11.权利要求10的制造方法，其中，所述酶是选自纤溶酶、尿激酶和弹性蛋白酶的至少一种。
12.权利要求10的制造方法，其中，所述D-二聚体测定用标准物质含有缓冲液。
13.权利要求12的制造方法，其中，所述缓冲液具有5～10的pH。
14.权利要求10的制造方法，其中，所述D-二聚体测定用标准物质含有蛋白质稳定剂。
15.权利要求14的制造方法，其中，所述蛋白质稳定剂是BSA。
全文摘要
本发明的课题是提供D－二聚体测定用标准物质，本发明通过含有如下的纤维蛋白降解物的D－二聚体测定用标准物质实现在通过凝胶过滤层析进行的分子量分析中，总峰面积的70％以上为分子量50万以上的纤维蛋白降解物。
文档编号G01N33/68GK1825119SQ200610009520
公开日2006年8月30日 申请日期2006年2月24日 优先权日2005年2月25日
发明者奥田昌宏, 竹下浩生 申请人:希森美康株式会社