专利名称：慢性髓系白血病细胞kt－1/a3特异性靶向短肽系列及其筛选的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，涉及蛋白质多肽，具体涉及可与慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)细胞KT-1/A3特异性结合的短肽系列。
背景技术：
慢性髓系白血病又称为慢性粒细胞性白血病，是起源于骨髓多能干细胞的一种较为常见的恶性克隆的骨髓增生性疾病，在我国占所有白血病的18％左右，可发于任何年龄，最常见于成年人。
干扰素-α(IFN-α)是目前治疗CML的主要药物，具有多方面抗肿瘤的作用，包括抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡以及调节免疫系统对抗肿瘤等。在CML慢性期病人中单用IFN-α可使70％～80％的患者达到完全血液学缓解；30％～40％的患者达到主要细胞遗传学反应；20％～25％的患者获得完全细胞遗传学缓解。但干扰素并不是对所有的患者均有效，其耐药的比率很高。目前IFN-α治疗CML的作用机制尚未完全阐明，因此，寻找干扰素敏感株的细胞特异性表达的膜表面分子，探讨IFN-α对CML细胞的抑制效应显得十分有必要。
噬菌体展示技术(phage display Technology)产生于二十世纪八十年代中期，该技术的原理是利用DNA重组技术将大量的多肽编码序列导入噬菌体的衣壳蛋白基因中，将遗传密码信息整合到噬菌体的基因组中，使插入序列编码的外源蛋白质或肽的表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合，展示在噬菌体表面并保持相对独立的空间结构和生物学活性。这个技术的最大优点是直接将研究的外在表达蛋白与其基因联系在一起，利用蛋白质与筛选对象的特异性亲和力，通过将所感兴趣的肽链挑选出来，同时方便地获得其编码序列，从而得知肽链的氨基酸序列(Hassan M.E，W.Edward HighsmithPhage displaytechnologyclinical applications and recent innovations.Clinical Biochemistry，2002，35(6)425-445)。
噬菌体肽库是由大量带有不同肽段的单个噬菌体组成的重组噬菌体库，筛选噬菌体肽库的基本原理是将随时机肽段插入到噬菌体衣壳蛋白上形成融合蛋白而展示出来，并利用噬菌体能大量复制的特点，得到不同重组噬菌体的多拷贝，为不同的研究提供有利的工具。通过目标受体来筛选与其相互作用的噬菌体肽，经过洗脱、扩增，从而富集到特异性的重组噬菌体，并分析所筛选到的肽的序列和结构，为蛋白质分子之间(抗原与抗体、受体与配体、酶与底物)的相互作用机理提供理论依据。近年来，噬菌体展示技术已用于噬菌体随机短肽库、噬菌体抗体库、多肽构象库、cDNA表达展示库等的构建和筛选，在识别蛋白质或受体的小肽序列的鉴定上、在结构和功能上模拟已知蛋白质的多肽模拟物的研究上、在筛选鉴定与人类病毒、细胞、组织及肿瘤等生物靶系统结合的多肽研究日益增加。
采用完整细胞作为靶分子，从肽库中同样能够筛选细胞表面分子的结合肽这一方法具有很大优点展现的肽更有可能呈现本来的构象，如果是较长的肽链或是蛋白质，则会呈现天然构型，肽链无需经过纯化；筛选时也不必预先了解受体的结构，当目标是细胞特异性或是组织特异性的细胞表面分子时，甚至无须知道结合的分子到底是哪种。由于在细胞表面表达的多种蛋白质都会与噬菌体呈一定程度的结合，而需要筛选的靶抗原是特异性抗原，因此需要用2个细胞系进行筛选(即正负淘选)。先通过不含靶抗原的细胞预先吸附，不结合的噬菌体再与含靶抗原的细胞筛选，亲和的噬菌体进行下一轮筛选，最终得到特异性亲和肽，即筛选抗原阳性细胞之前先筛选抗原阴性细胞，以去除这些非特异性抗原的影响(Kathlynn CB.New approaches forcell-specific targetingidentification of cell-selectivepeptides from combinatorial libraries.Current Opinion inChemical Biology，2000，4(1)16-21.)。
经检索PubMed资料库，迄今为止尚未发现用噬菌体展示技术筛选与慢性髓系白血病细胞KT-1/A3特异性结合短肽系列的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供与慢性髓系白血病细胞KT-1/A3特异性结合的四个短肽，是利用噬菌体展示技术筛选的7肽系列，其序列分别为KMSNSIY、KLWVIPQ、KLYTPVD和QHLWAPR。
本发明的另一目的在于提供一种与慢性髓系白血病细胞KT-1/A3特异性结合短肽的筛选方法，该方法包括以下步骤A.取8×106个对数生长期的KT-1/A3R细胞，加入1ml封闭液A(含2％脱脂干奶粉的PBS)，37℃下静置30min，再加入10μl滴度约3×1013pfu·ml-的原始文库噬菌体，轻摇90min，2,500g离心8min，吸取上清保存。
B.取对数生长期的KT-1/A3细胞4×106个，加入1ml封闭液A静置30min，离心弃上清。向其中加入上一步骤中上清液，37℃轻摇130min，2,500g离心8min后弃上清。
C.用含0.1％Tween-20的PBS洗涤液洗细胞10次，洗后离心沉淀细胞，加入500μl洗脱液(0.1mol·L-1甘氨酸-HCl，0.1％BSA，pH＝2.5)，室温孵育5min，1,000g离心2min，吸取上清，立即加入20μl1mol·L-1的Tris中和。
D.取上一步中少量液体以常规计数法测滴度，其余置于对数前期的ER2738菌液中扩增，严格控制条件进行下一轮筛选(见实施例表1)。
E.对第4轮筛选后随机挑选的210个噬菌体克隆用细胞ELISA方法进行初步鉴定，其中6个候选噬菌体克隆与KT-1/A3细胞的结合率高于其他白血病细胞株，分别命名为A40、A42、A50、A28、A83、A84。
F.候选噬菌体DNA提取、纯化和测序常规方法提取并纯化单链DNA后送上海生工公司测序。结果表明其中A40、A42、A50三个克隆编码序列相同，七肽序列为KMSNSIY，其他三个克隆编码序列分别为KLWVIPQ、KLYTPVD和QHLWAPR。
本发明采用对干扰素不敏感株KT-1/A3R细胞作为预吸附细胞，以干扰素敏感的慢粒白血病细胞株KT-1/A3细胞作为靶细胞，正负筛选噬菌体随机肽库，随机挑选噬菌体肽单克隆，通过细胞ELISA进行初步验证，其中6个候选噬菌体克隆与KT-1/A3细胞的结合率高于其他白血病细胞株，流式细胞学检测进行再次验证，确认了这6个单克隆噬菌体和KT-1/A3细胞的结合具有一定的特异性，进而测序得到4个展示在噬菌体上的七肽序列。结果表明，本发明的七肽系列可与慢性髓系白血病细胞KT-1/A3细胞特异性结合，在白血病的诊断、靶向治疗等方面具有重大的潜在应用价值。
本发明所述的与慢性髓系白血病细胞KT-1/A3特异性结合短肽系列的筛选方法，通过降低每轮筛选时加入的靶细胞KT-1/A3的数量、增加预吸附细胞KT-1/A3R的数量，并严格控制其他筛选条件，使噬菌体随机肽库中与靶细胞即KT-1/A3结合的阳性噬菌体递增，最终得到6个与KT-1/A3高度特异性结合的候选噬菌体克隆。
附图1与不同白血病细胞株孵育时单克隆噬菌体吸光度与阴性对照的比值(n＝4)附图2流式细胞学检测噬菌体与KT-1/A3与KT-1/A3R细胞的结合能力(a)KT-1/A3对照细胞；(b)KT-1/A3R对照细胞(c)、(d)噬菌体A28分别与KT-1/A3和KT-1/A3R细胞孵育结果(e)、(f)噬菌体A83分别与KT-1/A3和KT-1/A3R细胞孵育结果(g)、(h)噬菌体A40分别与KT-1/A3和KT-1/A3R细胞孵育结果(i)、(j)噬菌体A42分别与KT-1/A3和KT-1/A3R细胞孵育结果(k)、(l)噬菌体A50分别与KT-1/A3和KT-1/A3R细胞孵育结果(m)、(n)噬菌体A84分别与KT-1/A3和KT-1/A3R细胞孵育结果附图3阳性噬菌体单链DNA琼脂糖凝胶电泳图具体实施方式
实施例一特异性结合慢性髓系白血病细胞KT-1/A3短肽的筛选v1、材料、试剂及主要仪器1)噬菌体展示肽库和菌株以丝状噬菌体M13为载体构建的噬菌体展示随机7肽库购自New England BioLabs公司，肽库滴度为2×1013pfu·ml-1，受体菌E.coli ER2738为四环素抗性的雄性大肠杆菌。
2)细胞株慢性髓系白血病细胞KT-1/A3、KT-1/A3R细胞由日本爱媛大学Ikuya Sakai教授惠赠；慢性髓系白血病细胞K562和急性早幼粒细胞性白血病细胞HL60由中南大学生物科学与技术学院生物化学系常规冻存。
3)主要试剂蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉购自OXOID公司；吐温-20、PEG-8000、左旋多聚赖氨酸(6×)、脱脂干奶粉、二甲基甲酰胺购自Amresco公司；IPTG、X-gal购自Genview公司；小牛血清购自杭州四季青公司；RPMI1640培养基(粉剂)、盐酸四环素购自Sigma公司；ABTS购自Amersham Pharmacia Biotech公司；小牛血清白蛋白购自Roche公司；戊二醛、柠檬酸钠等化学试剂均为国产分析纯。
4)抗体辣根过氧化物酶(HRP)标记的绵羊抗M13抗体、未标记的小鼠抗M13抗体购自Amersham Pharmacia Biotech公司；FITC标记的山羊抗小鼠抗体购自北京鼎国生物技术公司。
5)测序引物“-96gIII”(插入序列上游第96位起始)引物购自New England BioLabs公司，序列为5’-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’。
6)主要仪器流式细胞仪(Becton Dickinson，FACSCalibur型)；酶标仪(芬兰雷勃，354-00625型)；台式高速冷冻离心机(Eppendorf)；CO2培养箱(SHEL-LAB)；倒置显微镜(Olympus，CKX41)；超低温冰箱(Forma Scientific)；恒温细菌培养箱、超净工作台、恒温水浴箱、恒温摇床、磁力搅拌器等均为国产设备。
2、方法1)慢性髓系白血病细胞KT-1/A3、KT-1/A3R、K562和急性早幼粒细胞性白血病HL60细胞均以含10％小牛血清的RPMI1640培养基于37℃、5％CO2条件下充湿培养。
2)对数生长期的KT-1/A3R细胞以PBS洗涤3次，计数后取8×106个细胞，加入1ml封闭液(含2％脱脂干奶粉的PBS)37℃下静置30min，再加入10μl原始文库噬菌体(滴度约3×1013pfu·ml-1)，轻摇90min，2,500g离心8min，吸取上清保存。
3)取对数生长期的KT-1/A3细胞以PBS洗涤3次，计数后取4×106个细胞，加入1ml封闭液A静置30min，离心弃上清。向KT-1/A3细胞中加入2)中上清，37℃轻摇130min；2,500g离心8min后，弃去上清。
4)用洗涤液(含0.1％Tween-20的PBS)洗细胞10次，洗后离心沉淀细胞，加入500μl洗脱液(0.1mol·L-1甘氨酸-HCl，0.1％BSA，pH＝2.5)，室温孵育5min，1,000g离心2min，吸取上清，立即加入20μlTris(1mol·L-1)中和。
5)取少量洗脱液测滴度，其余置于20～40ml对数前期的ER2738菌液中扩增，进行下一轮筛选，同样的操作共进行4轮筛选。筛选条件严格按照表1进行。
表1肽库四轮筛选的条件优化
实施例二特异性结合慢性髓系白血病细胞KT-1/A3短肽的鉴定1、细胞ELISA法初步筛选1)ABTS底物溶液配制用0.05mol·L-1柠檬酸溶液(pH4.0)450ml溶解100mg ABTS粉末，过滤除菌后，4℃避光保存；使用前向21ml中加入30％H2O236μl。
2)酶标板预处理用双蒸水将6×左旋多聚赖氨酸溶液稀释6倍成为使用浓度，每孔250μl包被酶标板1h，37℃烘干；使用前紫外灯照射杀菌。
3)悬浮细胞固定四株白血病细胞均用PBS清洗3遍后重悬于PBS中，密度为2×106·ml-1，按照每孔2×105加入96孔酶标板中，37℃静置4～5h。每孔加入固定液100μl(含0.25％戊二醛的PBS)固定10～15min，弃去上清，PBS洗3遍。
4)封闭酶标板每孔加入封闭液B(含4％脱脂奶粉的PBS)37℃封闭1h，PBS洗涤3次。另外，用等体积的封闭液B稀释单克隆噬菌体，静置15～30min。
5)候选噬菌体与细胞孵育实验组每孔分别加入候选的单克隆噬菌体稀释液200μl(每孔噬菌体约2×1012pfu)；阴性对照组则加入等体积辅助噬菌体M13K07；空白对照不加任何噬菌体，只加入等体积的封闭液B；均设4复孔。以60～80rpm在37℃摇床上轻摇2h，用洗涤液B(含0.05％吐温-20的PBS)洗涤6次。
6)加入抗体在封闭液B中以1∶5,000比例稀释的HRP标记的抗-M13抗体，每孔加入200μl稀释抗体，以60～80rpm在室温轻摇1h，洗涤6次。
7)显色加入200μl ABTS底物溶液，室温避光孵育20～60min后，酶标仪记录405～415nm处的吸光值。实验重复3次(n＝4×3＝12)，吸光度取其平均值。
对第4轮筛选后随机挑选的210个噬菌体克隆用细胞ELISA方法进行初步鉴定，A＝A405单克隆噬菌体/A405阴性对照，以A值大于2判定为阳性。结合KT-1/A3细胞的阳性克隆为67个。相对于阴性对照，以候选噬菌体克隆与四株细胞结合的比值绘图。结果表明这些克隆与KT-1/A3的结合能力明显强于其与KT-1/A3R、K562、HL60细胞的结合能力(附图1)。
2、阳性克隆进行流式细胞学分析1)预封闭细胞取足量的KT-1/A3和KT-1/A3R细胞悬液离心去培基，PBS洗三遍，用含10％胎牛血清的RPMI1640预封闭30min，同时两株细胞计数，在24孔板中分装细胞为每孔5×106。
2)预封闭单克隆噬菌体取单克隆噬菌体2.0×1011pfu，加入封闭液C(含3％BSA的PBS)预封闭10～30min。
3)噬菌体和细胞共孵育细胞中加入单克隆噬菌体为实验组，加入等体积封闭液C的作为空白对照，37℃作用8h，细胞用洗涤液C(含1％BSA、0.03％NaN3的PBS)洗2遍。
4)加入一抗用封闭液C稀释小鼠抗M13抗体100倍，4℃静置15～30min。每孔细胞加入小鼠抗M13抗体250μl，4℃孵育1h，用洗涤液C洗2遍。
5)加入二抗FITC-抗小鼠抗体用封闭液稀释50倍，4℃避光静置15～30min。每孔细胞加入FITC-抗小鼠抗体250μl，4℃避光孵育40～60min。
6)标记荧光的检测细胞用洗涤液洗2遍后用500μl洗涤液重悬，用流式细胞仪检测标记荧光的细胞比率。
将初筛的6个克隆对KT-1/A3和KT-1/A3R细胞进行流式细胞学分析，如附图2所示，M1区表示未加荧光标记的抗体时细胞的自发光检测区域，M2区则表示除去自发光以外，能检测到的标记荧光区域，峰下的面积表示细胞数目；附图2左边均是KT-1/A3细胞株的空白对照组和加噬菌体处理组，右边为KT-1/A3R细胞株的空白组和相应处理组。可见左边的KT-1/A3细胞和噬菌体结合后，相对空白对照，峰右移，处于M2区的面积增加，表示标记荧光的细胞数占被检测细胞数的比例增加，KT-1/A3细胞能标上荧光的比例为26.44～45.45％。右边的KT-1/A3R峰值也稍有右移，幅度不及KT-1/A3，因此处于M2区的面积增加较小，被标记荧光的细胞比例仅为3.78～14.77％，远低于前者。结果表明六个噬菌体克隆与KT-1/A3的结合率比KT-1/A3R高，其中A84的差异结合最明显(见表2)，再次验证了细胞ELISA结果。
表2流式细胞学检测噬菌体与KT-1/A3、KT-1/A3R细胞的结合能力
3、噬菌体DNA提取、纯化和测序1)阳性克隆噬菌体贮液制备将挑选的各个阳性克隆调整成适度的滴度铺板于LB/IPTG/X-gal平板上，挑出阳性克隆噬菌斑分别扩增，作为阳性克隆噬菌体贮液。
2)单链DNA提取取约30μl阳性噬菌体贮液加入约30ml对数前期的ER2738细胞培养物中分别将其扩增，离心除去细菌，加入1/6体积的PEG/NaCl沉淀过夜。8,000g离心15min。弃去上清液，沉淀物用1ml LB培养基重悬，再次离心除菌。吸取上清，加200μlPEG/NaCl，颠倒混匀，室温放10min。10,000g离心10min，弃上清液，短暂离心，小心吸去残余上清。沉淀物彻底重悬于200μl溶解缓冲液[10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，4M NaCl]中，加入400μl TE[10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA]混匀。
3)DNA纯化加入800μl苯酚∶氯仿(Vol∶Vol＝1∶1)振荡30s，静置1min，再振荡30s，9,000g离心3～5min，小心吸取上层水相。加入等体积的氯仿，振荡后离心，再次吸取上层水相。加入800μl乙醇，室温温育10min。12,000g离心10min，弃上清。用70％的乙醇洗沉淀，离心弃上清。短暂干燥后，沉淀重悬于40μl TE中。
4)电泳验证各取约8μl用0.8％琼脂糖凝胶在100V电压的电场中电泳60～75min，检测DNA质量，由于单链DNA与双链DNA在琼脂糖凝胶中电泳时速率没有可比性，故加入7250个核苷酸的单链M13DNA作为分子量标准，凝胶成像可见片段大小准确，条带清晰，适合测序(附图3)。
5)测序使用试剂盒中测序引物-96gIII送上海生工公司测序。测序发现，六个七肽噬菌体克隆中A40、A42和A50这三个克隆编码序列相同，七肽序列为KMSNSIY，其余三个噬菌体克隆A28、A84、A83分别为KLWVIPQ、KLYTPVD和QHLWAPR。
氨基酸序列表SEQUENCE LISTING<110>中南大学<120>慢性髓系白血病细胞KT-1/A3特异性靶向短肽系列及其筛选<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>7<212>PRT<213>噬菌体(M13 Phage)<400>1Lys Met Ser Asn Ser Ile Tyr1 5<210>2<211>7<212>PRT<213>噬菌体(M13 Phage)<400>2Lys Leu Trp Val Ile Pro Gln1 5<210>3<211>7<212>PRT<213>噬菌体(M13 Phage)<400>3Lys Leu Tyr Thr Pro Val Asp1 5<210>4<211>7<212>PRT
氨基酸序列表<213>噬菌体(M13 Phage)<400>4Gln His Leu Trp Ala Pro Arg1 权利要求
1.慢性髓系白血病细胞KT-1/A3特异性靶向短肽系列，其特征在于四个短肽序列分别为KMSNSIY、KLWVIPQ、KLYTPVD和QHLWAPR。
2.实现权利要求1所述的慢性髓系白血病细胞KT-1/A3特异性靶向短肽系列的筛选方法，其特征在于包括以下步骤A.取8×106个对数生长期的KT-1/A3R细胞，加入1ml封闭液A(含2％脱脂干奶粉的PBS)，37℃下静置30min，再加入10μl滴度约3×1013pfu.ml-的原始文库噬菌体，轻摇90min，2,500g离心8min，吸取上清保存。B.取对数生长期的KT-1/A3细胞4×106个，加入1ml封闭液A静置30min，离心弃上清。向其中加入上一步中上清液，37℃轻摇130min，2,500g离心8min后弃上清。C.用含0.1％Tween-20的PBS洗涤液洗细胞10次。洗后离心沉淀细胞，加入500μl洗脱液(0.1mol.L-1甘氨酸-HCl，0.1％BSA，pH＝2.5)，室温孵育5min，1,000g离心2min，吸取上清，立即加入20μl 1mol.L-1的Tris中和。D.取上一步中少量液体以常规计数法测滴度，其余置于对数前期的ER2738菌液中扩增，进入下一轮筛选，改变条件共进行4轮筛选。E.对第4轮筛选后随机挑选的210个噬菌体克隆用细胞ELISA法进行初步筛选鉴定，发现其中6个候选噬菌体克隆与KT-1/A3细胞的结合率明显高于其他白血病细胞株。F.采用常规方法提取并纯化候选噬菌体单链DNA，送上海生工公司测序。
3.如权利要求2所述的慢性髓系白血病细胞KT-1/A3特异性靶向短肽系列的筛选方法，其特征在于第二轮筛选时加入KT-1/A3R细胞数目为8×106，第三轮和第四轮筛选时加入KT-1/A3R细胞数目为1×107。
4.如权利要求2所述的慢性髓系白血病细胞KT-1/A3特异性靶向短肽系列的筛选方法，其特征在于第二、三、四轮筛选时加入KT-1/A3细胞数目依次为3×106、2×106、1×106。
5.如权利要求2所述的慢性髓系白血病细胞KT-1/A3特异性靶向短肽系列的筛选方法，其特征在于第二、三、四轮筛选吸附时间依次为120min、150min、150min。
6.如权利要求2所述的慢性髓系白血病细胞KT-1/A3特异性靶向短肽系列的筛选方法，其特征在于第二、三、四轮筛选孵育时间依次为120min、90min、90min。
7.如权利要求2所述的慢性髓系白血病细胞KT-1/A3特异性靶向短肽系列的筛选方法，其特征在于第二、三、四轮筛选洗脱时间依次为7min、9min、10min。
8.如权利要求2所述的慢性髓系白血病细胞KT-1/A3特异性靶向短肽系列的筛选方法，其特征在于第二、三、四轮筛选加入Tween-20的浓度依次为0.3％、0.5％、0.6％。
9.如权利要求1所述的慢性髓系白血病细胞KT-1/A3特异性靶向短肽系列用于制备白血病诊断试剂或肿瘤导向药物的用途。
全文摘要
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及与慢性髓系白血病细胞KT－1/A3特异结合的短肽及其筛选方法，本发明所述的与KT－1/A3细胞特异结合的四个短肽序列分别为KMSNSIY、KLWVIPQ、KLYTPVD和QHLWAPR。本发明利用噬菌体展示技术，采用对干扰素不敏感株KT－1/A3R细胞作为预吸附细胞，以干扰素敏感株KT－1/A3细胞作为靶细胞，正负筛选噬菌体随机肽库，最终在随机七肽库中得到四个与靶细胞KT－1/A3特异性结合的短肽，经细胞ELISA法、流式细胞术方法进行鉴定，证实了短肽与慢性髓系白血病细胞KT－1/A3结合的特异性。这些短肽在白血病的诊断、靶向治疗等方面具有重大的潜在应用价值。
文档编号G01N33/68GK1900108SQ200610032000
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月24日 优先权日2006年7月24日
发明者陈汉春, 刘佳, 胡维新 申请人:中南大学