专利名称：聚集蛋白聚糖及其片段的检测或定量的制作方法
聚集蛋白聚糖及其片段的检测或定量
本发明涉及采用识别G2结构域的抗体或其他免疫特异性结合配 偶体检测和/或定量聚集蛋白聚糖(Aggrecan)及其片段的测定法。
聚集蛋白聚糖由软骨细胞合成(Archer和Francis, 2003 )，是关 节软骨的主要成分，在关节软骨中与II型胶原和其他基质分子组织化 (Hardingham和Fosang， 1995 )。
聚集蛋白聚糖是高度糖基化的，包含2000多个氨基酸残基。聚 集蛋白聚糖在结构上有三个独立的结构域Gl、 G2和G3 (图A)。 在G2和G3结构域之间具有-以及在Gl和G2结构域之间较低程度地 具有-长段高度糖基化区域，该区域含有带负电荷的硫酸软骨素和硫酸 角质素寡糖结构(Hardingham和Fosang, 1995 )。
骨关节炎的特征是关节软骨的不可逆的破坏。软骨细胞会通过合 成新的基质成分，包括聚集蛋白聚糖，来试图修复退化的软骨 (Garnero等人，2000 )。
需要能够提供软骨代谢过程信息的生化标志物。生化标志物已有 描述，且对聚集蛋白聚糖及其片段的测定亦已有报道。
CS 846试验采用识别与聚集蛋白聚糖分子G2和G3结构域之间 的氨基酸846结合的硫酸软骨素侧链的抗体(IBEX Pharmaceuticals Inc.) 。 FA-846夹心免疫测定法也有报道，该方法是用于胚胎聚集蛋 白聚糖定量的CS 846^r测的改进方法。
还发展了一些其他的聚集蛋白聚糖检测方法，例如"聚集蛋白聚 斗唐蛋白聚并唐(Aggrecan Proteoglycan ) ，， (Biosource, US )。 然而这 些抗体的特异性仍然有待于确定。
其他的聚集蛋白聚糖测定法是针对聚集蛋白聚糖的糖胺聚糖区 域，即G2和G3结构域之间(Kongtawelert和Ghosh 1990; Ratcliffe 等人，1993 )。M0ller等发展了 一种针对聚集蛋白聚糖核心蛋白部分的竟争性 ELISA方法，但未详细说明抗体的结合区域(M0ller等人，1994)。 已经开发了抗体l-C-6，该抗体结合Gl和非掩蔽的G2结构域 (Fosang和Hardingham， 1991)。必须采用角质素酶去除為乾酸角质 素侧链以利于l-C-6与G2结构域的反应。因此l-C-6抗体不适合在检 测体液或身体组织中的聚集蛋白聚糖或聚集蛋白聚糖片段的测定中使 用。
已记载了聚集蛋白聚糖的一些蛋白水解切割位点(Fosang等人, 2000; Caterson等人，2000 )，金属蛋白酶(MMP )的主要作用位点位 于氨基酸N^和F^之间的球内结构域(IGD)中。以前开发过一种 单克隆抗体即AF28 ( ATCC HB11671 ),它与含有N末端序列 342FFGVG…的多肽新表位(neo-epitope )特异性结合(Fosang等人， 1995 ) 。 AF28抗体已用于竟争性ELISA中检测滑液和人血清中的聚 集蛋白聚糖片段(Fosang等人，1995 )。然而该抗体与G2结构域抗 体的联用尚无报道。
聚集蛋白聚糖在一些专利公开文献中有所提及。其中有几篇提到 为评价软骨代谢的诊断目的而测定聚集蛋白聚糖或蛋白质的某些特有 片段。US4704356披露了外周血中硫酸角质素(KS)的异常水平是软骨 或软骨样组织异常的指征。外周血KS水平升高被认为是骨关节炎的 指征。有趣的是，发现外周血中KS的缺乏以及很高的KS水平都指 示肌营养不良及相关疾病。用于外周血KS定量的技术是采用单克隆 抗体的免疫测定。
US5935796描述了其他涉及软骨分解的蛋白聚糖蛋白的诊断方法 和组合物。所述方法用于早期诊断、监测和治疗骨关节炎，其中采用 特异性识别机体组织和体液中非典型硫酸软骨素(CS) /硫酸皮肤素 糖胺聚糖链上的抗原决定簇的单克隆抗体，这两种成分均源自关节软 骨聚集蛋白聚糖。
具体而言，用于确定关节软骨中发生的变化。该方法包括(a)对滑液样品中的蛋白聚糖单体和/或其抗原性片段进行定量，和(b)将所 得数值与对应于该样品液的关节软骨的进行性破坏相关联。蛋白聚糖 片段通过采用蛋白聚糖单体特异性抗体的免疫测定方法进行测定。该
专利所述的测定法与前述多克隆HABr ELISA方法相同。
US5948692描述的测定法是采用大小分离方法将具有透明质酸
(HA)亲合力的聚糖与无此亲合力的蛋白聚糖分开。这种测定方法 可测定与HA结合的蛋白聚糖，例如聚集蛋白聚糖。据认为这能够实 现对整形外科领域的关节疾病及RA、 OA和其他关节疾病的生化i貪 断。该方法还可用于区分正常关节与病理性关节，提供疾病进展的预 后确定，以及监测治疗干预的效果。
US5427954描述了采用免疫测定法卩险测带有ARGSVI新表位的聚 集蛋白聚糖。这是描述新表位诊断性应用的多篇公开物中的一篇，所 述新表位是由参与关节疾病病理过程的蛋白酶介导的聚集蛋白聚糖特 异性蛋白水解而产生的。
US5387504描述了通过溶基质蛋白酶作用于位点N341-F342处而释 放的VDIPEN新表位，以及使用该表位的特异性单克隆抗体的RIA测 定。主要描述了对特异性溶基质蛋白酶切割产生的聚集蛋白聚糖片段 具有特异性的单特异性抗体的使用。溶基质蛋白酶水平升高出现在骨 关节炎、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化病变、痛风、炎性肠病
(IBD)、特发性肺纤维化(IPF)、部分癌症、关节损伤和多种炎性 疾病中。目前对于这些聚集蛋白聚糖"新表位"特异性测定的临床价值 还不是很清楚，并且也不明确这些片段是否会大量释放至血液循环中 以及他们是如何被分解代谢的。
US5935796涉及早期诊断、监测和治疗软骨退行性疾病的方法和 组合物，它采用可识别由于软骨聚集蛋白聚糖在>^41〗342位点处切割 而产生的包含FFGVG序列的肽的抗体。该表位是溶基质蛋白酶作用 于聚集蛋白聚糖而释放的VDIPEN表位的"另一端"。文中推荐了一种 夹心测定法以增加聚集蛋白聚糖FFGVG片段的检测灵敏性，更具体 而言，是将AF-28与抗石克酸角质素抗体如5-D-4联用的夹心测定法。然而直至目前为止，采用AF-28作为两种抗体之一进行令人满意的夹 心测定的尝试在实践中仍未荻成功。
US5185245描述了 一种检测滑液中的蛋白聚糖的免疫测定法和监 测以蛋白聚糖分解为特征的疾病的治疗情况的方法。滑液检测样品通 过使用特异性识别蛋白聚糖的抗体的免疫测定法进行定量，其中抗体 被固定于固体支持物上。结合的蛋白聚糖再与经检测试剂(如过氧化 物酶)标记的第二特异性抗体接触。两种抗体均对蛋白聚糖上的糖胺 聚糖(GAG/CS)部分具有亲和力。
US5354662和US5217903主要描述了对体液中的"组织分解产物" 的测定，其基础为采用含同位素标记分解产物的标准品对动物体液中 的结締组织或肌肉组织分解产物进行定量。标准品应当具有已知的比 活性，因此将标准品与体液样品混合时，采用RIA/IRMA型测定法才企 测的比放射性可以用作样品中分解产物含量的量度。还描述了评价动 物体液中所选动物结締组织或肌肉组织的状况的方法、评价包括特定 结締组织成分或肌肉组织破坏的疾病过程的方法、评价用于治疗这种 疾病过程的疗法的疗效的方法，包括测定组织分解产物量的方法步 骤。
上述方法中均未采用可识别在角质素酶处理之前能够结合的位于 聚集蛋白聚糖G2结构域上的表位的抗体，也没有讨论此类抗体的应用。
本发明基于如下发现，即针对聚集蛋白聚糖G2结构域的抗体在 检测或定量聚集蛋白聚糖的免疫测定中能够提供更好的应用。
发现针对未被天然掩蔽的G2结构域表位的抗体在测定聚集蛋白 聚糖的免疫测定中更具优势。
因此，本发明第 一 方面提供了 一种检测或定量测定样品中聚集蛋 白聚糖和/或聚集蛋白聚糖衍生片段的免疫测定方法，包括使样品接触 对带有硫酸角质素链的聚集蛋白聚糖G2结构域具有特异性结合亲和 力的免疫结合配偶体，并检测该免疫结合配偶体特异性结合的发生或 其量。任选地，在所述G2结构域带有硫酸角质素链时，以及在所述G2 结构域以重组形式表达因而缺少硫酸角质素链时，所述免疫结合配偶 体均对聚集蛋白聚糖的G2结构域具有特异性结合亲和力。
所述方法可按照夹心免疫测定法进行，采用所述免疫结合配偶体 作为捕获剂或检测剂。作为捕获剂，它可以固定于固体表面上，而作 为检测剂，它可以(例如)用酶标记、放射性标记或者荧光或其他标 记适当地标记。在这种夹心测定法中，所述结合配偶体可与其他免疫 性聚集蛋白聚糖或聚集蛋白聚糖片段结合配偶体联用，分别用作检测 剂或捕获剂。特别地，所述其他结合配偶体可为对聚集蛋白聚糖新表 位具有结合亲和力的抗体或抗体片段，所述新表位是可能位于IGD结 构域或G2和G3之间或其他部位的N末端或C末端新表位。
特别地，所述测定可按照夹心免疫测定法进行，采用所述免疫结 合配偶体作为捕获剂以及使用所述免疫结合配偶体作为检测剂。适当
地，所述捕获剂由固定于固体表面上的所述免疫结合配偶体提供，所 述检测剂则由带有可检测标记的所述特异性结合配偶体提供。
可选地，本发明的测定可按照竟争性免疫测定法进行，其中
(a) 将所述免疫结合配偶体固定于固体表面上，并与所述样品和包 含所述G2结构域或其抗体结合部分的已标记竟争性试剂进行孵育， 或者(b)将包含所述G2结构域或其抗体结合部位的竟争性试剂固定 于固体表面上，并与所述样品和已标记的所述免疫结合配偶体进行孵 育。
在本发明 一 个特别优选的方面，所述测定按照夹心免疫测定法进 行，使用(a)所述免疫结合配偶体和(b)对包含FFGVG..的N末端 氨基酸序列具有特异性结合亲和力的免疫结合配偶体，其中(a)和
(b) 中的任一个在所述测定中用作捕获剂，而(a)和(b)中的另 一个用作;险测剂。
所述免疫结合配偶体(b)可以是由杂交瘤细胞系ATCC HB11671产生的AF-28抗体，该杂交瘤细胞系在本领域中已有描述。 适当地，所述样品为滑液、血清、或来自软骨外植块培养或软骨细胞培养的条件培养基的样品或含有它们的样品。
本发明包括一种对样品中的软骨更新(turnover)标志物进行检 测或定量的体外方法，包括使样品接触在所述G2结构域带有硫酸角 质素链时以及在所述G2结构域以重组形式表达时均对聚集蛋白聚糖 G2结构域具有特异性结合亲和力的免疫结合配偶体，以及测定该免 疫结合配偶体特异性结合的发生或其量。该方法可按照上述任意程序 进行。
样品优选为来源于患者的样品，所述方法可以进一步包括将测定 的结合水平与对应于存在和/或不存在软骨降解疾病病症的校准值进行 比较。
本发明包括一种对带有硫酸角质素链的聚集蛋白聚糖G2结构域 具有特异性结合亲和力的免疫结合配偶体。优选地，在所述G2结构 域带有硫酸角质素链时以及在所述G2结构域以重组形式表达时，这 种免疫结合配偶体均对聚集蛋白聚糖的G2结构域具有特异性结合亲 和力。该免疫结合配偶体可为具有特异性结合特性的单克隆抗体或其 片段的形式。
本发明包括表达如上所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，还延伸 至重组表达的这些免疫结合配偶体。
本发明包括一种免疫测定试剂盒，其包含本发明的免疫结合配偶 体，以及一种或多种以下成分
另外的抗聚集蛋白聚糖或聚集蛋白聚糖片段抗体；和与抗聚集蛋 白聚糖或聚集蛋白聚糖片段抗体结合的肽竟争试剂；和任选的一种或 多种洗涤试剂、緩冲液、终止试剂、酶标记物、酶标底物、抗小鼠 抗体、 一交准标准品和il明书。
一^t殳而言，所有已知的免疫测定形式均可在本发明加以应用，包 括非均相和均相形式、夹心测定法、竟争性测定法、酶联测定法、》文 射免疫测定法等。
本文所述的测定法可用于诊断患者的疾病，包括骨关节炎、类风 湿性关节炎和其他影响软骨组织的疾病。另外，这些试验可用于评价疾病的进展，并监测对治疗的反应。还可用于研究在培养物例如软骨 或软骨细胞培养物中聚集蛋白聚糖或聚集蛋白聚糖片段的产生，以及 研究不同试剂、候选药物和酶抑制剂对这些培养体系的影响。本发明 的免疫结合配偶体还可用于对含有聚集蛋白聚糖片段的材料进行免疫染色。
本文使用的术语"免疫结合配偶体"包括多克隆和单克隆抗体，还
有抗体的特异性结合片段如Fab或F(ab，)2。
识别聚集蛋白聚糖G2结构域的单克隆抗体可以如下制备采用 来源于G2结构域氨基酸序列的合成肽免疫小鼠，将选定小鼠的脾细 胞与骨髓瘤细胞融合，并且检测分泌的单克隆抗体与聚集蛋白聚糖的 结合。重要的是，还应评价这些抗体对天然聚集蛋白聚糖的结合能 力，例如通过与滑液或血清样品共孵育来进行评价。
可选地，小鼠可采用纯化的完整聚集蛋白聚糖进行免疫，根据对 G2结构域的反应性选择单克隆抗体。对G2结构域的特异性可通过以 下方式加以保证(1 )要求对纯化G2结构域和任选地另外对重组 G2或Gl-G2具有反应性，或者(2)要求对纯化Gl-G2 ( Fosang等 人，1989)和含FFGVG的聚集蛋白聚糖片段(对应于MMP酶切的含 新表位FFGVG和G2的聚集蛋白聚糖片段)具有反应性，和任选地 对重组G2或Gl-G2具有反应性；或者(3)要求至少对纯化Gl-G2 具有反应性，并且缺乏对重组Gl和合成IGD (分隔Gl和G2的球内 结构域)的反应性。
本发明一方面涉及对聚集蛋白聚糖G2结构域进行检测和/或定量 的方法。 一种这样的方法是利用与G2结构域结合的单克隆抗体的竟 争性免疫测定法。包被于微孔板固体表面上的适当选择的合成肽可以 与样品竟争结合所述单克隆抗体。在固体表面上也可使用纯化的天然 聚集蛋白聚糖。另一个选择是将单克隆抗体固定于固体表面，再与样 品及与信号分子如辣根过氧化物酶或生物素适当连接的合成肽共孵 育。
本发明 一 方面涉及通过免疫测定法测定滑液和血清样品中的聚集
10蛋白聚糖G2结构域。
本发明另 一方面涉及通过免疫测定法测定来自软骨外植物培养、
软骨细胞培养的条件培养基中的G2结构域。
本发明另一方面涉及能够方便地用于实施上述方法的试剂盒。这
种试剂盒可包括(1 )合成肽包被的微孔板；(2)识别G2结构域 的单克隆抗体；和(3)标记的抗小鼠IgG免疫J求蛋白。可选地，这 种试剂盒可包括(1 )纯化聚集蛋白聚糖包被的微孔板；(2)识别 G2结构域的单克隆抗体；和(3)标记的抗小鼠IgG免疫球蛋白。可 选地，这种试剂盒可包括(1 )链亲和素包被的微孔板；(2)与生 物素连接的合成肽；(3)识别G2结构域的单克隆抗体；和(4)标 记的抗小鼠IgG免疫球蛋白。作为另一种备选方案的试剂盒包括 (1)链亲和素包被的微孔板；(2)与生物素连接的合成肽；(3) 识别G2结构域并且与辣根过氧化物酶偶联的单克隆抗体。
本发明另一方面涉及利用针对G2中非掩蔽表位的抗体以夹心法 测定聚集蛋白聚糖。
本发明另一方面涉及识别G2结构域的抗体与识别在聚集蛋白聚 糖蛋白水解切割过程中产生的新表位的其他抗体的联用。令人意外的 是，G2抗体与识别蛋白水解新表位的抗体联用能够大大提高对带有 新表位的聚集蛋白聚糖片段的检测灵敏性。
本发明一方面涉及G2抗体与识别经基质金属蛋白酶(MMP) 蛋白水解切割聚集蛋白聚糖产生的新表位的抗体的联合应用。 一 个 优选实施方式为采用识别在球内结构域(IGD)氨基酸341和342之 间切割而产生的N末端序列FFGVG...的抗体。
本发明另一方面涉及G2抗体与识别经聚集蛋白聚糖酶aggrecanase j 蛋白水解切割聚集蛋白聚糖所产生的新表位的抗体 的联合应用。 一个优选实施方式为采用识别在球内结构域(IGD)氨 基酸373和374之间切割而产生的N末端序列ARGS.…的抗体。适 合的抗体包括可从abcam获得、并且在Hughes等人Biochem J (1995) 305, 799-804中记载的BC-3抗体(ab3773),以及Pratta等人Osteoarthritis & cartilage March 2006中记载的单克隆抗体OA-l。
本发明另一方面涉及上述任一种测定法中所用抗体的开发与应
用，所述抗体可识别位于G2和/或Gl中的非4奄蔽表位。Gl和G2共
享延长的氨基酸同源序列，因此依照本发明这类抗体均可用。
从附图与优选实施方式的描述、以下实施例、以及所附权利要
求书可清楚本发明的其它特征及优点。 在附图中
图1显示聚集蛋白聚糖的结构；
图2显示纯化的猪Gl-G2以剂量依赖性的方式抑制抗G2抗体
F78与聚集蛋白聚糖的结合；
图3显示实施例2的免疫测定获得的标准曲线；
图4显示实施例3的免疫测定获得的标准曲线；
图5显示实施例4中采用夹心测定法得到的结果；
图6显示实施例5中采用比较免疫测定法得到的结果；
图7显示采用如实施例6所述的G2夹心测定法得到的定量结
果；和
图8显示采用如实施例7所述的FFGVG-G2夹心测定法得到的
定量结果。
实施例 实施例1
识别G2结构域的单克隆抗体的制备
给五只七周龄雌性Balb/c小鼠皮下注射完整牛聚集蛋白聚糖 (SIGMA, Denmark )与弗氏不完全佐剂的1:1混合液。每两周免疫动 物一次，持续两月(免疫5次)，之后间隔4周免疫一次。小鼠在开 始免疫之前以及在第五次免疫后一周采血。采用完整牛聚集蛋白聚糖 过夜包被的微孔板(NUNC,丹麦)通过ELISA评估免疫应答。将系 列稀释的小鼠抗血清孵育一小时，洗涤微孔板，通过与辣根过氧化物 酶偶联的绵羊抗小鼠IgG抗体孵育来证明结合的抗体。如果在所述筛选试验中效价未升高，则让选择的小鼠休息4周， 然后用不含佐剂的200|ll免疫原腹膜内加强免疫。三天后取出脾脏， 采用标准技术与骨髓瘤细胞融合。生长的杂交瘤产生的抗体采用所述ELISA测定。挑选杂交瘤采用 有限稀释法进行克隆，在培养瓶中增殖，采用蛋白G亲和色谱法纯化 单克隆抗体。最后，根据对位于G2结构域中的未掩蔽表位的反应性挑选单克 隆抗体(术语"未掩蔽"在此是指表位在天然存在时不会(例如)由于 存在硫酸角质素而阻止其被抗体结合，而不是指已除去"掩蔽物，，如硫 酸角质素的表位)。这通过用一系列免疫测定进行评测来实现。用完 整牛聚集蛋白聚糖包被微孔板。单克隆抗体与固体表面的结合通过与 纯化的猪Gl-G2 ( Fosang和Hardingham , 1989 )和合成IGD(Chemicon, US)竟争来确定。对于与Gl-G2结合但不与IGD结合 的单克隆抗体，进一步测试其与具有游离C末端FFGVG序列(IGD 结构域中的氨基酸342-346 )的聚集蛋白聚糖片段的结合能力，该片 段对应于无Gl结构域的片段(见下文)。图2表明纯化猪Gl-G2可剂量依赖性地抑制单克隆抗体F78与包 被于微孔板固体表面上的聚集蛋白聚糖的结合。相反地，合成IGD(Chemicon， US)则无法取代抗体(数据未显示)。实施例2G2片段的夹心免疫测定采用如上所述的单克隆抗体发展了一种夹心测定法。链亲和素板 与lOOpl 600 ng/ml生物素化抗聚集蛋白聚糖G2结构域的单克隆抗体 F78在20。C、 300 RPM下孵育1小时。将反应板孵育1小时后，用洗涤緩冲液(0.15 mol/lNaCl， 0.05% (v/v)吐温20)洗板5次。之后加入100 pl标准品(纯化的牛聚集 蛋白聚糖，0.05 ng/ml-10 ng/ml)或用PBS-BTB预稀释的外植块上 清液，将板于300 RPM、 2(TC孵育1小时。孵育结束后，按所述方法洗板5次，加入500 ng/ml辣根过氧化物酶(POD)标记的F78抗 体。于300 RPM、 20。C孵育l小时后，洗板5次，加入100jilTMB底 物，使反应板在暗处于300 RPM、 20。C孵育15分钟，接着加入150 1^1 0.18 M硫酸。立即于450 nm处测定吸光度。 图3显示所述夹心测定法测得的标准曲线。实施例3对342FFGVG-G2的免疫测定针对342FFGVG氨基酸序列的单克隆抗体已有报告 (US5935796 )。向链亲和素反应板中加入100 (il 1500 ng/ml生物素化抗 3"FFGVG-G2表位的AF-28单克隆抗体，于300 RPM、 20。C孵育1小 时。抗体稀释采用PBS-BTB緩沖液进行。将反应板孵育1小时后， 用洗涤緩沖液(0.15 mo1/1 NaCl， 0.05% ( v/v )吐温20)洗板5次。 之后加入50 pl标准品(MMP-13消化的纯化猪聚集蛋白聚糖，47-3000 ng/ml)或用PBS-BTB预稀释的外植块上清液，于300 RPM、 20。C孵育l小时。孵育结束后，按上述方法洗板5次，加入500 ng/ml 辣根过氧化物酶(POD)标记的F78抗体。于300 RPM、 2(TC孵育1 小时后，洗板5次，加入100^1 TMB底物，将反应板在暗处于300 RPM、 2(TC孵育15分钟，接着加入150 pi 0.18 M硫酸。立即于450 nm处测定吸光度。图4显示上述测定法所测得的标准曲线。重要的是，342FFGVG-G2测定的检测极限低至0.004 pmol/mL (相当于10 ng/ml),这大大 低于以前报道的采用AF28的竟争性ELISA的检测极限，即7 pmol/mL (或17500 ng/ml) (Fosang等人，1995)。实施例4牛关节软骨外植块上清液中的G2和342FFGVG-G2片段的检测 上述G2和342FFGVG-G2试验采用来自软骨外植块的条件培养基进行评价。牛关节软骨取自小母牛后膝关节。将软骨小块(16士4mg)置于96孔培养板中，于37°C、 5% C02及振摇(50 rpm)条件 下孵育。使用含或者不含细胞因子制癌蛋白M和肿瘤坏死因子a (TNFa)或MMP抑制剂GM6001的无血清D-MEM培养基。作为阴 性对照，将软骨置于冻存管中，在液氮中冷冻，然后在37。C水浴中融 化，重复三次冻融循环。外植块培养基每三天更换一次，上清液于-2(TC保存，直到进一步分析。图5显示采用两种免疫测定法定量测定的不同天数时上清液中聚 集蛋白聚糖量的测定值。从图中可以看出OSM和TNFa在第12天后 刺激342FFGVG-G2增加。当同时在GM6001的存在下处理外植块 时，342FFGVG-G2释放被完全消除。在相同实验条件下，G2的释放 则表现出完全不同的曲线。G2向上清液中的释放最初先增加，但第5 天后则逐渐降低，在第12天后降至背景水平。加入GM6001不抑制 G2释放，表明G2测定不同于342FFGVG-G2，它测定不依赖于MMP 活性的片段。实施例5牛关节软骨外植块上清液中CS846释放的测定还对上述检测的上清液测定了 CS846 (IBEX CS846竟争性 ELISA试剂盒)。图6表明OSM和TNFa不刺激CS846向上清液中 的释放。然而，在抑制MMP活性期间，观察到CS846释放在开始时 强烈增加。这些数据表明在CS846检测中测定的分析物被蛋白水解活 性破坏，这种活性可被GM6001抑制。实施例6RA患者的G2片段的测定值降低来自15名健康者与15名RA患者的血清样品采用G2测定法进 行定量，结果列于图7中。数据表明与对照相比，RA个体中释放的 G2分子的测定值显著降低，这说明关节炎患者中聚集蛋白聚糖的合成减少。实施例7RA患者的342FFGVG-G2片段的测定值升高相同个体组还进行了 342FFGVG-G2测定，与G2测定结果相反， RA患者中释放的342FFGVG-G2片段比对照组显著增加，结果见图 8。这一结果与预期一致，因为这种测定法是测定聚集蛋白聚糖的降解。本说明书中若无特殊说明，词语"或者"的含意为当所述条件中任 一个或者两者都满足时则算子返回真值，而不同于仅需要满足一种条 件的算子"异或"。词语"包括"意思为"包含"，而非"由...组成"。参考文献Caterson B,, Flannery C, R，, Hughes C. E,, Little B" Mechanisms involved in Cartilage Proteoglycan Catabolism, Matrix Biology 2000/ Volume 19: 333—344Fosang A,J,, Hardingham T,E., Isolation of the N-terminal globular* protein domains from cartilage proteoglycans, Biochemical Journal 1989; Vol 261: 801-809，Fosang A. Hardingham T, E,, 1—C-6 Epitope in CartilageProteoglycan G2 Domain is masked by Keratan Sulphate, Biochemical Journal 1991/ Volume 273: 369-373Fosang A， J,, Last K,, Gardiner P,, Jackson D, C,, Brown Development of a cleavage—site—specific Monoclonal Antibody for detecting metalloproteinase-cle.rived Aggrecan Fragments in H画an Synovial Fluid, Biochemical Journal 1995; Volume 310: 337-343Fosang A, J,, Last K,, Maciewicz R, A., Aggrecan is degraded by matrix metalloproteinases in human arthritis. Evidence that matrix metalloproteinase and aggxecanase activities can be independent. J Clin Invest, 19967 98 Mr， 10:2292—9Fosang A, J,, Last K,, Stanton H，, Weeks D. B,, Carapbell 工， K，, Hardingham T. E,, Hembry R. M,, Generation and novel distribution of matrix metalloproteinase—derived aggrecan fragments in porcine cartilage explants， The Journal of Biological Chemistry 2000; Volume 275 Nr, 42: 33027-33037Garnero P., Rousseau J. C,, Delmas P，, Molecular Basis and Clinical use of Biochemical Markers of Bone, Cartilage andDiseases, Arthritis and Rheumatism 2000; Volume 43 No. 5: 953-968Hardingham T, E. and Fosang A. J,, The Structure of Aggrecan and its Turnover in Cartilage.The Journal of Rheumatology 1995; Volume 22:1 supplement 43: 86-89Kongtawelert P, and Ghosh P,, A new Sandwich—E!L工SA Method for* the Determination of Keratan Sulphate Peptides in Biological Fluids employing a Monoclonal Antibody and labelled avidin biotin Technique. Clinica Chimica Acta 1990,' Volume 195: 17-26M0ller H, j,r Larsen F. S,, Ingemann—Hansen T,, Poulsen J\ H，, e:l工SA for the Core Protein of the Cartilage large aggregating Proteoglycan, aggrecan: Comparison with the Concentrations of Immunogenic Keratan Sulphate in synovial fluid, Ser醒and Urine. Clinica Chimica Acta 1994; Volume 225: 43-55Ratcliffe A,, Shurety W., Caterson B，, The quantitation of a native chondroitin sulfate epitope in synovial fluid lavages and articular cartilage from canine experimental osteoarthritis and disuse atrophy, Arthritis and Rheumatism 1993,' Volume36恥，4:543—5权利要求
1.一种检测或定量测定样品中聚集蛋白聚糖和/或聚集蛋白聚糖衍生片段的免疫测定方法，包括使样品接触对带有硫酸角质素链的聚集蛋白聚糖G2结构域具有特异性结合亲和力的免疫结合配偶体，并检测该免疫结合配偶体特异性结合的发生或其量。
2. 如权利要求2所述的方法，其中在所述G2结构域带有硫酸角 质素链时，以及在所述G2结构域以重组形式表达时，所述免疫结合 配偶体均对聚集蛋白聚糖的G2结构域具有特异性结合亲和力。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其按照夹心免疫测定法进 行，采用所述免疫结合配偶体作为捕获剂或检测剂。
4. 如权利要求3所述的方法，其按照夹心免疫测定法进行，采 用所述免疫结合配偶体作为捕获剂，并采用所述免疫结合配偶体作为 斗全测剂。
5. 如权利要求4所述的方法，其中所述捕获剂由固定于固体表 面上的所述免疫结合配偶体提供，所述检测剂由带有可检测标记的所 述特异性结合配偶体提供。
6. 如权利要求1或2所述的方法，其按照竟争性免疫测定法进 行，其中(a)将所述免疫结合配偶体固定于固体表面，并与所述样 品和包含所述G2结构域或其抗体结合部分的已标记竟争性试剂进行 孵育，或者(b)将包含所述G2结构域或其抗体结合部分的竟争性试 剂固定于固体表面，并与所述样品和已标记的所述免疫结合配偶体进 行孵育。
7. 如权利要求1或2所述的方法，其按照夹心免疫测定法进 行，使用(a)所述免疫结合配偶体和(b)对包含FFGVG..或包含 ARGS..的N末端氨基酸序列具有特异性结合亲和力的免疫结合配偶 体，其中(a)和(b)中的任一个在所述测定法中用作捕获剂，U)和(b)中的另一个用作检测剂。
8. 如权利要求6所述的方法，其中所述免疫结合配偶体(b)是由杂交瘤细胞系ATCC HB11671产生的抗体AF-28。
9. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品为滑 液、血清、或来自软骨外植块培养或软骨细胞培养的条件培养基的样 品或含有它们的样品。
10. —种对样品中的软骨更新标志物进行检测或定量的体外方 法，包括使样品接触在G2结构域带有硫酸角质素链时以及在G2结构 域以重组形式表达时均对所述聚集蛋白聚糖G2结构域具有特异性结 合亲和力的免疫结合配偶体，以及测定该免疫结合配偶体特异性结合 的发生或其量。
11. 如权利要求9所述的方法，其中所述样品为来源于患者的样 品，该方法还包括将测定的结合水平与对应于存在和/或不存在软骨降 解疾病病症的校准值进行比较。
12. —种免疫结合配偶体，其对带有硫酸角质素链的聚集蛋白聚 糖G2结构域具有特异性结合亲和力。
13. 如权利要求11所述的免疫结合配偶体，其在所述G2结构域 带有^L酸角质素^I时以及在所述G2结构域以重组形式表达时，均对 聚集蛋白聚糖G2结构域具有特异性结合亲和力。
14. 如权利要求11或12所述的免疫结合配偶体，其形式为具有 特异性结合特性的单克隆抗体或其片段。
15. —种表达如权利要求13所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
16. 如权利要求11或12所述的免疫结合配偶体，它是重组表达的。
17. —种免疫测定试剂盒，其包含如权利要求11或12所述的免 疫结合配偶体，以及一种或多种另外的抗聚集蛋白聚糖抗体；和与抗聚集蛋白聚糖抗体结合的肽竟争试剂；和任选的一种或多种洗涤试剂、緩沖液、终止试剂、酶标记物、酶标底物、抗小鼠抗 体、4交准标准品和i兌明书。
全文摘要
一种针对聚集蛋白聚糖和/或聚集蛋白聚糖衍生片段的免疫测定，包括使样品接触对聚集蛋白聚糖G2结构域(至少在其具有硫酸角质素链时)具有特异性结合亲和力的免疫结合配偶体，以及检测免疫结合配偶体特异性结合的发生或程度，这可以通过夹心测定法采用与包含FFGVG..的N末端氨基酸序列结合的第一抗体和与包含ARGS的N末端氨基酸序列结合的第二抗体进行。
文档编号G01N33/08GK101317089SQ200680044851
公开日2008年12月3日 申请日期2006年10月17日 优先权日2005年10月20日
发明者E·U·萨默, P·维斯特 申请人:北欧生物科学与诊断有限公司