专利名称：检测细胞内氢离子的近红外荧光探针及其合成方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术及临床医学检测领域，尤其涉及用于检测细胞内氢离 子的近红外荧光探针；本发明还涉及该荧光探针的合成方法；另外，该发明还涉及 该荧光探针的用途。
背景技术：
氢离子浓度作为一个重要的新陈代谢及细胞内的参数，在许多细胞过程中起到关 键的调节作用，比如细胞生长、钙离子调节、酶活性、信号传导、细胞内吞作用、化 学向性及其他的细胞过程。许多报道认为一些疾病如癌症、肾衰竭、肺病等与细胞质 或者酸性细胞器内的pH异常有关。因此，细胞内pH的精确测量是非常重要的。目前，许多方法可用于检测pH。比如微电极、核磁、吸收及荧光光谱方法。在 这些方法中，荧光法由于其非入侵的性质、高的灵敏度和专一性，以及广泛可用的荧 光染料在测定pH时比其他方法更为优越。而且，荧光显微成像技术通过使用荧光pH探针能够捕捉到细胞内氢离子的时空分辨。现在，两类荧光pH探针已经被开发， 一类是用于检测细胞质内pH的探针，其 工作pH范围大约是6.8-7.4 (K. M. Sun， C, K. McLaughlin, D. R. Lantero and R. A.Manderville, ■/爿附.Cte附.5bc. 2007, 129, 1894 -1895; M. S. Briggs, D. D. Burns, M. E. Cooper and S. J. Gregory, CT^m. Go附www., 2000, 2323—2324; J. A. Thomas, R. N. Buchsbaum, A. Zimniak and E. Racker,历octe附.1979, 18, 2210-2218; A. H. Lee and I. RTannock, Cancer Res. 1998, 58, 1901-1908; R. Pal and D. Parker, C&附.Cowmw". 2007, 474476);另一类是用于检测酸性器官如溶酶体，内涵体等的探针，其工作pH范围 大纟勺是4.5-6.0.(H.-J. Lin, P. Herman, J. S. Kang and J. R. Lakowicz, J""/. 2001, 294， 118-125; R Galindo, M. I. Burguete, L. Vigara, S. V. Luis, N. Kabir, J, Gavrilovic and D. A. Russell,C/zew. /脱2005,44, 6504-6508.)。 众所周知，细胞内pH的 微小变化可能引起细胞的功能紊乱，理想的荧光探针应当灵敏的响应细胞内pH的微
小变化，并且能够避免来自细胞生物本身的干扰。然而，目前可用的pH荧光探针有 以下缺点低的灵敏度，有的激发在紫外区。激发在紫外区能够损伤组织样品并且引 起生物样品自发荧光的干扰。另外，用于检测酸性器官内的理想的pH探针较少，这 被认为是细胞生物学及医学发展的瓶颈。因此，发展pH荧光探针的焦点在于设计近 红外、具有好的选择性、高的灵敏度、好的光稳定性以及工作pH在酸性范围的荧光 探针。
发明内容
本发明的目的之一旨在克服现有技术荧光探针的不足之处，提供一种性能优良、 适用于检测细胞内氢离子的基于花菁荧光染料的近红外荧光探针；目的之二是提供 工艺简单、成本低廉的该荧光探针的合成方法；目的之三是提供该荧光探针的用途。本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现该花菁染料荧光探针具有以下结构通式通式中R=-CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3， -CH2CH2CH2CH2S03-; -OH位于氨基的邻位、间位或者对位。 本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现 该方法按如下步骤进行a. 先将花菁染料Cy.7和氢离子响应基团按照花菁染料Cy.7:氢离子响应基团=1: 1 3的质量比溶解于DMF (N,N-二甲基甲酰胺)中，然后在惰性气体保护和70-85 'C下反应3 5小时；b. 将反应混合物冷却至室温，再于搅拌下加入无水乙醚中，经过滤，减压干燥得 粗品；c. 硅胶柱层析分离得纯品。本发明的目的之二还可通过如下技术措施来实现a工序中所述的花菁类染料Cy.7选自甲基花菁、乙基花菁、丙基花菁或者磺酸 基丁基花菁；a工序中所述的氢离子响应基团选自间氨基苯酚、邻氨基苯酚或者对 氨基苯酚；b工序中所述的无水乙醚反应混合物=15 20: 1的体积比。本发明代表性的化合物显示在下面的合成方案中。在惰性气体保护下，花菁荧光染料与间氨基苯酚在DMF (N，N-二甲基甲酰胺) 中反应得到探针分子，最后经过分离得到探针纯品。本发明检测细胞内氢离子的近红外荧光探针在使用时没有特殊的限制，通常，可 以将探针分子溶解在生理盐水、缓冲液或由乙醇、乙腈、二甲亚砜等水溶性有机溶剂， 然后加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。本发明的目的之三可通过如下技术措施来实现本发明的检测细胞内氢离子的近红外荧光探针用于化学模拟生物体系中氢离子 的检测，生物活细胞和活组织内的氢离子的分析检测和荧光成像检测，以及临床医 学上病变组织中氢离子的检测。本发明以丙基花菁、间氨基苯酚为原料，合成的荧光探针'H NMR (300 MHz, CDC13): S 1.04 (t, 6H, J=7.5Hz), 1.27 (s, 12H), 1.83 (m， 2H)， 2.06 (m， 4H), 2.58 (m, 4H), 3.89 (t, 4H, J=6.8Hz), 5.84 (d, 2H, J=14.0Hz), 6.45 (m， 4H), 6.92-7.23 (m， 8H), 8.08 (d, 2H， J=14.0Hz). ESI掘cal for [M] + = 612.4， found 612.4 (M-r)。本发明的重要贡献在于合成的荧光探针分子属于近红外荧光探针，可以有效避免 细胞内自发荧光的干扰，提高检测方法的选择性和灵敏度，减少对生命体的损伤，有 利于活体检测；本发明荧光探针分子的设计基于分子内诱导电子转移(PET)，该探 针显示了高的灵敏度，在不同的激发和发射波长下能够对酸碱两种条件下的pH分别 做出响应。pH滴定实验表明酸性条件下在4.0-6.5的pH范围荧光强度能增加10倍有 余，p/Ca是5.14，这对研究细胞内的酸性器官是非常有意义的；在碱性条件下，工作 pH范围是10.5-11.8，p《a是11.31 。另夕卜，将探针应用到人的肝癌细胞内(HepG2 cells)
通过激光共聚焦显微成像技术进一步证明了该探针的价值。本发明涉及的探针分子具有极其重要的应用价值。特别是该系列探针分子发射波 长位于近红外区，能够实现pH的双重检测，测定灵敏度高，选择性好，对细胞的渗 透性和毒副作用小。另外该系列探针分子结构简单，合成简易且效率高使得极易推广 实际应用。
图1是本发明实施例的荧光探针分子在酸性缓冲溶液中其荧光强度和氢离子浓度 的关系及pH滴定曲线。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。图2是本发明实施例的荧光探针分子在碱性缓冲溶液中其荧光强度和氢离子浓度 的关系及pH滴定曲线。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。图3是本发明实施例的荧光探针分子对氢离子具有很好的选择性，横坐标为各种离子，1: H+; 2: H+ + Cu2+; 3: H+ + Zn2+;4: H+ + Ca2+; 5: H+ + Mg2+。纵坐标为加入各种离子前后探针溶液的荧光强度。图4是本发明实施例的荧光探针分子对人的肝癌细胞(HepG2 cells)的激光共聚 焦显微成像。a:人的肝癌细胞用荧光探针在37'C下孵育1小时的激光共聚焦照片；b:亮场照片以表明细胞活力。
具体实施方式
: 实施例1: 探针的合成取1.4克(2mmo1 )具有近红外荧光光谱的丙基花菁染料Cy.7、 5.2克间氨基苯 酚和40mL N,N-二甲基甲酰胺于100mL三口烧瓶中，使其完全溶解后在氮气保护和 70。C下反应3小时，冷却至室温，后于搅拌下加入到940 mL乙醚中，过滤，减压干 燥得荧光探针粗品，最后用硅胶柱分离组分，洗脱剂选自甲醇-乙酸乙酯(1: 20v/v) ,35°C旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯 实施例2:探针的合成取1.4克(2mmo1 )具有近红外荧光光谱的丙基花菁染料Cy.7、 1.4克间氨基苯 酚和20mL N，N-二甲基甲酰胺于100mL三口烧瓶中，使其完全溶解后在氮气保护和 85"C下反应5小时，冷却至室温，后于搅拌下加入到350 mL乙醚中，过滤，减压干 燥得荧光探针粗品，最后用硅胶柱分离组分，洗脱剂选自甲醇-乙酸乙酯(1: 20v/v), 38°C旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品。实施例3:探针的合成取1.4克(2mmo1 )具有近红外荧光光谱的丙基花菁染料Cy.7、 2.5克间氨基苯 酚和28mL N,N-二甲基甲酰胺于100mL三口烧瓶中，使其完全溶解后在氮气保护和 75。C下反应4小时，冷却至室温，后于搅拌下加入到550 mL乙醚中，过滤，减压干 燥得荧光探针粗品，最后用硅胶柱分离组分，洗脱剂选自甲醇-乙酸乙酯(1: 20v/v), 30°C旋转蒸发去除溶剂，真空干燥得荧光探针纯品。实施例4:将甲基花菁替换丙基花菁，其他分别同实施例l、 2、 3。 实施例5:将乙基花菁替换丙基花菁，其他分别同实施例l、 2、 3。 实施例6:将磺酸基丁基花菁替换丙基花菁，其他分别同实施例l、 2、 3。 实施例7:将邻氨基苯酚替换间氨基苯酚，其他分别同实施例l、 2、 3、 4、 5、 6。实施例8:将对氨基苯酚替换间氨基苯酚，其他分别同实施例l、 2、 3、 4、 5、 6。
权利要求
1、检测细胞内氢离子的近红外荧光探针，其特征在于该荧光探针具有下列结构通式通式中R＝-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH2CH2CH2CH2SO3-；-OH位于氨基的邻位、间位或者对位。
2、 检测细胞内氢离子的近红外荧光探针的合成方法，其特征在于该方法按如下 步骤进行a. 先将花菁染料Cy.7和氢离子响应基团按照花菁染料Cy.7:氢离子响应基团= 1: 1 3的质量比溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，然后在惰性气体保护和70-85"C下反 应3 5小时；b. 将反应混合物冷却至室温，再于搅拌下加入无水乙醚中，经过滤，减压干燥得粗品；c. 硅胶柱层析分离得纯品。
3、 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于a工序中所述的花菁类染料Cy.7 选自甲基花菁、乙基花菁、丙基花菁或者磺酸基丁基花菁。
4、 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于a工序中所述的氢离子响应基 团选自间氨基苯酚、邻氨基苯酚或者对氨基苯酚。
5、 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于b工序中所述的无水乙醚反 应混合物=15 20: 1的体积比。
6、 权利要求1所述的检测细胞内氢离子的近红外荧光探针用于化学模拟生物体 系中氢离子的检测，生物活细胞和活组织内的氢离子的分析检测和荧光成像检测， 以及临床医学上病变组织中氢离子的检测。
全文摘要
本发明提供一种检测细胞内氢离子的近红外荧光探针及其合成方法和用途，该方法按如下步骤进行a.先将花菁染料Cy.7和氢离子响应基团按照花菁染料Cy.7∶氢离子响应基团＝1∶1～3的质量比溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，然后在惰性气体保护和70-85℃下反应3～5小时；b.将反应混合物冷却至室温，再于搅拌下加入无水乙醚中，经过滤，减压干燥得粗品；c.硅胶柱层析分离得纯品。
文档编号G01N21/00GK101118236SQ20071001640
公开日2008年2月6日 申请日期2007年7月24日 优先权日2007年7月24日
发明者霞 刘, 波 唐, 张海燕, 张金军, 徐克花 申请人:山东师范大学