专利名称：用于检测农药残留的生物酶电极的制作方法
技术领域：
本发明的技术方案涉及生物化学电极，具体地说，是用于检测农药残留的生物酶电 极的制作方法。
背景技术：
近年来，农产品中农药残留超标问题已引起人们的广泛关注。用于检测农药残留的生 物传感器也得到不断的研发和利用。
Mulchandani 等 (Flow injection amperometric enzyme biosensor for direct determination of orga叩hosphate nerve agents, Environ. Sci. Technol. 2001， (35)) 结合流动注射技术研制的流动注射安培型有机磷水解酶生物传感器(FIAB)，通过检测有 机磷的水解产物对硝基苯酚，来判断有机磷的浓度。Jeanty等(Detection of paraoxon by continuous flow system based enzyme sensor, Biosensors and Bioelectronics. 1998， (13))用流动注射乙酰胆碱酯酶生物传感器检测有机磷农药对氧磷及其衍生物。魏 福祥等(乙酰胆碱酯酶生物传感器法测定蔬菜水果中有机磷农药残留，食品科学， 2007(28))介绍了一种利用乙酰胆碱酯酶生物传感器技术测定蔬菜水果中有机磷农药残 留。上述方法均为试图通过酶固定方法和材料的改变来提高生物传感器的性能，但是存 在有或者线性范围窄，或者检测灵敏度不高、或者抗干扰能力不强等缺点，而且皆不能 控制酶量的使用。Haibin Shi等(Electroanalysis, 2005, 17， (14) : 1285-1290)报道了 利用分子一酶层层自组装累积膜技术在电极上制备导电高分子膜，利用高分子聚合物 PDDA和胆碱氧化酶制备了胆碱传感器即Pt/(PDDA/Ch0x)n。 Zhao Song等(Sensor & Actuator B, 2006， 115: 626 - 633)报道了以纳米碳管修饰铂电极为基础电极，采用溶胶 -凝胶法固定胆碱氧化酶(ChOx)，构建了电流型胆碱检测生物传感器。CN2723998和宋昭 等人(传感器技术,2005， 24(7) :16-18)报道了以丝网印刷电极为载体，以明胶包埋为主 要方法制备了基于乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的电流型生物传感器酶电极。CN 01253887.6披露了一种探测农药残留用的量热式生物传感器，由被测液处理单元和检测 单元组成，被测液处理单元包括前处理器、过滤器、样液容器、缓冲液容器、导管、蠕 动泵、脉冲阻尼器、微量注射泵，检测单元包括内、外胆组成的恒温器、半导体制冷器、 三通，检测酶柱、参考酶柱，温度检测元件置于酶柱两侧，检测酶柱出口液体的温度差， 输出和处理、显示单元及微处理机连接。这种量热式生物传感器的组成结构复杂、成本 昂贵、特别是由于实际检测应用中，被抑制的酶的活性很难逆转，酶反应层的再次固定 活化会成为首要问题。CN1699985披露了农药检测用纳米修饰微型电化学生物传感器的制
法，是由纳米复合型酶电极、微型银/氯化银(Ag/AgCl)参比电极和对电极组成，具体 结构为纳米材料与酶复合，与薄膜状的工作电极结合，同薄膜状的微型银/氯化银
(Ag/AgCl)参比电极以及薄膜状的对电极共同组成薄膜状式三电极型传感器。它将酶与
纳米碳管直接混合滴加在工作电极上，然后对底物进行检测，难免存在以下缺点(1)
不能很好地控制酶量使用(2)检测过程易受干扰物的影响，即抗干扰能力不强，(3)酶
固定不够牢固造成电极稳定性不好，重复性差。
总之，在采用生物传感器测试农药残留的己有方法中，生物传感器的灵敏度，稳定 性和抗干扰能力仍然有待进一歩提高。因此，研发灵敏度高，稳定性好，抗干扰能力强 的用于残留农药检测的生物酶电极非常必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供用于检测农药残留的生物酶电极的制作方法， 其中采用了将纳米颗粒和层层自组装技术相结合的方法，进一步提高了用于残留农药检 测的生物酶电极的灵敏度、稳定性和抗干扰能力。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是用于检测农药残留的生物酶电极的制 作方法，采用将纳米颗粒和层层自组装技术相结合的方法，具体歩骤如下
用有机绝缘材料做成棒状电极载体，在其下端的横截面上涂制基体导电材料，形成 电极，或者直接购买到该类电极，再在该电极的导电材料的外表面用如下所述工序制作 由纳米颗粒层、抗干扰层和静电吸附酶层构成的反应层，由此制作成用于检测农药残留 的生物酶电极。
第一步，电极下端导电材料外表面的处理
用铝粉打磨上述电极下端导电材料外表面部分至清洁，然后移入超声波水浴中清洗 2 3分钟，重复3次，再用乙醇、稀盐酸和蒸馏水彻底超声洗涤使该电极下端导电材料 外表面洁净如镜面，晾干后备用；
第二步，用纳米颗粒修饰电极形成纳米颗粒层
将纳米颗粒置于体积比为浓硫酸:浓硝酸=3:1的混酸溶液中，超声震荡4小时，分 散成均匀浅黑色溶液，用离心机10000转/分离心，倒掉上清酸液，再加水超声分散洗 涤5分钟，反复多次洗涤至该黑色溶液近中性，制成浓度为lg/L的纳米颗粒溶液，置于 4'C冰箱中存放待用，将由第一步处理好的电极下端浸入该纳米颗粒溶液中25分钟，在 其导电材料外表面吸附纳米颗粒，形成纳米颗粒层，然后将该电极置于缓冲液中清洗5 分钟，洗去吸附不牢的纳米颗粒，由此完成纳米颗粒修饰电极的工序-，
第三步，层层自组装制备抗干扰层
将第二歩用纳米颗粒修饰的电极的下端浸入到浓度为2mg/mL的聚丙烯胺、聚乙烯亚 胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中至少一种的阳离子高分子聚合物溶液中25分钟，取出该 电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入到浓度为2mg/rnL的聚磺化乙烯、聚磺 化苯乙烯中至少一种的阴离子高分子聚合物溶液中25分钟，重复这个过程直至交替镀上
1 3层高分子聚合物累积膜，完成抗干扰层的制备； 第四歩，层层自组装制备静电吸附酶层
a. 层层自组装制备胆碱氧化酶酶层
将第三步完成抗干扰层制备的电极的下端浸入到混有5%纳米颗粒的浓度为2mg/mL 的聚丙烯胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种的阳离子高分子聚合 物溶液中25分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入到浓度为 2mg/mL的胆碱氧化酶溶液中25分钟，重复这个过程直至交替镀上2 15层高分子聚合 物与酶的复合膜，完成胆碱氧化酶酶层的制备，由此制得检测胆碱的胆碱生物酶电极；
b. 层层自组装制备乙酰胆碱酯酶酶层
将第四步a完成胆碱氧化酶酶层制备的电极的下端浸入到混有5%纳米颗粒的浓度为 2mg/mL的聚丙烯胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种的阳离子高分 子聚合物溶液中25分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入到浓 度为2mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液中25分钟，重复这个过程直至交替镀上1 5层高分子 聚合物与酶的复合膜，完成乙酰胆碱酯酶酶层的制备，也完成了反应层的制作，并最终 制得用于检测乙酰胆碱和农药残留的生物酶电极；
上述用于检测农药残留的生物酶电极的制作方法中，所用溶液的浓度均为重量/体积 百分比浓度，所用的缓冲液的配制方法是将NaOH 1. 874克、KH2P(X 6. 805克，定容于lOOOmL 的容量瓶中，pH8.0。
上述用于检测农药残留的生物酶电极的制作方法中，所述用作电极的基体导电材料 是金、碳、铂或银。
上述用于检测农药残留的生物酶电极的制作方法中，所述用有机绝缘材料做成的棒 状电极载体，其棒状的横截面是方形、长方形、圆形、椭圆形或其他图形。
上述用于检测农药残留的生物酶电极的制作方法中，所述纳米颗粒为纳米碳管或纳 米金，其颗粒大小范围在8 100nm。纳米碳管或纳米金是购买到的公知原料物品。
上述用于检测农药残留的生物酶电极的制作方法中，生物酶电极所选用的有机绝缘 材料是本领域技术人员熟知的。
上述用于检测农药残留的生物酶电极的制作方法中，在有机绝缘材料载体上涂制导 电材料的方法是本领域技术人员熟知的。 本发明的有益效果是
(1) 本发明方法制作的用于检测农药残留的生物酶电极对乙酰胆碱的检测线性范 围5X 10—6 8X 10—4mol/L，检出限为5X 10—6mol/L;对敌百虫的检测线性范围为0. 01 0. 6 pg/mL，检出极限为1 X 10—w mol/L。
(2) 在上述用于检测农药残留的生物酶电极的制作方法中，第四歩a完成制作的胆 碱生物酶电极，对胆碱的检测线性范围5X 10—7 1 X 10—4 mol/L;灵敏度12. 53nA/mmol; 检测时间可控制在7.6秒，检出限为2Xl(Tmol/L。其总体性能优于先前报道的胆碱生 物酶电极。
(3) 本发明方法制作的用于检测农药残留的生物酶电极，修饰有纳米颗粒。由于纳 米颗粒增效效应，该传感器的响应灵敏度明显提高，比未修饰纳米颗粒的高出20%左右。
(4) 本发明方法制作的用于检测农药残留的生物酶电极使用了高分子聚合物多层膜 作为抗干扰层，使得用该生物酶电极组装的整个生物传感器具有抗干扰能力强的特点， 干扰物的影响几乎可以忽略。
(5) 由于本发明用于检测农药残留的生物酶电极的制作方法中，采用了将纳米颗粒 和层层累积自组装技术相结合的方法，既提高了用该生物酶电极组装的生物传感器的灵 敏度，又能很好的控制酶量的使用。层层累积自组装是指分子与分子在一定条件下，利 用分子识别，依赖分子间作用力自发连接成结构稳定的分子聚集体的过程。
本发明的有益效果具体反映在实施例U 12及图3 12中。
总之，本发明用于检测农药残留的生物酶电极的制作方法，方法简单，用该生物酶 电极构成的生物传感器灵敏度高，性能稳定，抗干扰能力强，适用于检测农药残留的生 物传感器产业化的实际应用。
下面结合附图和实施例对本发明进一歩说明。 图1本发明棒状检测农药残留的生物酶电极的纵剖面示意图。 图2本发明检测农药残留的生物酶电极的下端导电材料及其外表面的反应层构成的 示意图。
图3纳米碳管修饰电极(a)与裸铂电极(b)对lmmo1/ L过氧化氢的电流响应。
图4不同层数胆碱氧化酶复合薄膜修饰胆碱生物传感器的循环伏安曲线。
图5胆碱氧化酶复合薄膜的层数对传感器响应电流的影响。
图6胆碱氧化酶复合薄膜修饰传感器对氯化胆碱响应的工作曲线。
图7胆碱氧化酶复合薄膜修饰传感器对氯化胆碱响应的电流-时间曲线。
图8干扰物对Pt/MWCNT/(PAA/PVS)3(PDDA/ChOx)8胆碱传感器响应电流的影响，
该图中，a.胆碱，b.抗坏血酸，c.醋氨酚，d.尿酸，e.胆碱。 图9 Pt/MWCNT/(PAA/PVS)3(PDDA/ChOx)8胆碱传感器的稳定性研究。 图10乙酰胆碱酯酶复合薄膜的层数对传感器响应电流的影响。 图11 Pt/ MWCNT/(PAA/PVS)3(PDDA/ChOx)8+(PDDA/AChE)2复合薄膜修饰电极对
乙酰胆碱响应的电流-时间曲线。
图12农药残留传感器Pt/MWCNT/(PAA/PVS)3(PDDA/ChOx)8+(PDDA/AChE)2对敌
百虫的响应。
图中，l.用有机绝缘材料做成的棒状电极载体，2.在有机绝缘材料做成棒状电极载 体下端的横截面上涂制的导电材料金、碳、铂或银及导电材料外表面的反应层，3.导电 材料金、碳、铂或银，4.纳米颗粒层，5.抗干扰层，6.胆碱氧化酶酶层，7.乙酰胆 碱酯酶酶层。
具体实施例方式
实施例1
用有机绝缘材料做成横截面为方形的棒状电极载体(1)，在其下端的横截面上涂制 金(3)，制作成如图l所示的棒状工作电极。 实施例2
除用碳替换金，横截面为长方形之外，其他同实施例l。 实施例3
除用铂替换金，横截面为圆形之外，其他同实施例l。 实施例4
除用银替换金，横截面为椭圆形之外，其他同实施例l。 实施例5
第一歩，电极下端导电材料外表面的处理
用铝粉打磨由实施例1制得的电极下端涂制的金(3)的外表面部分至清洁，然后移 入超声波水浴中清洗2 3分钟，重复3次，再用乙醇、稀酸和蒸馏水彻底超声洗涤使 工作电极的下端导电材料外表面洁净如镜面，晾干后备用；
第二歩，用纳米碳管修饰工作电极形成纳米颗粒层
将颗粒大小范围在8 100nm的纳米碳管置于体积比为浓硫酸:浓硝酸二3:l的混酸 溶液中，超声震荡4小时分散成均匀浅黑色溶液，用离心机10000转/分离心，倒掉上 清酸液，再加水超声分散洗涤5分钟，反复多次洗涤至该黑色溶液近中性，制成浓度为 lg/L的纳米碳管溶液，置于4。C冰箱中存放待用，将由第一歩处理好的电极的下端浸入 该纳米碳管溶液中25分钟，在其导电材料外表面吸附纳米碳管，然后将该电极置于缓冲 液中清洗5分钟，洗去吸附不牢的纳米碳管，形成纳米颗粒层(4)，由此完成纳米碳管 修饰工作电极的工序；
第三步，层层自组装制备抗干扰层
将第二步用纳米碳管修饰的电极的下端浸入到浓度为2mg/mL的聚丙烯胺阳离子高 分子聚合物溶液中25分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入到 浓度为2mg/mL的聚磺化乙烯阴离子高分子聚合物溶液中25分钟，重复这个过程直至交 替镀上1层高分子聚合物累积膜，完成抗干扰层(5)的制备；
第四步，层层自组装制备静电吸附酶层
a. 层层自组装制备胆碱氧化酶酶层
将第三歩完成抗干扰层制备的电极的下端浸入到混有5%纳米碳管的浓度为2mg/mL 的聚丙烯胺阳离子高分子聚合物溶液中20分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再 取出该电极再浸入到浓度为2mg/mL的胆碱氧化酶溶液中20分钟，重复这个过程直至交 替镀上2层高分子聚合物与酶的复合膜，完成胆碱氧化酶酶层(6)的制备，由此制得检 测胆碱的胆碱生物酶电极；
b. 层层自组装制备乙酰胆碱酯酶酶层
将第四步a完成胆碱氧化酶酶层的制备的电极的下端浸入到混有5%纳米碳管的浓度 为2mg/mL的聚丙烯胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种的阳离子 高分子聚合物溶液中20分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入 到浓度为2mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液中20分钟，重复这个过程直至交替镀上1层高分 子聚合物与酶的复合膜，完成乙酰胆碱酯酶酶层(7)的制备，也完成了如图2所示反应 层(2)的制作，并最终制得检测乙酰胆碱和农药残留的生物酶电极。 实施例6
第一歩，电极下端导电材料外表面的处理
用铝粉打磨由实施例2制得的电极下端涂制的碳(3)的外表面部分至清洁，然后移 入超声波水浴中清洗2 3分钟，重复3次，再用乙醇、稀酸和蒸馏水彻底超声洗涤使 电极的下端导电材料外表面洁净如镜面，晾干后备用；
第二歩，用纳米金修饰电极形成纳米颗粒层
将颗粒大小范围在8 100nm的纳米金置于体积比为浓硫酸:浓硝酸=3:1的混酸溶 液中，超声震荡4小时分散成均匀浅黑色溶液，10000转/分离心，倒掉上清酸液，再 加水超声分散洗涤5分钟，反复多次洗涤至该黑色溶液近中性，制成浓度为lg/L的纳米 金溶液，置于4'C冰箱中存放待用，将由第一步处理好的电极的下端浸入该纳米金溶液 中25分钟，在其导电材料外表面吸附纳米金，然后将该电极置于缓冲液中清洗5分钟， 洗去吸附不牢的纳米金，形成纳米颗粒层(4)，由此完成纳米金修饰电极的工序；
第三歩，层层自组装制备抗干扰层
将第二歩用纳米金修饰的电极的下端浸入到浓度为2mg/mL的聚乙烯亚胺阳离子高 分子聚合物溶液中20分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入到 浓度为2mg/mL的聚磺化苯乙烯阴离子高分子聚合物溶液中20分钟，重复这个过程直至 交替镀上2层高分子聚合物累积膜，完成抗干扰层(5)的制备；
第四步，层层自组装制备静电吸附酶层
a. 层层自组装制备胆碱氧化酶酶层
将第三步完成抗干扰层制备的电极的下端浸入到混有5%纳米金的浓度为2mg/mL的 聚乙烯亚胺阳离子高分子聚合物溶液中20分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再 取出该电极再浸入到浓度为2mg/mL的胆碱氧化酶溶液中20分钟，重复这个过程直至交 替镀上6层高分子聚合物与酶的复合膜，完成胆碱氧化酶酶层(6)的制备，由此制得检 测胆碱的胆碱生物酶电极；
b. 层层自组装制备乙酰胆碱酯酶酶层
将第四步a完成胆碱氧化酶酶层的制备的电极的下端浸入到混有5。/。纳米金的浓度为 2mg/mL的聚乙烯亚胺阳离子高分子聚合物溶液中20分钟，取出该电极再浸入缓冲液中 5分钟，再取出该电极再浸入到浓度为2mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液中20分钟，重复这 个过程直至交替镀上2层高分子聚合物与酶的复合膜，完成乙酰胆碱酯酶酶层(7)的制 备，也完成了如图2所示反应层(2)的制作，并最终制得检测乙酰胆碱和农药残留的生
物酶电极。 实施例7
第一步，电极下端导电材料外表面的处理
用铝粉打磨由实施例3制得的电极下端涂制的铂(3)的外表面部分至清洁，然后移 入超声波水浴中清洗2 3分钟，重复3次，再用乙醇、稀酸和蒸馏水彻底超声洗涤使 电极的下端导电材料外表面洁净如镜面，晾干后备用；
第二步，用纳米碳管修饰电极形成纳米颗粒层
将颗粒大小范围在8 100nm的纳米碳管置于体积比为浓硫酸浓硝酸二3:1的混酸 溶液中，超声震荡4小时分散成均匀浅黑色溶液，10000转/分离心，倒掉上清酸液， 再加水超声分散洗涤5分钟，反复多次洗涤至该黑色溶液近中性，制成浓度为lg/L的纳 米碳管溶液，置于4'C冰箱中存放待用，将由第一歩处理好的电极的下端浸入该纳米碳 管溶液中25分钟，在其导电材料外表面吸附纳米碳管，然后将该电极置于缓冲液中清洗 5分钟，洗去吸附不牢的纳米碳管，形成纳米颗粒层(4)，由此完成纳米碳管修饰电极 的工序；
第三步，层层自组装制备抗干扰层
将第二歩用纳米碳管修饰的电极的下端浸入到浓度为2mg/mL的聚二烯丙基二甲基 氯化铵阳离子高分子聚合物溶液中20分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出 该电极再浸入到浓度为2mg/mL的聚磺化乙烯与聚磺化苯乙烯以任意比例混合的阴离子 高分子聚合物溶液中20分钟，重复这个过程直至交替镀上3层高分子聚合物累积膜，完 成抗干扰层(5)的制备；
第四步，层层自组装制备静电吸附酶层
a. 层层自组装制备胆碱氧化酶酶层
将第三步完成抗干扰层制备的电极的下端浸入到混有5%纳米碳管的浓度为2mg/mL 的聚二烯丙基二甲基氯化铵高分子聚合物溶液中20分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5 分钟，再取出该电极再浸入到浓度为2mg/mL的胆碱氧化酶溶液中20分钟，重复这个过 程直至交替镀上8层高分子聚合物与酶的复合膜，完成胆碱氧化酶酶层(6)的制备，由 此制得检测胆碱的胆碱生物酶电极；
b. 层层自组装制备乙酰胆碱酯酶酶层
将第四步3完成胆碱氧化酶酶层的制备的电极的下端浸入到混有5%纳米碳管的浓度
为2mg/mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵阳离子高分子聚合物溶液中20分钟，取出该电极 再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入到浓度为2mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液中 20分钟，重复这个过程直至交替镀上3层高分子聚合物与酶的复合膜，完成乙酰胆碱酯 酶酶层(7)的制备，也完成了如图2所示反应层(2)的制作，并最终制得检测乙酰胆 碱和农药残留的生物酶电极。 实施例8
第一歩，电极下端导电材料外表面的处理
用铝粉打磨由实施例4制得的电极下端涂制的银(3)的外表面部分至清洁，然后移 入超声波水浴中清洗2 3分钟，重复3次，再用乙醇、稀酸和蒸馏水彻底超声洗涤使 电极的下端导电材料外表面洁净如镜面，晾干后备用；
第二步，用纳米碳管修饰电极形成纳米颗粒层
将颗粒大小范围在8 100皿的纳米碳管置于体积比为浓硫酸:浓硝酸=3:1的混酸 溶液中，超声震荡4小时分散成均匀浅黑色溶液，10000转/分离心，倒掉上清酸液， 再加水超声分散洗涤5分钟，反复多次洗涤至该黑色溶液近中性，制成浓度为lg/L的纳 米碳管溶液，置于4'C冰箱中存放待用，将由第一歩处理好的电极的下端浸入该纳米碳 管溶液中25分钟，在其导电材料外表面吸附纳米碳管，然后将该电极置于缓冲液中清洗 5分钟，洗去吸附不牢的纳米碳管，形成纳米颗粒层(4)，由此完成纳米碳管修饰电极 的工序；
第三步，层层自组装制备抗干扰层 同实施例7;
第四步，层层自组装制备静电吸附酶层
a. 层层自组装制备胆碱氧化酶酶层
将第三步完成抗干扰层制备的电极的下端浸入到混有5%纳米碳管的浓度为2mg/mL 的聚丙烯胺与聚乙烯亚胺以任意比例混合的阳离子高分子聚合物溶液中20分钟，取出该 电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入到浓度为2mg/mL的胆碱氧化酶溶液 中20分钟，重复这个过程直至交替镀上10层高分子聚合物与酶的复合膜，完成胆碱氧 化酶酶层(6)的制备，由此制得检测胆碱的胆碱生物酶电极；
b. 层层自组装制备乙酰胆碱酯酶酶层
将第四步a完成胆碱氧化酶酶层的制备的电极的下端浸入到混有5%纳米碳管的浓度 为2mg/mL的聚丙烯胺与聚二烯丙基二甲基氯化铵以任意比例混合的阳离子高分子聚合 物溶液中20分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入到浓度为 2mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液中20分钟，重复这个过程直至交替镀上4层高分子聚合物 与酶的复合膜，完成乙酰胆碱酯酶酶层(7)的制备，也完成了如图2所示反应层(2) 的制作，并最终制得检测乙酰胆碱和农药残留的生物酶电极。 实施例9
第一步，电极下端导电材料外表面的处理 同实施例7;
第二步，用纳米碳管修饰电极形成纳米颗粒层 同实施例7;
第三歩，层层自组装制备抗干扰层
同实施例7;
第四步，层层自组装制备静电吸附酶层
a.层层自组装制备胆碱氧化酶酶层
将第三步完成抗干扰层制备的电极的下端浸入到混有5%纳米碳管的浓度为2mg/mL 的聚丙烯胺、聚乙烯亚胺与聚二烯丙基二甲基氯化铵以任意比例混合的阳离子高分子聚 合物溶液中20分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入到浓度为 2mg/mL的胆碱氧化酶溶液中20分钟，重复这个过程直至交替镀上12层高分子聚合物 与酶的复合膜，完成胆碱氧化酶酶层(6)的制备，由此制得检测胆碱的胆碱生物酶电极；
b.层层自组装制备乙酰胆碱酯酶酶层
将第四步a完成胆碱氧化酶酶层的制备的电极的下端浸入到混有5%纳米碳管的浓度 为2mg/mL的聚丙烯胺、聚乙烯亚胺与聚二烯丙基二甲基氯化铵以任意比例混合的阳离 子高分子聚合物溶液中20分钟，取出该电极冉浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸 入到浓度为2mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液中20分钟，重复这个过程直至交替镀上5层高 分子聚合物与酶的复合膜，完成乙酰胆碱酯酶酶层(7)的制备，也完成了如图2所示反 应层(2)的制作，并最终制得检测乙酰胆碱和农药残留的生物酶电极。 实施例10
第一步，电极下端导电材料外表面的处理 同实施例7;
第二步，用纳米碳管修饰电极 同实施例7;
第三步，层层自组装制备抗干扰层 同实施例7;
第四歩，层层自组装制备静电吸附酶层
a. 层层自组装制备胆碱氧化酶酶层
将第三步完成抗干扰层制备的电极的下端浸入到混有5%纳米碳管的浓度为2mg/mL 的聚丙烯胺与聚二烯丙基二甲基氯化铵以任意比例混合的阳离子高分子聚合物溶液中 20分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入到浓度为2mg/mL的 胆碱氧化酶溶液中20分钟，重复这个过程直至交替镀上15层高分子聚合物与酶的复合 膜，完成胆碱氧化酶酶层(6)的制备，由此制得检测胆碱的胆碱生物酶电极；
b. 层层自组装制备乙酰胆碱酯酶酶层
将第四歩a完成胆碱氧化酶酶层的制备的电极的下端浸入到混有5%纳米碳管的浓度 为2mg/mL的聚丙烯胺与聚二烯丙基二甲基氯化铵以任意比例混合的阳离子高分子聚合 物溶液中20分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入到浓度为 2mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液中20分钟，重复这个过程直至交替镀上1层高分子聚合物 与酶的复合膜，完成乙酰胆碱酯酶酶层(7)的制备，也完成了如图2所示反应层(2) 的制作，并最终制得检测乙酰胆碱和农药残留的生物酶电极。
上述实施例5 10中，所用溶液的浓度均为重量/体积百分比浓度，所用的缓冲液的 配方是将NaOH 1.874克、KH2P04 6. 805克，定容于1000mL的容量瓶中，pH8.0。
实施例11
将上述实施例7第四歩a中制得的胆碱生物酶电极作作为工作电极，与对电极(铂 丝)和参比电极(Ag/AgCl)—起构成检测胆碱的三电极系统的生物传感器，其组装方法是 本领域技术人员所熟知的。以20mL 0. 10mol/L的磷酸盐缓冲液为电解质，在+0. 6V下 测定该生物传感器对胆碱的响应电流，该测定方法和过程是本领域技术人员所熟知的， 测定结果见图3 9。由此可见，用本发明制作方法制得的胆碱生物酶电极对胆碱的检测 线性范围5X10—7 lX104mol/L;灵敏度12. 53nA/mmol;检测时间可控制在7. 6秒， 检出限为2X10—7mol/L。 实施例12
将上述实施例7中制得的用于检测农药残留的生物酶电极作为工作电极，与对电极 (铂丝)和参比电极(Ag/AgCl)—起构成检测农药残留的三电极系统的生物传感器，其组 装方法和测定方法同实施例11，测定结果见图10 12。该生物酶电极对乙酰胆碱的检测 线性范围5X10—6 8X10—4mol/L，检出限5 X l(T6 mol/L;对敌百虫的检测线性范围为 0. 01 0. 6pg/mL，检出限为1X10—"'mol/L，用本发明制作方法制得的检测农药残留的生 物酶电极可实现对敌百虫的快速在线检测，检测时间可控制在8分钟。
权利要求
1.用于检测农药残留的生物酶电极的制作方法，其特征在于采用将纳米颗粒和层层自组装技术相结合的方法，具体步骤如下用有机绝缘材料做成棒状电极载体，在其下端的横截面上涂制基体导电材料，形成电极，或者直接购买到该类电极，再在该电极的导电材料的外表面用如下所述工序制作由纳米颗粒层、抗干扰层和静电吸附酶层构成的反应层，由此制作成用于检测农药残留的生物酶电极，第一步，电极下端导电材料外表面的处理用铝粉打磨上述电极下端导电材料外表面部分至清洁，然后移入超声波水浴中清洗2～3分钟，重复3次，再用乙醇、稀盐酸和蒸馏水彻底超声洗涤使该电极下端导电材料外表面洁净如镜面，晾干后备用；第二步，用纳米颗粒修饰电极形成纳米颗粒层将纳米颗粒置于体积比为浓硫酸∶浓硝酸＝3∶1的混酸溶液中，超声震荡4小时，分散成均匀浅黑色溶液，用离心机10000转/分离心，倒掉上清酸液，再加水超声分散洗涤5分钟，反复多次洗涤至该黑色溶液近中性，制成浓度为1g/L的纳米颗粒溶液，置于4℃冰箱中存放待用，将由第一步处理好的电极下端浸入该纳米颗粒溶液中25分钟，在其导电材料外表面吸附纳米颗粒，形成纳米颗粒层，然后将该电极置于缓冲液中清洗5分钟，洗去吸附不牢的纳米颗粒，由此完成纳米颗粒修饰电极的工序；第三步，层层自组装制备抗干扰层将第二步用纳米颗粒修饰的电极的下端浸入到浓度为2mg/mL的聚丙烯胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中至少一种的阳离子高分子聚合物溶液中25分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入到浓度为2mg/mL的聚磺化乙烯、聚磺化苯乙烯中至少一种的阴离子高分子聚合物溶液中25分钟，重复这个过程直至交替镀上1～3层高分子聚合物累积膜，完成抗干扰层的制备；第四步，层层自组装制备静电吸附酶层a.层层自组装制备胆碱氧化酶酶层将第三步完成抗干扰层制备的电极的下端浸入到混有5％纳米颗粒的浓度为2mg/mL的聚丙烯胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种的阳离子高分子聚合物溶液中25分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入到浓度为2mg/mL的胆碱氧化酶溶液中25分钟，重复这个过程直至交替镀上2～15层高分子聚合物与酶的复合膜，完成胆碱氧化酶酶层的制备，由此制得检测胆碱的胆碱生物酶电极；b.层层自组装制备乙酰胆碱酯酶酶层将第四步a完成胆碱氧化酶酶层制备的电极的下端浸入到混有5％纳米颗粒的浓度为2mg/mL的聚丙烯胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种的阳离子高分子聚合物溶液中25分钟，取出该电极再浸入缓冲液中5分钟，再取出该电极再浸入到浓度为2mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液中25分钟，重复这个过程直至交替镀上1～5层高分子聚合物与酶的复合膜，完成乙酰胆碱酯酶酶层的制备，也完成了反应层的制作，并最终制得用于检测乙酰胆碱和农药残留的生物酶电极；上述用于检测农药残留的生物酶电极的制作方法中，所用溶液的浓度均为重量/体积百分比浓度，所用的缓冲液的配制方法是将NaOH 1.874克、KH2PO4 6.805克，定容于1000mL的容量瓶中，pH8.0。
2. 根据权利要求1所述检测农药残留的生物酶电极的制作方法，其特征在于所述 用作电极的基体导电材料是金、碳、铂或银。
3. 根据权利要求1所述检测农药残留的生物酶电极的制作方法，其特征在于所述 用有机绝缘材料做成的棒状电极载体，其棒状的横截面是方形、长方形、圆形、椭圆形 或其他图形。
4. 根据权利要求1所述检测农药残留的生物酶电极的制作方法，其特征在于所述 纳米颗粒为纳米碳管或纳米金，其颗粒大小范围在8 100nm。
全文摘要
本发明用于检测农药残留的生物酶电极的制作方法属于生物化学电极，该制作方法采用将纳米颗粒和层层自组装技术相结合的方法，步骤是用有机绝缘材料做成棒状电极载体，在其下端的横截面上涂制基体导电材料，形成电极、或者直接购买到该类电极，再在该电极的导电材料的外表面，用纳米颗粒修饰电极形成纳米颗粒层，层层自组装制备抗干扰层，层层自组装制备静电吸附酶层，得到由纳米颗粒层、抗干扰层和静电吸附酶层构成的反应层，并由此制作成用于检测农药残留的生物酶电极。本发明制作方法简单，用该方法制作的生物酶电极组装的生物传感器灵敏度高，性能稳定，抗干扰能力强，适用于检测农药残留的生物传感器产业化的实际应用。
文档编号G01N27/327GK101178375SQ20071015084
公开日2008年5月14日 申请日期2007年12月10日 优先权日2007年12月10日
发明者杨星群, 新 王, 王新胜, 王艳艳, 霞 秦, 赵紫霞, 强 陈, 马维一 申请人:杨星群;马维一;陈 强