专利名称：一种检测倍硫磷含量的方法
技术领域：
本发明是有关于一种检测倍硫磷(Fenthion)含量的方法，其步骤包含(A)在一反应溶液，混入一种抗倍硫磷(fenthion)的抗体，以及葡萄糖六磷酸去氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)倍硫磷共轭(fenthion conjugate)；(B)进行测试采样；(C)将NAD+及葡萄糖六磷酸去氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)至混合溶液中；及(D)利用一光谱仪来检测在340nm之NADH的成长速率。
背景技术：
由于杀虫剂的广泛使用，使得对于环境及食物的污染日趋严重，在众多种类的杀虫剂之中，倍硫磷[O，O-二甲基O-[3-甲基-4(甲硫基)苯基]硫代磷酸酯]([O，O-dimethyl O-[3-methyl-4-(methylthio)phenyl]phosphorothioate])是一种全球普遍所使用的有机磷杀虫剂(organophosphorus insecticide)，其使用在不同类型的耕作上，以控制许多吸吮及咬噬的害虫，特别是果蝇、叶蝉、侵食叶子的虫(leafminers)、侵食茎部的虫(stem borers)及谷虫(cereal bugs)等(参考文献Tomlin，1997)。而倍硫磷是众所周知会释放出严重的致命剧毒，而且会经由皮肤的接触、吸入或是摄取而累积，在使用该倍硫磷之后，最敏感及毒性的相关影响是抑制了乙酰胆碱酯脢的活性(acetylcholinesterase activity)(参考文献Tomlin，1997)。使用倍硫磷杀虫剂而中毒的病患死亡率，比起使用其它有机磷杀虫剂(organophosphorus insecticide)来得更高(参考文献Eddleston et al.，2005)。因此，倍硫磷对于广泛种类的生物及环境上的污染测试采样分析是必要的。就目前的方法而言，例如气相层析法(gaschromatography)及高效率液相层析法(high-performance liquidchromatography)具有高敏感度及可信度，都曾经成功地被使用于分析许多种杀虫剂(参考文献AOAC International，1995)。然而，这些典型的方法都需要更高的成本及具备高技术的分析师，并且，需要费时的采样配制步骤(sample preparation steps)，因此，对于一种检测杀虫剂残留物的更快速及更具经济效益的方法，其需求日益增加。免疫分析法(immunoassays)，即可符合此项需求，除了传统的方法之外，近来免疫分析法的出现，日渐成为了另一项选择。
自从Yalow and Berson(1960)揭露了一种竞争性结合免疫分析法(competitive binding immunoassay)来侦测胰岛素(insulin)，目前免疫分析法是在医学分析上经常使用的一种方法(参考文献Andreotti et al.，2003；Tetin and Stroupe，2004)，在环境的检测上(参考文献Hennion andBarcelo，1998；Morozova et al.，2005)，以及为侦测出生化战剂(chemical andbiological warfare agents)的先前警告系统(参考文献Andreotti et al.，2003；Peruski and Peruski Jr.，2003)。组合具有高度专一性(high specificity)的抗体与放射性示踪剂(radiotracers)的敏感度，放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)可测出多种类极小基质的分析物(参考文献Petkam et al.，2005；Revoltella et al.，1998)。最近，非同位素标记物(non-isotopic labels)越来越普及，因为他们可以避免放射性同位素在使用上先天的缺点，放射性示踪剂取代基(substituents)标记物可包括荧光分子(fluorescent molecules)(参考文献Biagini et al.，2004)、化学发光前驱物(chemiluminescent precursors)(参考文献Chouhan et al.，2006)、噬菌体(bacteriophages)(参考文献Tout et al.，2001)、电气化学的卷标(electrochemical tag)(参考文献Killard er al.，2000)、DNA(参考文献Adler et al.，2005)、以及酶(enzymes)(参考文献Wang et al.，2005)，每一种类型的标记物(labels)都具有其特定的优点及限制，在这些标记物(labels)之中，以酶(enzymes)为最具吸引力的标记物(labels)，因为其活性(activities)可使他们扮演有如放大器的角色，而酶免疫分析法(enzymeimmunoassay，EIA)的最主要优点在于利用酶标记物(enzyme labels)来设计出竞争性结合分析测定法(competitive binding assays)，使含极少量分析物可由动力分析法(kinetic methods)在相对较短的时间内被测出(参考文献Brun et al.，2004；Cho et al.，2003；Kim et al.，2002；Wang et al.，2005)。在大部分的实例中，底物耗损速度(rate ofsubstrate depletion)或是生成物的形成可由简单的分光光度法(spectrophotometric method)来测定，EIAs可被分类为异质性(heterogeneous)(例如酶联免疫吸附分析法enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)或是同构型(homogeneous)(例如酶多重免疫分析法enzyme-multiplied immunoassay technique，EMIT)，由于较低敏感度，同构型的方法不需要费时的洗涤步骤来分离结合标记物(bound labels)及非结合标记物(unbound labels)，因此，可更快速且适合自动操作(automation)(参考文献Kim et al.，1990及1994)。在Rubenstein et al.，1972的文献中率先提出EMIT的方法，由抗-半抗原抗体(anti-hapten antibodies)，从溶液中抑制适当的酶半抗原(enzyme-hapten)(分析物的类似物analyte analogue)共轭催化活性而得出分析的标志结果。经抑制的酶活性(enzymatic activity)可恢复，在采样中其恢复程度与该自由分析物(free analyte)的浓度成正比，而对于会导致人类严重中毒的倍硫磷，其EMIT检测方法尚未有所揭露。
对于ELISAs敏感度的改良，可由强化分析物对于抗体的专一性(specificity)及亲和力(affinity)而获得，在实验上及理论上两者皆经证实(参考文献Bachas and Meyerhoff，1986)，自由分析物(free analyte)对于酶-半抗原共轭(enzyme-hapten conjugate的亲和力常数比率(affinityconstant ratio)越高，所测得该自由分析物(free analyte)之浓度则越低；且经实验证实，侦测的限制可由于桥连基(bridging group)的识别抗体(antibody recognition)所影响，其是共价连结(covalently links)该抗半原(hepten)及该酶(参考文献Abuknesha and Luk，2005a及2005b)。由于相同于此种连结通常用于免疫原(immunogen)配制以抗体形成(antibodyformation)，相较于对自由分析物(free analyte)，其所产生的抗体对于酶-标记半抗原而言通常具有较高度亲和力(affinity)。其中一种解决在ELISAs中这种桥连基(bridging group)识别问题的方法是改变酶-半抗原共轭物(或蛋白质-半抗原载体(carrier protein-hapten)，即免疫原(immunogen))的桥连基(bridging group)结构，因此，对于该抗体会显示较低的亲和力。利用对于抗体的较低紧密结合的酶-半抗原共轭物(less tight bindingenzyme-hapten conjugate)，任意分析物的剂量反应(dose response)特征可加以改进。然而，桥连基(bridging group)结构对于EMIT敏感度(sensitivity)影响的评估尚未有所揭露。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测倍硫磷含量的方法，本发明提供的是新颖的EMIT法(即同构型竞争性酶免疫分析法homogeneous competitiveenzyme immunoassay)，该方法可快速并方便于在剂量反应变化中，测出倍硫磷(fenthion)含量及对于半抗原桥连基(hapten bridging group)的影响，其用于配制酶共轭物(enzyme conjugate)或免疫原(immunogen)以抗体。
为实现上述目的，本发明提供的检测倍硫磷含量的方法，其步骤包含 (A)在一反应溶液，混入一种抗倍硫磷(fenthion)的抗体，以及葡萄糖六磷酸去氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)倍硫磷共轭(fenthion conjugate)，如下列化学式
(B)进行测试采样； (C)将NAD+及葡萄糖六磷酸去氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase，G6PDH)至混合溶液中；及 (D)利用一光谱仪来检测在340nm的NADH的成长速率。
图1显示倍硫磷及半抗原(用于免疫及共轭物的倍硫磷类似物)结构。
图2显示反应作用序列用于配制葡萄糖六磷酸去氢酶-(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)半抗原共轭物(haptenconjugate)。
图3显示抗体稀释曲线图，以1∶100稀释(8.96×10-7M)G6PDH-2AII.2A(Ab)、anti-2A抗体；3A(Ab)、anti-3A抗体；4A(Ab)、anti-4A抗体。
图4显示结合动力以G6PDH-2AII的1∶100的稀释(8.96×10-7M)以及3种不同的抗体(1∶1250稀释)之间。
图5显示倍硫磷的剂量反应曲线图，以G6PDH-2AII的1∶100的稀释(8.96×10-7M)，以及三种不同的抗体的1∶1250的稀释。
具体实施例 基于参考下列所提供的实施例及比较例来更详细说明本发明，以更加了解本发明及其所伴随的优点。然而，此实施例及比较例仅为例示本发明的目的，而本发明范围并未受限于下述实施例及比较例。
实施例1G6PDH-半抗原共轭物的配制 (1)化学品(chemicals) 来自Leucinostoc mensenteroiders的葡萄糖六磷酸去氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)、葡萄糖六磷酸(G6P)、β-烟酰胺腺嘌呤二核酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)、草酰乙酸(oxaloacetic acid，OAA)，及经缩小的NAD+形式(即NADH)，其是从Sigma(St.Louis，MO)所取得，而倍硫磷(fenthion)则是向Dr.Ehrenstorfer(Augsburg，Germany)所购得。用于酶-半抗原共轭(enzyme-hapten conjugates)的联结缓冲液(coupling buffers)为0.10M，碳酸氢纳缓冲液(sodium bicarbonate buffer)，pH为9.0。用于G6PDH-半抗原共轭的检测缓冲液(working assay buffer)为0.05M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸(Tris-HCL)缓冲液(tris(hydroxyl)aminomethane-hydrochloricacid buffer)，pH为7.8，含有0.1M的NaCl、0.01％(w/v)NaN3、及0.3％(w/v)白明胶(gelatin)。利用脱离子水(deionized water)来配制所有缓冲液(buffer)，每一个实验都经重复三次并显示出其中间值。
(2)半抗原合成及抗原制造(synthesis of hepten and production ofantibodies) 请参阅图1，其描述倍硫磷(fenthion)、半抗原(haptens)(利用倍硫磷类似物以配制免疫原及酶示踪剂)及半抗原衍生物(hapten derivatives)(利用半抗原的二酰亚胺酯种类(succinimide ester forms)来配制共轭物)的结构。有关该半抗原(F、2A～6A)的合成、半抗原衍生物(haptenderivatives)及牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)-半抗原共轭物(hapten conjugates)的工艺，以及对于倍硫磷的多株抗体(polyclonalantibodies)的制造在本发明以前的研究中已经有所描述(参考文献Kimel al.，2003)。
(3)G6PDH-半抗原共轭物之配制 酶-半抗原共轭物是利用具有G6PDH(请参阅图2)的半抗原衍生物(hapten derivatives)所合成，该半抗原衍生物被溶解在二甲基甲酰胺(dimethyl formamide，DMF)中，加入小量于酶溶液(enzyme solution)中，并缓冲至pH为9.0(HCO33-/CO32-)，该耦合反应(coupling reaction)在4℃的状态持续进行搅拌24小时，在反应作用期间，以加入额外的底物(substrates)(G6P及NADH)以保护G6PDH的催化活性位(catalyticactive site)。在反应作用之后，以该检测缓冲液(working assay buffer)，该G6PDH-半抗原共轭物被透析，以移除未进行反应作用的半抗原衍生物(unreacted hapten derivatives)，该共轭物被移转至一小瓶并以该检测缓冲液(working assay buffer)调整其最后剂量至2ml，该经配制的G6PDH-及BSA-半抗原共轭物如表1中所示，所产生的共轭特征是其所残留的活性及额外的抗体所诱导出的抑制率(％)，所有的溶液都被冰存在冷藏室中。
表1利用半抗原以配制G6PDH-半抗原及BSA(bovine serum albumin)-半抗原共轭物。
aG6PDH-半抗原共轭物之甲基链数量系从1-4。
bBSA-半抗原共轭物之甲基链数量系从2-6。
(4)结果 在一个成功的同构型(homogeneous)EIA的发展过程中，配制适当的酶-半抗原(分析物的类似物analyte analogue)共轭物是很重要的，当结合抗-半抗原抗体于共轭时，必须以可测量的方式改变共轭催化特性，而必须保留底物残留活性(substantial residual activity)同时又不具抗体。自由分析物(free analyte)存在时，经过了竞争性结合自由分析物及酶-半抗原共轭物(enzyme-hapten conjugate)至限制量的抗-半抗原抗体(anti-haptenantibody)，该酶的经调控的催化活性(catalytic activities)也必须恢复。由于酶(enzyme)要成为一适当的标记物，必须达到这些标准，对于酶(enzyme)的选择相较于用于异质性(heterogeneous)EIA有更多的限制，此外，这些检测在活性酶(enzyme)测定之前，不需要将任何未结合的酶标记-半抗原(unbound enzyme-labeled hapten)(例如酶-半抗原)从采样介质(sample media)中分离。
在众多的酶(enzyme)中，G6PDH在同构型(homogeneous)EMIT类型的检测法(参考文献Kim et al.，1990，1994及1995)中已被广泛使用为标记物，对于本发明所提供的研究，几个G6PDH-半抗体共轭物被合成如图2中所示。在该G6PDH分子具有半抗体结构中的特定残留物的替换物(substitution)，其具有不同的烷基链长度(alkyl chain length)的桥连基(bridging group)附着在倍硫磷(fenthion)的磷酸盐位置(phosphateposition)，该替换物是用于合成G6PDH-半抗原共轭。该半抗原部分(haptenmoiety)的剩余结构则原封不动地保存以可被抗体所识别的所有决定基(determinant groups)，因此，在与抗体交互作用(interaction)之后，该连结显然使该G6PDH对于结构上的改变变得敏感，并导致酶活性的抑制(inhibition)。为了要取得适当的G6PHD-半抗原共轭物，在配制该共轭物时利用具有不同半抗原/G6PDH的起始摩尔比率(initial molar ratios)的四个不同的半抗原衍生物(hapten derivatives)。所产生的共轭物的特征是其所残留活性(residual activities)及额外的不同抗体所引来的抑制率(percentinhibition)，其是从相类似半抗原结构的免疫原(immunogens)所诱导出来的，用来配制酶半抗原共轭物(enzyme-hapten conjugates)。由于要单独将一免疫反应(immunological response)诱导出来，该半抗原(倍硫磷的类似物)分子太小，在注入动物体内之前，必须先附着一载体蛋白质(carrierprotein)(例如牛血清蛋白bovine serum albumin，BSA)，因此会产生抗-半抗原抗体(anti-hapten antibodies)。利用这种免疫法工艺(immunizationprocedure)所取得的结果抗体(resulting antibodies)可识别半抗原结构(hapten structure)，当被连结至载体蛋白质(carrier protein)，比起在溶液中未经标记半抗原(unlabled hapten)(例如自由分析物free analyte)具有更多的选择性，这可能会导致在竞争型检测(competitive type assay)中较少的剂量反应敏感度(sensitive dose-response)，其由于在经标记半抗原(labeled hapten)(例如BSA-半抗原)及自由分析物(free analyte)之间不相等的竞争力。在同构型倍硫磷检测(homogeneous fenthion assay)的设计中，用以调查桥连基(bridging group)识别影响的可能性，利用几个抗体。而该抗体是由具有不同烷基链连结长度(linking length of alkyl chain)附着在倍硫磷的磷酸盐位置(phosphate position)的不同BSA-半抗原免疫原(BSA-hapten immunogens)所诱导出来。
实施例2测定酶活性及G6PDH-半抗原共轭物的最大抑制率(maximum percent inhibition)。
(1)仪器 酶的活性是由一Gilford-Stasaar-III的分光光度计(spectrophotometer)所测定的，其装配有一真空操作取样系统(vacuum-operated samplingsystem)及温度控制容器(temperature-controlled cuvette)(在整个实验过程中维持在30℃)。此分光光度计连接至Syva CP-5000 EMIT ClinicalProcessor(Mountain View，CA)，一种临床处理器，用于自动设定间隔读数(reading intervals)及吸光值(absorbance values)的记录，利用Pierce公司(Rockford，IL)所生产的一微量透析仪系统(microdialyzer system500)，用以透析酶-半抗原共轭。
(2)测定酶的活性 该G6PDH-半抗原共轭物的活性，其是在加入100μl的NAD+(32.5mM在检测缓冲液中，pH为7.8)、100μl的G6P(50mM在检测缓冲液中，pH为7.8)、以及100μl经适当稀释的共轭物溶液至一装有700μl检测缓冲液的可弃式塑料管中之后，由检测其NADH在340nm的成长速率来测定。对于每一个检测，将试剂(reagents)混入之后，接着以一振动器(vibrator)摇动2秒，该反应混合物(reaction mixture)被吸出至该分光光度计的恒温流动处理槽(thermostated flow cell)，并且在起始的10秒之后，在1分钟期间，测定在340nm的吸光值。
(3)最大抑制率(maxium percent inhibition) 为了要测定对于共轭物的最大抑制率，100μl的检测缓冲液(assaybuffer)被在该检测缓冲液中所配制具有同样份量的抗体溶液所取代，此外，在加入该底物溶液(substrate solutions)之前，每个G6PHD-半抗原共轭物是以五种不同的抗体对于半抗原(2A、3A、4A、5A及6A)先培养(incubated)10分钟。
(4)结果 为了要以抗-半抗原抗体(anti-hapten antibodies)诱导出大量的抑制，对于同构型EIAs而言，众所皆知需要高含量(high degree)的半抗原共扼物(hapten conjugate)(每一个酶分子的半抗原分子数量)(参考文献Kimet al.，1990，1992及1995)。配制几个具有不同的半抗原对于酶的起始摩尔比率(initial molar ratio)的G6PHD-半抗原共轭物，该结果总结如表2。该共轭物具有摩尔比率70及100分别显示高残留酶活性。经配制的共轭物以起始摩尔比率高于100而言，其并未显示有意义的残留活性(表中未显示该数据)，因此，无法使用作为一G6PDH-半抗原共轭物。酶的活性位(active sites)在耦合反应(coupling reaction)期间受到保护，然而，在其它研究报告提及，反应后的共轭物具有高于100以上的半抗原(或配位体ligand)对酶起始摩尔比率，便显示较低的残留活性(参考文献Kim etal.，1990、1992及1995)。
表2G6PDH-半抗原共轭物的特征。
a利用该G6PDH-半抗原共轭物的1∶100的稀释(8.96×10-7M)以测定残留活性率。
从抑制的研究中可发现，经配制的G6PDH-半抗原共轭物，具有与原本的BSA-半抗原免疫原(BSA-hapten immunogen)相同的半抗原连结结构(haptenic linking structure)，会显示由抗体所诱导出来的最高抑制率(如表3所示)。
表3当额外抗体存在时，G6PDH-半抗原共轭物的抑制率。
a利用G6PDH-半抗原共轭物1∶100的稀释(8.96×10-7M)及抗体1∶500的稀释来测定抑制比率。
该结果意味着，每个抗体可识别特定共轭物的桥连基(bridginggroup)，因此，相较于半抗原具有不同连结结构的其它任何G6PDH-半抗原共轭物，其结合更为紧密且/或更有选择性。然而，这些具有更高抑制特征的抗体，比起以抗体的G6PDH-半抗原共轭物，可能会导致自由分析物之结合紧密度较低，对于此变化将详细讨论于下列有关抗体稀释(antibodydilution)及竞争性剂量反应(competitive dose-response)研究的部分。该经配制的共轭物以起始摩尔比率100，相较于以起始摩尔比率70而言，能显示出较高的抑制率。基于具有实际残留活性(residual activity)较高的最大抑制率，选择G6PDH-2AII及三个抗体[2A(Ab)、3A(Ab)及4A(Ab)]作为酶-半抗原共轭物，并利用抗-半抗原抗体在所有接下来的同构型结合研究上。
实施例3对于G6PDH-半抗原共轭物抑制的动力研究(kineticstudies)。
(1)结合动力研究 在6PDH-半抗原共轭物及抗-半抗原抗体之间的结合速率是利用不同的培育时间(incubation time)的期间而测定，该检测溶液含有100μl份量的经适当稀释共轭物(1/100稀释；8.96×10-7M的浓度)，以及100μl的抗体溶液(1/1250稀释)被混入并培养0～30分钟。每个培育期之后，如上所述，由加入底物来测定共轭物的酶活性，利用标绘抑制率相对于培育期的位置来制定动力成长曲线(kinetic curves)。
(2)不同抗体及G6PDH-半抗原共轭物抑制的浓度的影响。
利用Aliquots型号的等分注器(100μl)，装着含有具不同浓度的不同抗体的抗体溶液，以100μl经适当稀释(8.96×10-7M的浓度)的G6PDH-半抗原共轭物培育10分钟。在培育期之后，如上所述，可测定酶活性，利用标绘抑制率相对于所加入抗体的稀释因子(1/50～1/2000)来制定抗体稀释曲线(antibody dilution curves)。
(3)结果 不同的抗-半抗原抗体[2A(Ab)、3A(Ab)及4A(Ab)]不同的稀释与G6PDH-2AII共轭物，对于观察所得的抑制率影响都被测出来。如上面实验可证实(请参阅表3)，当利用三个不同的抗体时(请参阅图3)，最大值抑制率的差异可被测出，相对而言，每个抗体需要少量以抑制该G6PDH-2AII共轭物所提出的浓度(原G6PDH-2AII共轭配制的1∶100稀释；8.96×10-7M)，并且，每个抗体最理想的含量系原本抗体配制1∶1250的稀释，而用于具有相同混合浓度之G6PDH-2AII共轭的不同抗体，其抗体稀释曲线特征是基于几个因素。抗原(antigen)与抗体的结合可能涉及静电交互作用(electrostatic interaction)、疏水性交互作用(hydrophobicinteractions)、氢键(hydrogen bonds)、及范德华力((van der Waals forces)(参考文献Farr et al.，2002；Paula et al.，2004)。这些交互作用与介于抗原及抗体之间的距离是成反比的，与抗体结合位(antibody binding site)越接近的抗原决定基范围(determinant area)，则亲和力常数越高。由于这些交互作用系相对地弱，在抗原及其在抗体的补位(complimentary site)之间的配合，必须在够大的范围发生，以便可容纳所有可能存在的交互作用的总合效应(summation)。而该抗体必须具有合理的高结合常数，使半抗原结构可依附在标记酶，以便使在相对低数量的抗体可达成高抑工艺度。由于酶-半抗原共轭同构型抑制在抗-半抗原抗体存在时被认为是底物的空间排除，及/或在标记酶结构活性位附近构造上的改变，是被结合反应所透导出来的，该该特定的三度空间结构(three dimensional structure)及该抗体的尺寸大小将会影响在该抗体的过量中抑制的最大程度。因此，正如图3所示，该抗体稀释曲线的形状及陡度，在酶-半抗原共轭及抗-半抗原抗体之间，可提供一些有关亲和力常数的资料；当抑制率最大值存在额外的抗体时，则是依据每个抗体的大小及三度空间结构而定。就这一点而言，每个半抗原的不同结合结构系非常地重要，以便对每个抗体达到实质的结合新和力。
在抗体及G6PDH-2AII共轭之间的结合动力所作的研究是为了对于竞争的同构型结合检测进行最佳化其所需要的培育期。利用经最佳化选定的G6PDH-2AII共轭/抗体系统的三种不同组合于这些研究中，如图4中所示，对于每个系统可取得快速的结合动力。实际上，对于所有系统中的抑制率最大值，有超过75％可在2分钟的培育期内取得，而且仅需要30秒的培育期，就可对每个系统完成一抑制的比较性区(comparable extent)。在抗体及G6PDH-2AII之间的快速结合动力，比起异质性的EIAs(例如ELISAs)需求大量减少检测的时间。(参考文献Brun et al.，2004；Cho etal.，2003；Kim et al.，2002；Want et al.，2005)。在接下来的实验包含了剂量反应的研究，其利用10分钟的培育期，如上述实验证明(请参阅表3及图3)，当利用三个不同的抗体时，也能取得抑制率的最大差异值。
实施例4具有三种不同抗体的倍硫磷剂量反应曲线图。
(1)倍硫磷剂量反应曲线图(dose-response curves) 对于剂量反应曲线图，是以100μl倍硫磷不同浓度(0.01～100μg ml-1)的标准溶液加入至含有100μl抗体溶液(1/1250稀释)的检测试管中10分钟，该混合物再加以培育10分钟，当竞争结合反应作用之后，如上所述可测定该酶活性。在100μl的标准溶液加入检测混合物(assay mixture)中，标绘出抑制率相对于倍硫磷浓度的对数(logarithm)，可制作出剂量反应曲线图。
(2)结果 对于三个不同抗体[2A(Ab)、3A(Ab)、及4A(Ab)]的竞争剂量反应曲线图，可由标绘出抑制率相对于倍硫磷浓度而构成，请参阅图5。该G6PDH-2AII共轭物的活性可恢复到与倍硫磷浓度成正比的量，在所检测的抗体中，对于执行所提出的竞争性同构型EIA，2A(Ab)显示出最佳的抗体特征，虽然其剂量反应曲线图以稍微偏右的方向移动，一般而言，要达到最大抑制率值降到50％，所需的倍硫磷浓度(ED50)是与该所提供抗体对于倍硫磷的相对亲和力(affinity)有关(参考文献Kim et al.，1990)。该ED50的值，是从图5中的数据计算出来，对于2A(Ab)、3A(Ab)、及4A(Ab)分别是0.809、1.042、及1.194μgml-1。如上所述，2A(Ab)抗体对于经标记的半抗原(例如G6PDH-半抗原)可识别的选择性比起在溶液中的自由抗半原高。此可能会导致在竞争型检测(例如ELISAs)中较低的剂量反应敏感度，由于在经标记半抗原相对于抗体以及倍硫磷相对于抗体之间不相等的竞争性(unequal competition)。前面曾经提到，在EMIT型检测法中(同构型竞争型检测法homogeneous competitive type assay)，该酶-半抗原共轭物最重要的特征之一是以抗-半抗原抗体的催化活性的重大抑制，当然，该ED50的值是利用同构型竞争型检测方法而取得，特别是取决于其最大抑制率。也就是说，在具有相类似的动力范围的剂量反应曲线图之中，较高的最大抑制率是有利于达到较低的ED50值。而针对这点，以考虑高抑制率值，对于G6PDH-2AII/2A(Ab)这组而言，比起其它任何的一组呈现更高的剂量反应敏感度。有别于异质性竞争酶免疫原(heterogeneouscompetitive enzyme immunoassays)，在酶标记半抗原及相对于抗-(BSA-半抗原)抗体之倍硫磷之间，不相等的竞争力可能会不利于在新提出的EMIT检测法中最得较低的ED50值，也就是说，本发明发现，理论上的模仿的假设，在异质性竞争型检测法中，剂量反应的敏感度较低，因为不相等的竞争性，然而，对于EMIT型检测法而言，却不一定能适用。因为新提出的EMIT方法是首次发展运用在倍硫磷分析的方法，因此，对于倍硫磷而言，无法将此方法的敏感性与其它的EMIT方法进行比较。此新提出的EMIT方法，与用碳水化合物量(carbohydrate amount)的测定法，具有相近似的敏感度(参考文献Kim et al.，1990及1992)。
该残留活性率及抑制率值可再生达±1.4％(标准误差为n＝3)。所提出同构型竞争的酶免疫原的再生性，与之前所发现的同构型EMIT法涉及自然结合蛋白质可相比拟的(参考文献Kim et al.，1990、1992、及1995)。
经由上述实施例的详细说明，本发明是有关于一种检测倍硫磷含量的方法，其是以快速及方便的方法测出倍硫磷的含量。
附参考文献
1.Abuknesha，R.A.and Luk，C.(2005a)Paraquatenzyme-immunoassays in biological samplesassessment of the effects ofhapten-protein bridge structures on assay sensitivity.Analyst 130，956-963.
2.Abuknesha，R.A.and Luk，C.(2005b)Enzyme immunoassays for theanalysis of streptomycin in milk，serum and waterdevelopment andassessment of a polyclonal antiserum and assay procedures using novelstreptomycin derivatives.Analyst 130，964-970.
3.Adler，M.，Wacker，R.，Booltink，E.，Manz，B.，and Niemeyer，C.M.(2005)Detection of femtogram amounts of biogenic amines usingself-assembled DNA-protein nanostructures.Nat.Methods 2，147-149.
4.Andreotti，P.E.，Ludwig，G.V.，Peruski，A.H.，Tuite，J.J.，Morse，S.S.，and Peruski，L.F.Jr.(2003)Immunoassay of infectious agents.Biotechniques35，850-859.
5.AOAC International.(1995)Official Methods of Analysis，18th ed.Association of Official Analytical Chemists，Arlington，VA，Section 970.52.
6.Bachas，L.G.and Meyerhoff，M.E.(1986)Theoretical models forpredicting the effect of bridging group recognition and conjugate substitutionon hapten enzyme immunoassay dose-response curves.Anal.Biochem.156，223-238.
7.Biagini，R.E.，Smith，J.P.，Sammons，D.L.，MacKenzie，B.A.，Striley，C.A.，Robertson，S.K.，and Shawder，J.E.(2004)Development of a sensitivityenhanced multiplexed fluorescence covalent microbead immunosorbent assay(FCMIA)for the measurement of glyphosate，atrazine and metolachlormercapturate in water and urine.Anal.Bioanal.Chem.379，368-374.
8.Brun，E.M.，Garces-Garcia，M.，Puchades，R.，and Maquieira，A.(2004)Enzyme-linked immunosorbent assay for the organophosphorusinsecticide fenthion.Influence of hapten structure.J.Immunol.Methods.295，21-35.
9.Cho，Y.A.，Kim，Y.J.，Hammock，B.D.，Lee，Y.T.，and Lee，H.S.(2003)Development of a microtiter plate ELISA and a dipstick ELISA for thedetermination of the organophosphorus insecticide fenthion.J.Agric.Food.Chem.51，7854-7860.
10.Chouhan，R.S.，Vivek Babu，K.，Kumar，M.A.，Neeta，N.S.，Thakur，M.S.，Amitha Rani，B.E.，Pasha，A.，Karanth，N.G.，and Karanth，N.G.(2006)Detection of methyl parathion using immuno-chemiluminescence based imageanalysis using charge coupled device.Biosens.Bioelectron.2006 21，1264-1271.
11.Eddleston，M.，Eyer，P.，Worek，F.，Mohamed，F.，Senarathna，L.，vonMeyer，L.，Juszczak，E.，Hittarage，A.，Azhar，S.，Dissanayake，W.，Sheriff，M.H.，Szinicz，L.，Dawson，A.H.，and Buckley，N.A.(2005)Differencesbetween organophosphorus insecticides in human self-poisoninga prospectivecohort study.Lancet 366，1452-1459.
12.Farr，C.D.；Tabet，M.R.；Ball，W.J.，Jr.，Fishwild，D.M.；Wang，X.，Nair，A.C.，and Welsh，W.J.(2002)Three-dimensional quantitativestructure-activity relationship analysis of ligand binding to human sequenceantidigoxin monoclonal antibodies using comparative molecular field analysis.J.Med.Chem.45，3257-3270.
13.Hennion，M.-C.and Barcelo，D.(1998)Strengths and limitations ofimmunoassay for effective and efficient use for pesticide analysis in watersamples.Anal.Chim.Acta 362，3-34.
14.Killard，A.J.，Smyth，M.R.，Grennan，K.，Micheli，L.，and Palleschi，G.(2000)Rapid antibody biosensor assays for environmental analysis.Biochem.Soc.Trans.28，81-84.
15.Kim，B.，Behbahani，I.，and Meyerhoff，M.E.(1992)Lectin-basedhomogeneous enzyme-linked binding assay for estimating the type and relativeamount of carbohydrate within intact glycoproteins.Anal.Biochem.202，166-171.
16.Kim，B.，Buckwalter，J.M.，Meyerhoff，M.E.(1994)Adaptinghomogeneous enzyme-linked competitive binding assays to microtiter plates.Anal.Biochem.218，14-19.
17.Kim，B.，Cha，G.S.，and Meyerhoff，M.E.(1990)Homogeneousenzyme-linked binding assay for studying the interaction of lectins withcarbohydrates and glycoproteins.Anal.Chem.62，2663-2668.
18.Kim，K.-O.，Kim，Y.J.，Lee，Y.T.，Hammock，B.D.，and Lee，H.S.(2002)Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for theorganophosphorus insecticide bromophos-ethyl.J.Agric.Food Chem.50，6675-6682.
19.Kim，M.J.，Kim H.J.，Kim，J.M.，Kim，B.，Han，S.H.，and Cha，G.S.(1995)Homogeneous assays for riboflavin mediated by the interactionbetween enzyme-biotin and avidin-riboflavin conjugates.Anal.Biochem.231，400-406.
20.Kim，Y.J.，Cho，Y.A.，Lee，H.-S.，Lee，Y.T.，Gee，S.J.，and Hammock，B.D.(2003)Synthesis of haptens for immunoassay of organophosphoruspesticides and effect of heterology in hapten spacer arm length onimmunoassay sensitivity.Anal.Chim.Acta 475，85-96.
21.Morozova，V.S.，Levashova，A.I.，and Eremin S.A.(2005)Determination of pesticides by enzyme immunoassay.J.Anal.Chem.60，202-217.
22.Paula，S.，Tabet，M.R.，Farr，C.D.，Norman，A.B.，and Ball，W.J.Jr.(2004)Three-dimensional quantitative strueture-activity relationship modelingof cocaine binding by a novel human monoclonal antibody.J.Med.Chem.47，133-142.
23.Peruski，A.H.and Peruski，L.F.Jr.(2003)Immunological methodsfor detection and identification of infectious disease and biological warfareagents.Clin.Diagn.Lab.Immunol.10，506-513.
24.Petkam，R.，Renaud，R.，Lin，L.，Boermans，H.，and Leatherland，J.(2005)Effects of sub-lethal levels of dichlorodiphenyltrichloroethane anddichlorodiphenyldichloroethylene on in vitro steroid biosynthesis by ovarianfollicles or steroid metabolism by embryos of rainbow trout(Oncorhynchusmykiss).Aquat.Toxicol.73，288-298.
25.Revoltella，R.P.，Laricchia Robbio，L.，and Liedberg，B.(1998)Comparison of conventional immunoassays(RIA，ELISA)with surfaceplasmon resonance for pesticide detection and monitoring.Biotherapy 11，135-145.
26.Rubenstein，K.E.，Schneider，R.S.，and Ullman，E.F.(1972)″Homogeneous″enzyme immunoassay.A new immunochemical technique.Biochem.Biophys.Res.Commun.47，846-851.
27.Tetin，S.Y.and Stroupe，S.D.(2004)Antibodies in diagnosticapplications.Curr.Pharm.Biotechnol.5，9-16.
28.Tomlin，C.D.S.(1997)The pesticide manuala world compendium.The British Crop Protection Council，Surrey，UK，pp.531-532.
29.Tout，N.L.，Yau，K.Y.，Trevors，J.T.，Lee，H.，and Hall，J.C.(2001)Synthesis of ligand-specific phage-display ScFv against the herbicide picloramby direct cloning from hyperimmunized mouse.J.Agric.Food Chem.49，3628-3637.
30.Wang，S.，Yu，C.，and Wang，J.(2005)Enzyme immunoassay for thedetermination of carbaryl residues in agricultural products.Food Addit.Contam.22，735-742.
31.Yalow，R.S.and Berson，S.A.(1960)Immunoassay of endogenousplasma insulin in man.J.Clin.Invest.39，1157-1175.
权利要求
1.一种检测倍硫磷含量的方法，其步骤包含
(A)在一反应溶液，混入一种抗倍硫磷(fenthion)的抗体，以及葡萄糖六磷酸去氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)倍硫磷共轭(fenthion conjugate)，如下列化学式
(B)进行测试采样；
(C)将NAD+及葡萄糖六磷酸去氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase，G6PDH)至混合溶液中；及
(D)利用一光谱仪来检测在340nm的NADH的成长速率。
全文摘要
本发明是有关于一种检测倍硫磷(fenthion)含量的方法，特别是有关于一种由酶免疫分析法来检测倍硫磷含量的方法，其步骤包含(A)在一反应溶液中，混入一种抗倍硫磷(fenthion)的抗体，以及葡萄糖六磷酸去氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase，G6PDH)倍硫磷共轭(fenthionconjugate)；(B)进行测试采样；(C)将NAD+及葡萄糖六磷酸(glucose-6-phosphate)至混合溶液中；及(D)利用一光谱仪来检测在340nm的NADH的成长速率。本发明以快速及方便的方法测出其倍硫磷的含量。
文档编号G01N21/25GK101153841SQ20071015438
公开日2008年4月2日 申请日期2007年9月26日 优先权日2006年9月26日
发明者李相喜 申请人:明知大学产学协力团