专利名称：过敏原特异性抗体IgE ELISA检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及了一种定性和定量检测人血清中过敏原特异性抗体IgE的酶联 免疫吸附分析(ELISA)检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
过敏性疾病是现代社会中最常见的一种疾病，它是由广泛存在的过敏原引 发的，我国大约5-10%、美国和欧洲约有5-25%的人受过敏性疾病侵扰，其中幼 儿和青少年的病症尤为明显，威胁较严重。过敏反应(allergic reaction)又称变 态反应；过敏原(allergen)又称变应原。根据欧洲过敏和临床免疫学学会
(European Academy of Allergy and Clinical Immunology, EAACI)发表的观点， 免疫介导的过敏反应有两种类型IgE介导的过敏反应和非IgE介导的过敏反应
(Johansson SGO.etal， 2001， Allergy, 56: 813-824)。 IgE介导的过敏反应是 过敏原刺激抗体的淋巴结、肝、脾等器官的单核吞噬系统，触发浆细胞反应产 生特异性IgE (slgE)抗体。IgE分子的Fc端附着在肥大细胞或嗜碱性粒细胞的 IgE受体上，使机体处于致敏状态。当机体再受同类型过敏原刺激时，过敏原使 IgE分子交联，引起肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒化，释放出组胺、白三烯及 细胞因子等化学物质产生过敏反应、导致机体的毛细血管扩张、水肿、平滑肌 痉挛、内分泌活动亢进，引发过敏性疾病的临床症状，如花粉症、过敏性鼻 炎、过敏性哮喘、过敏性休克、荨麻疹、湿疹、血管性水肿、关节炎、头痛、 肠胃功能失调及其它慢性症状(周光炎等译，2002，免疫学，PP323-369，人民 卫生出版社；Sampson HA， 1999， Food allergy, parti ， J Allergy Clin Immunol, 103: 717-728)。
过敏原致敏传递方式分三类食物型，通过口腔摄入食物过敏原致敏；吸 入型，通过鼻腔等吸入花粉、粉尘等环境过敏原致敏；接触型，通过接触皮肤， 经毛孔传递引发过敏，如镍、铬制品，橡胶制品等。本试剂盒涉及的过敏原为 食物型和吸入型的大分子过敏原蛋白或多肽。
食物过敏原分两大类植物蛋白和动物蛋白， 一般为分子量10kD — 70kD 的糖蛋白。由它们的结构和功能特性分成为含过敏原的植物蛋白的是豆科植物、 树坚果、谷物、水果、蔬菜等中的醇溶蛋白的超家族，花生、树坚果、大豆等 的种子贮藏蛋白的杯状蛋白超家族和谷物的a-淀粉酶、蛋白酶抑制剂等植物防 卫系统的蛋白家族(AalberseRC， 2000， Structural biology of allergens, J AllergyClin Immunol, 106: 228-238; Breiteneder H er al， 2004， A classification of plant food allergens, J Allergy Clin Immunol, 113: 821-830);含过敏原的动物蛋白的 来源为以牛IgE白蛋白为代表的哺乳动物及鸟类的肉、乳蛋白，以小清白蛋白 为代表的鱼类肉蛋白，以原肌蛋白为代表的甲壳动物、软体动物、两栖动物和 爬行动物等的肉蛋白(Chapman JA et al， 2006， Food allergy: a practice parameter, Ann Allergy Asthma Immunol, 96: Sl-S68);以它们为原料还产生了数不清的"营 养健康食品"(WalJM， 1999， Nahrung， 43: sl68-174)。
吸入型物质的过敏原是以Bet vl为代表的树花粉蛋白，以Phi p2为代表的 草花粉蛋白，以Feldl为代表的动物皮屑蛋白，以Penc3为代表的霉菌类蛋白， 以Der pi为代表的螨虫蛋白和以Bla gl为代表的蟑螂蛋白等(Hiller R et al， 2002， FASEBJ， 16: 414-418)。
IgE介导的过敏反应的致敏过敏原检测在临床上可以通过皮肤试验及各种 体外检测方法，如放射性过敏原吸附检测(RAST)、免疫印迹(IS)及酶免疫 分析(EIA)等，结合病史、病症的问诊来确定致敏的过敏原。体外检测是测定 血液样本中的IgE，特别是过敏原特异性IgE (slgE)抗体浓度。酶免疫分析中 有多种检测结合酶的方法，即荧光法，化学发光法和TMB比色法等，且均有产 品被美国FDA批准(Chapman JA et al, 2006， Food allergy: a practice parameter, Ann Allergy Asthma Immunol, 96: S1-S68),美国临床实验室标准化委员会(CLSI) 专门制定了人IgE抗体免疫分析方法评价的纲要(1/LA20—A， NCCLS， 1997， 17 (20))，其中TMB比色法的酶联免疫分析(ELISA)方法以其只需使用普通 普及型的酶标仪，经济快捷、简单、安全，尤其适合我国当前的国情。
ELISA方法检测血液样本中过敏原特异性IgE抗体(slgE)是利用固相载体 固定的过敏原蛋白识别样品液中的sIgE并与sIgE结合，洗去未结合的其他蛋白， 再加入酶标记的抗人IgE抗体与已经结合在固定抗原上的slgE抗体结合，形成 过敏原一sIgE—抗体一酶的复合物，通过与酶底物显色液反应，检测结合的酶量， 间接地测定出样品液中的sIgE浓度及特定的过敏原。ELISA方法应用的多种技 术，如过敏原蛋白的提取纯化方法，人IgE抗体和抗人IgE抗体的制备、纯化， 酶标记抗体的制取纯化等均已成熟(T， kiessigST， 1992， Enzyme immunoassay techniques, An overview, J Immunol Methods, 150: 5-21)，且可按美国临床实 验室标准化委员会的文件(I/LA20-A)评价质量，为过敏原特异性抗体IgE ELISA 检测试剂盒的商品化生产奠定了技术基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、使用方便、快速地定量
检测人血清中的过敏原特异性抗体IgE ELISA检测试剂盒及其制备方法,用以筛
査患者致敏的过敏原并确定患者致敏反应的程度。
本发明的过敏原特异性抗体IgE ELISA检测试剂盒，其组成包括己包被的 奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过 敏原蛋白以及吸入型的螨虫类、动物皮屑类、鸟羽绒类、花粉类、蟑螂类、霉 菌类环境过敏原蛋白的酶标板、人IgE标准液、酶标记抗体、TMB底物显色液、 样品稀释液、浓縮洗涤液和终止反应液；
其中
己包被的奶类食物过敏原蛋白的酶标板包括牛奶、羊奶； 已包被的蛋类食物过敏原蛋白的酶标板包括家禽蛋白、家禽蛋黄； 已包被的肉类食物过敏原蛋白的酶标板包括猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉、
鸡肉、鹅肉、火鸡肉、驴肉；
己包被的谷物类食物过敏原蛋白的酶标板包括玉米、小麦、燕麦、大麦、
荞麦、大米、小米；
已包被的坚果类食物过敏原蛋白的酶标板包括杏仁、花生、榛子、腰果、
核桃、开心果、巴西坚果、芝麻；
已包被的水果类食物过敏原蛋白的酶标板包括西瓜、菠萝、橙子、芒果、
香蕉、柑桔、胡柚、柠檬、苹果、葡萄、梨、草莓、杉^
已包被的蔬菜类食物过敏原蛋白的酶标板包括芹菜、菠菜、洋葱、茄子、
大蒜、辣椒、土豆、西红柿；
已包被的水产类食物过敏原蛋白的酶标板包括带鱼、黄鱼、比目鱼、三
文鱼；鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鲢鱼、4下、蟹、蚌、贻贝、牡蛎、黄鳝、鳗鱼； 已包被的豆类食物过敏原蛋白的酶标板包括扁豆、蚕豆、黄豆、豌豆； 己包被的吸入型螨虫类过敏原蛋白的酶标板包括尘螨、粉螨、屋尘； 已包被的吸入型动物皮屑类过敏原蛋白的酶标板包括猫、狗、马、牛、
羊；
已包被的吸入型鸟羽绒类过敏原蛋白的酶标板包括鸡、鸭、鹅、鸽； 已包被的吸入型花粉类过敏原蛋白的酶标板包括桦树、枫树、桤树、构 树、棕榈、葵树、榛树、柏树、松树、杉木、栗树、栎树、梧桐、杨树、賴卩树、 桑树、榆树、艾蒿、豚草、藜草、车前草、白茅草、牛毛草、狗牙草、梯牧草、
芦苇、萚草、苍耳、香蒲、莎车、芨芨草、向日葵；
已包被的吸入型蟑螂类过敏原蛋白的酶标板包括德国小蠊、美洲大蠊； 已包被的吸入型霉菌类过敏原蛋白的酶标板包括点青霉菌、多主枝孢霉
菌、烟曲霉菌、交链孢霉菌、黑根霉菌、酿酒酵母菌、小麦黑粉菌、毛霉菌、
黑孢霉菌；
酶标记抗体辣根过氧化物酶标记的抗人IgE单克隆抗体；
TMB底物显色液2.08mmol/L3， 3，， 5， 5，一四甲基联苯胺，12mmol/L过 氧化氢，10mmol/L(3—环糊精，O.lmol/L pH5.0的醋酸缓冲液。
样品稀释液1Ommol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1% BSA， 0.05% Tween-20和lmg/L庆大霉素；
浓縮洗涤液O.lmol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1%胎牛血清，0.5% Tween-20和20mg/L庆大霉素；
终止反应液1 .Omol/L H2S04 。
本发明的过敏原特异性抗体IgE ELISA检测试剂盒的制备方法，包括如下 步骤
(1) 过敏原蛋白的制备将含过敏原蛋白的材料经粉碎、脱脂、提取、 SDS-PAGE电泳确证、洗脱、干燥；
(2) 酶标记抗体的制备用辣根过氧化物酶(Horseradishperaxidase,HRP) 标记纯化的抗人IgE抗体；
(3) 配制人IgE标准液、TMB底物显色液、浓縮洗涤液和终止反应液；
(4) 酶标板包被用抗人IgE抗体和过敏原蛋白包被酶标板，并封闭。
本发明的试剂盒的使用方法，包括如下操作步骤
(1) 加入样品液和标准液到相应的酶标板微孔中，使样品液中的过敏原特
异性IgE抗体各自与相应的固相过敏原蛋白结合或标准液中的人IgE与固相载体
上的抗人IgE抗体结合，洗去未结合的杂蛋白和其他物质；
(2) 使已结合的人IgE抗体与HRP-抗人IgE抗体相结合，洗去多余的酶标 记抗体；
(3) 加入TMB底物显色液，室温孵育反应，终止酶反应后检测显色反应
的强度。
本发明的有益效果在于
本发明建立了夹心式ELISA方法间接测定样品液中的过敏原特异性IgE抗 体含量和定性筛查致敏食物和环境过敏原，检测灵敏度小于0.3IU/ml，剂量一反 应曲线的线性相关系数^0.99，具有简便、快速、灵敏、稳定的优点，为体外辅
助诊断确定使患者致敏的过敏原及过敏反应程度提供了有效的手段。
图1是大麦等谷物的贮藏蛋白的抗原决定簇区域的氨基酸序列(具有相同
氨基酸残基的底色为灰色)；
图2是苹果等水果的脂转移蛋白的抗原决定簇区域的氨基酸序列(具有相 同氨基酸残基的底色为灰色)。 具体实施方法
以下结合实施例进一步说明本发明。
实施例1
本发明的过敏原特异性抗体IgE ELISA检测试剂盒，其组成包括已包被的 奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过 敏原蛋白以及吸入型的螨虫类、动物皮屑类、鸟羽绒类、花粉类、蟑螂类、霉 菌类环境过敏原蛋白的酶标板、人IgE标准液、酶标记抗体、TMB底物显色液、 样品稀释液、浓缩洗涤液和终止反应液。
上述的酶标板为96孔(12条8孔或8条12孔)。
本发明的过敏原特异性抗体IgE ELISA检测试剂盒的制备方法
l.过敏原蛋白的制备
1.1过敏原蛋白的粗浸提液
l丄l奶类提取液
奶类浸液的制作有两种方法
(1) 先用离心法(2400转/分钟)离心15分钟，用小匙除去上层脂肪，取 400ml脱脂乳，加入5mlin/。凝乳酶或乳冻片，不搅拌，放入37'C恒温水浴或孵 箱内30分钟，如乳清蛋白与酪蛋白(casein)分离，用干净纱布过滤，再用普 通滤纸过滤。按1: 2 (W/V)的比例，用缓冲盐水提取液稀释乳清蛋白即为乳
清蛋白提取液。
(2) 将含有乳清的滤液加3倍丙酮，放入冰箱24h，使乳清沉淀；用离心 法除去上清液，再用丙酮浸洗几次，干燥后研细成粉未贮存。提取时按1: 50
(W/V)用缓冲盐水提取液在冰箱内提取48小时，每日搅拌或振荡2小时。 酪蛋白用丙酮和乙醚反复脱脂、最后研磨，用3号或4号筛筛出，按1: 50(W/V) 比例提取。
l丄2蛋类提取液
蛋白和蛋黄均按l: 20 (W/V)的比例用缓冲盐水提取液稀释，充分混匀后 直接过滤和除菌，不需提取，亦无需作毒性试验。
蛋黄也可制成干粉，方法是加入丙酮脱脂2-3小时，倾去丙酮层，待挥发干
燥后，用打碎机打碎，再用乙醚脱脂4小时备用。蛋黄干粉按l : 5 0比例(W / V)用缓冲盐水提取液提取。 l丄3肉类提取液
取新鲜瘦肉，去掉脂肪和结缔组织，剁成碎末，或用绞肉机绞碎。交替用 甲苯、二甲苯、丙酮及乙醚等不同溶剂反复脱脂，室温下干燥，过筛，贮存于 密闭玻璃瓶中备用。
按l: 25 (W/V)的比例用缓冲盐水提取液提取48小时，提取过程中每日 搅拌或振荡2小时。
粗滤后如液体混浊，可用分液漏斗加乙醚再脱脂。
l丄4谷物、坚果、豆类蛋白提取液
(1) 干燥、去壳、脱皮、磨粉贮存；在索氏提取器中按粉正己垸=1: 10 (W/V)的比例脱脂6小时，干燥脱脂粉再磨细贮于-2(TC下的密封容器中备用。
(2) 脱脂粉用提取缓冲液(含20mmolNaH2PO4，lmol/LNaCl，pH7.0)提取 蛋白；脱脂粉提取缓冲液的比例为lg:10ml(W/V)，室温提取1.5小时，然后4 。C下20000g离心30分钟，保存上清液。
l丄5水果、蔬菜类蛋白提取液
将100g水果(包括果皮、去核)、蔬菜洗净、凉千、切碎后加入150ml20mmo1/1 PBS (pH7.4)溶液，其中含2%的聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)悬浮颗粒，2mmo1/1 的EDTA， 10mmo1/1的二乙二硫基氨基甲酸酯(D正CA)钠和3mmo1/1的NaN3， 匀桨4。C提取4小时后，12000g4。C下离心30分钟，上清液-2(TC下保存。
1.1.6水产类蛋白提取液
取新鲜水产肉，去脂肪，粉碎。用丙酮或乙醚反复脱脂、室温下干燥，过 筛，贮存于密闭玻璃瓶中备用。
按l: 25 (W/V)的比例用缓冲盐水提取液提取48小时，提取过程中每日 搅拌或振荡2小时。
粗滤后如液体混浊，可用分液漏斗加乙醚再脱脂。
l丄7吸入型螨虫类蛋白提取液
取50g饲养的螨虫，加入80ml丙酮或无水乙醇清洗灭活后用多层纱布过滤 除去溶剂，风干、研细，再加入100ml乙醚，反复振摇1小时脱脂；挥净乙醚 的脱脂粉以l: 100 (w/v)的量加入0.125mol/lNH4HCO3缓冲液(pH8.3),内
含0.1%NaN3溶液室温提取3小时，期间经常搅拌；lOOOOg离心20分钟，上清 液-2(TC下贮存。
1.1.8吸入型动物皮屑和鸟羽绒类蛋白提取液
采集的皮屑和剪碎的羽绒用2倍以上苯、丙酮等溶剂浸泡1.5小时，不断振 摇脱脂，倒掉溶剂、挥净残余溶剂后用5% (W/V)的0.125mo1/1 NH4HC03缓 冲液(pH8.3) 4。C下提取20小时，不断振摇，然后13000g4'C离心15分钟，上 清液过三层纱布过滤，滤液-2(TC下贮存。
l丄9吸入型花粉类蛋白提取液
采集的花粉过筛去除杂质，加入3倍乙醚浸泡振摇脱脂2小时，弃去溶剂， 挥净残余乙醚。取脱脂后的花粉lg在40ml 0.125mol/lNH4HCO3缓冲液(pH8.3) 4'C下搅拌过夜(20小时以上)，然后15000g离心15分钟除去不溶物。该提取 上清液每50jal加入400^1冷甲醇，4。C静置过夜沉淀蛋白，离心，N2气下干燥 后的沉淀溶于含SDS的缓冲盐溶液(pH7.0)中，待用。
1丄10吸入型蟑螂类蛋白提取液
蟑螂放冰箱冷冻灭活，加入无水乙醇浸泡半小时、洗去虫体表面微生物后 风干，在粉碎机中以2400rpm打成粉末；加入3倍体积的乙醚+乙酸乙酯(1+1 ， V/V)浸泡振摇脱脂2小时，弃去带脂溶剂，残余乙醚挥干后，30g粉末加入200ml 含6mmo1/1 p-巯基乙醇和1/1000体积的蛋白酶抑制剂的PBS (pH7.4)溶液， 缓缓搅拌4"C下过夜，且每毫升加入lmg的1-苯基-3- (2-硫腙基)-2-硫脲防止 溶液黑褐化；然后将提取液在4t:下以10000g离心30分钟，上清液过0.45|am 滤膜后-2(TC下ie存。
l丄ll吸入型霉菌类蛋白提取液
干燥的霉菌块状固体，用高速种籽粉碎机打成粉末，过4号筛；取适量粉 末加入3倍体积的乙醚浸泡振摇2小时，弃去乙醚并将样品中残余乙醚挥尽， 再加入2倍体积的甲醇浸泡振摇1小时，离心除去甲醇，N2气下干燥；5g菌粉 中加入100ml含2mmo1/1 EDTA和8 mmo1/1的P-巯基乙醇的PBS溶液4。C下搅 拌提取过夜，然后15000g4。C离心30分钟，上清液-20。C下贮存。
1.2过敏原蛋白的提取
过敏原蛋白的粗提取液需经透析、SDS-PAGE电泳免疫印迹确认、割胶、 离心提取的较纯的过敏原蛋白组分。
(1)将浸提液在透析袋(MWCO 10000)中对10mmol/L PBS(pH7.2)透析 48小时，期间缓缓搅动PBS溶液，并更换PBS液4次；(2) 透析后的过敏原蛋白溶液过0.45pm滤膜，并稀释成4mg/ml的蛋白溶
液；
(3) 过敏原蛋白溶液灌入SDS-PAGE的胶柱，电泳分离；在分子量10-100kD 的区域用病人阳性血清在一个电泳胶柱进行免疫印迹，显色；
(4) 切割下其余胶柱过敏原蛋白定位的相应条带，加入适量PBS溶液后， 室温2000g离心IO分钟；
(5) 测出过敏原蛋白溶液的浓度，加入适量防腐剂，-2(TC下冷冻贮存。
2. 人IgE标准液的制备 2.1材料
人IgE抗体来源于人血浆中经亲和色谱纯化，纯度〉95y。的人IgE抗体(购 自美国Biodesign公司)。 2.2步骤
用样品稀释液将人IgE抗体配制成浓度为100、50、17.5、3.5、0.70、0.35IU/ml
人IgE标准液。
3. 包被酶标板 3.1材料
(1) 活化处理过的酶标板(Nunc， Nunc-Immuno platesTM, USA或Greiner, Greiner labortechnik,Germany);
(2) 过敏原蛋白；
(3) O.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)或活化包被液；
(4) O.Olmol/LPBS溶液；
(5) 3。/。BSA封闭液；
(6) 金属箔袋及真空封口机等。 3.2步骤
(1) 用包被液(0.05mol/L碳酸缓冲液，pH9.6或根据过敏原蛋白的特性选 择的活化包被液)适当稀释过敏原蛋白溶液成0.05pg/ml-l(Hig/ml的包被浓度， 混匀，待包被的活化处理过的酶标板微孔内每孔加入lOO)ll;
(2) 酶标板封膜后4r下反应过夜；
(3) 倒掉包被的抗体和抗原溶液，洗板，每孔加入250iil3MBSA封闭液， 4'C下封闭过夜；
(4) 倒空封闭液，用洗涤液洗板4次，拍千；
(5) 将酶标板真空干燥后，密封入带干燥剂的金属箔袋内，在4'C下贮存。
4.酶标记抗体(辣根过氧化物酶(HRP)标记抗人IgE抗体)的制备 4.1材料
(1) 辣根过氧化物酶(HRP， RZ>3.2，活性》00U/ml;购自美国SIGMA 公司)；
(2) 0.1mol/LNal04溶液；
(3) 0.2mol/L碳酸缓冲液，pH9.5;
(4) 抗人IgE抗体(购自美国KPL公司)；
(5) 4.0mg/ml的NaBH4溶液；
(6) 0.15mol/L的PBS， pH7.4;
(7) Protein A-Sepharose 4 Fast Flow亲和色谱柱材料及色谱柱；
(8) 亲和色谱纯化用的柠檬酸、磷酸及Tris缓冲液；
(9) SephadexG25凝胶色谱柱；
(10) 分光光度计等。 4.2步骤
(1) 称取5mg HRP溶解于lml蒸馏水中，然后加入0.2ml新配的0.1mol/L Nal0 4溶液，室温下避光搅拌20分钟；
(2) 将上述溶液装入透析袋中，对lmol/L pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4
"C过夜；
(3) 加20pl0.2mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液，使以上已醛化的HRP溶液的 pH升高到9.0 9.5，然后立即加入10mg抗人IgE抗体在lml 0.01 mol/L碳酸 盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；
(4) 加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，4。C下再静置2小时；
(5) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15mol/LpH7.4PBS透析，4'C过夜。 少量沉淀应离心弃去；
(6) 色谱柱中装入2ml Protein A-Sepharose 4 Fast Flow;用5mlpH3.0柠檬 酸钠缓冲液清洗柱，接着用10mlpH8.0的磷酸缓冲液清洗；
(7) 用Tris调节上述制备的HRP标记的抗人IgE抗体溶液的pH值至8.0， 以约5ml/小时的速度将标记制备的HRP-抗人IgE抗体溶液上柱；
(8) 用pH8.0的磷酸缓冲液清洗色谱柱，清洗流出液含非免疫球蛋白等杂
蛋白；
(9) 用10ml O.lmol/L的柠檬酸钠缓冲液洗脱HRP-抗人IgE抗体。酶标记 抗体洗脱后柱用lOml磷酸缓冲液清洗；
(10) 在280nm处监控洗脱液的吸光度，收集大于基线的馏份。收集的馏 份迅速用2mol/LTris溶液中和；
(11) 收集的馏份过PDIO (SephadexG25)柱并用PBS交换洗脱馏份的介 质溶液；
(12) 灭菌后，加入载体蛋白冷冻干燥，收集的酶标记抗体，忙存在4"C以 下的暗处。
5.过敏原特异性IgE抗体ELISA检测试剂盒的使用方法
(1) 酶标板条安装
已包被的酶标板条平衡至室温后，开启包装袋，取出所需筛查过敏原蛋白 包被的酶标板条组合，牢固地安装在酶标板框架上。不需用的酶标板置于包装 袋中，驱气密封好，放在2-8'C下贮存。
(2) 样品孵育
取100jil人IgE标准液系列和稀释后的样品液加入到相应的包被酶标板孔 中；空白孔中只加入100iil样品稀释液；用膜封好酶标板孔，在37'C下孵育45分钟。
(3) 洗板
吸走或倒空孔中液体，洗板4次后拍干。
(4) 酶标记抗体孵育
用移液器每孔加入100^1酶标记抗体溶液；封好酶标板，在37"C下孵育反 应用45分钟；如步骤(3)洗板4次。
(5) 底物反应显色
每孔加入100plTMB底物显色液，轻轻晃摇30秒钟，室温静置反应15分钟。
(6) 终止反应检测
每孔加入lOO)il终止反应液，20分钟内在酶标仪的450nm波长下测出每孔 的吸光度值。
(7) 结果计算
计算重复孔的平均吸光度值；以标准溶液系列的平均吸光度值的对数值对 相应浓度的对数值进行线性回归，构建剂量一反应曲线；由样品重复孔的平均 吸光度值大于0.165的那个过敏原孔的吸光度值从剂量一反应曲线计算出患者 该过敏原的特异性IgE抗体含量，并按给定的分级将该过敏原致敏反应定级。
过敏原特异性IgE浓度的分级方法国际分级标准过敏程度分级
分级IgE浓度
o级<0.35IU/ml阴性
1级0.35 — 0.70IU/ml弱阳性
2级0.71—3.50IU/ml阳性
3级0.51 —17.5IU/ml较强阳性
4级17.51—50.0IU/ml强阳性
5级50.01—薩U/ml特强阳性
6级>100IU/ml超强阳性
实施例2筛查型过敏原检测试剂盒中共同包被过敏原蛋白的选择 在分子水平上通过细胞结合IgE反应性的蛋白质的IgE结合抗原决定簇的识 别来推测蛋白质的过敏反应性。美国过敏、哮喘和免疫学学会(the American Academy of Allergy, Asthma and Immunology (AAAAI))禾口美国过敏、哮喘禾口 免疫学学院(the American college of Allergy, Asthma and Immunology (ACAAI)) 联合接受的文件"食物过敏实用参数(Food allergy: a practice parameter)" 中认为，蛋白质促发过敏反应是因为蛋白质存在的功能氨基酸序列，包括线性 序列上或构象上能与B细胞上特定的受体蛋白结合的结构，即抗原决定簇。如 果两种蛋白质或多肽均含有的一个或几个主要过敏原蛋白的氨基酸序列的等同 性达70%或两个蛋白质或多肽共享8个或8个以上连续相同的氨基酸序列，就 可认为该两个蛋白质或多肽存在着相同过敏症状的抗原决定簇(Chapman JA et al， 2006， Food allergy: a practice parameter, Ann Allergy Asthma Immunol, 96: Sl-S68)。依据这一原则，从互联网上的大型数据库NCBI、 PubMed、 EBI或 文献中检索比对同类型致敏材料的主要过敏原蛋白的氨基酸序列，将符合该原 则的材料的过敏原蛋白等量混合，共同包被在酶标板的同一微孔表面。例如比 较图1中大麦等五种谷物的主要过敏原蛋白(种子贮藏蛋白)的抗原决定簇区 域的氨基酸序列的等同性约为40%，而玉米、大米、小米等三种谷物的等同性 约为70%，于是就将这三种谷物的过敏原蛋白包被入酶标板的同一微孔表面。 苹果等六种水果的主要过敏原蛋白(脂转移蛋白，LTP)的抗原决定簇区域的氨 基酸序列的等同性达72%，且存在两个8个连续相同氨基酸序列的区域(图2)， 也将它们的过敏原蛋白共同包被入酶标板的同一微孔表面。 实施例3用ELISA法筛查过敏原试验
对47例过敏患者(2—18岁的34人，18 — 56岁的13人)，抽取血液制备 血清定性筛査(牛奶；蛋白/蛋黄；淡水鱼；虾、蟹；海水鱼；蟑螂；螨虫；猫 狗皮屑；霉菌；花粉)过敏原。
按上述过敏原特异性抗体IgE ELISA检测试剂盒的使用方法测出患者血清 在不同过敏原包被孔的吸光度，其中吸光度值大于0.165的判断为阳性。检测结
果如下表:
海淡
蛋白虫下猫狗
过敏原牛奶水水蟑螂螨虫霉菌花粉
蛋黄蟹皮屑
鱼鱼
阳性检出人
数4235046148
阳性检出率
12.5710.815.6012.518.7412.525
(%)
检测结果表明，采用本发明的试剂盒能够简便、快速、准确地检测出致敏
过敏原，灵敏度达91.2%，特异性达86.5%。
权利要求
1、过敏原特异性抗体IgE ELISA检测试剂盒，其特征在于该试剂盒组成包括已包被的奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过敏原蛋白以及吸入型的螨虫类、动物皮屑类、鸟羽绒类、花粉类、蟑螂类、霉菌类环境过敏原蛋白的酶标板、人IgE标准液、酶标记抗体、TMB底物显色液、样品稀释液、浓缩洗涤液和终止反应液；其中已包被的奶类食物过敏原蛋白的酶标板包括牛奶、羊奶；已包被的蛋类食物过敏原蛋白的酶标板包括家禽蛋白、家禽蛋黄；已包被的肉类食物过敏原蛋白的酶标板包括猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉、鸡肉、鹅肉、火鸡肉、驴肉；已包被的谷物类食物过敏原蛋白的酶标板包括玉米、小麦、燕麦、大麦、荞麦、大米、小米；已包被的坚果类食物过敏原蛋白的酶标板包括杏仁、花生、榛子、腰果、核桃、开心果、巴西坚果、芝麻；已包被的水果类食物过敏原蛋白的酶标板包括西瓜、菠萝、橙子、芒果、香蕉、柑桔、胡柚、柠檬、苹果、葡萄、梨、草莓、桃；已包被的蔬菜类食物过敏原蛋白的酶标板包括芹菜、菠菜、洋葱、茄子、大蒜、辣椒、土豆、西红柿；已包被的水产类食物过敏原蛋白的酶标板包括带鱼、黄鱼、比目鱼、三文鱼；鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鲢鱼、虾、蟹、蚌、贻贝、牡蛎、黄鳝、鳗鱼；已包被的豆类食物过敏原蛋白的酶标板包括扁豆、蚕豆、黄豆、豌豆；已包被的吸入型螨虫类过敏原蛋白的酶标板包括尘螨、粉螨、屋尘；已包被的吸入型动物皮屑类过敏原蛋白的酶标板包括猫、狗、马、牛、羊；已包被的吸入型鸟羽绒类过敏原蛋白的酶标板包括鸡、鸭、鹅、鸽；已包被的吸入型花粉类过敏原蛋白的酶标板包括桦树、枫树、桤树、构树、棕榈、葵树、榛树、柏树、松树、杉木、栗树、栎树、梧桐、杨树、柳树、桑树、榆树、艾蒿、豚草、藜草、车前草、白茅草、牛毛草、狗牙草、梯牧草、芦苇、葎草、苍耳、香蒲、莎车、芨芨草、向日葵；已包被的吸入型蟑螂类过敏原蛋白的酶标板包括德国小蠊、美洲大蠊；已包被的吸入型霉菌类过敏原蛋白的酶标板包括点青霉菌、多主枝孢霉菌、烟曲霉菌、交链孢霉菌、黑根霉菌、酿酒酵母菌、小麦黑粉菌、毛霉菌、黑孢霉菌；酶标记抗体辣根过氧化物酶标记的抗人IgE单克隆抗体；TMB底物显色液2.08mmol/L 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，12mmol/L过氧化氢，10mmol/L β-环糊精，0.1mol/L pH5.0的醋酸缓冲液。样品稀释液10mmol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％BSA，0.05％Tween-20和1mg/L庆大霉素；浓缩洗涤液0.1mol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％胎牛血清，0.5％Tween-20和20mg/L庆大霉素；终止反应液1.0mol/L H2SO4。
2、 根据权利要求l所述的过敏原特异性抗体IgEELISA检测试剂盒，其特 征在于所说的酶标板为96孔。
3. 权利要求1所述的过敏原特异性抗体IgE ELISA检测试剂盒的制备方法， 其特征在于包括如下步骤(1) 过敏原蛋白的制备将含过敏原蛋白的材料经粉碎、脱脂、提取、SDS-PAGE电泳确证、洗脱、干燥；(2) 酶标记抗体的制备用辣根过氧化物酶标记纯化的抗人IgE抗体；(3) 配制人IgE标准液、TMB底物显色液、浓縮洗涤液和终止反应液；(4) 酶标板包被用抗人IgE抗体和过敏原蛋白包被酶标板，并封闭。
全文摘要
本发明公开了过敏原特异性抗体IgE ELISA检测试剂盒及其制备方法，应用纯化的过敏原蛋白包被酶标板。试剂盒组成包括已包被的过敏原蛋白的酶标板、人IgE标准液、酶标记抗体、TMB底物显色液、样品稀释液、浓缩洗涤液和终止反应液。固定在酶标板微孔表面上的抗原捕获样品血清中的特异性IgE抗体，酶标记抗体识别IgE并与之结合，形成抗原-IgE-抗体-酶的复合物，酶与底物反应显色后测出吸光度，由吸光度大于0.165的过敏原孔定性筛查致敏过敏原，而由标准曲线计算出样本血清中的特异性IgE抗体浓度，定量分级确定过敏反应程度，可应用于过敏性疾病的体外临床辅助诊断及科学研究。
文档编号G01N33/577GK101178406SQ20071015716
公开日2008年5月14日 申请日期2007年12月5日 优先权日2007年12月5日
发明者吴善东 申请人:杭州浙大生物基因工程有限公司