专利名称：利用荧光成像观测人工皮肤生长过程的方法
技术领域：
本发明涉及观测人工皮肤生长过程的方法，特别是涉及一种利用荧光成像观测人工皮肤 生长过程的方法。
背景技术：
近年来人们研究发现体外重建的人工皮肤可以替代动物或人体皮肤而进行相关的试验， 如Sanz Garcia S等人用人工皮肤研究生物制剂对表皮生长的作用(Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg， 2000; 34 (3) : 199-206); Hoffmann J 等人用人工皮肤检测和鉴别化学物 质对皮肤的腐蚀作用(Toxicol In Vitro， 2005; 19(7) :925-929); Amano S等人利用人工皮肤 模拟皮肤的光老化过程(Br J Dermatol, 2005， 153(2) :37-46); Hada N等人利用人工皮肤作 为四环素和氯霉素的经皮给药系统，显示抗生素处理过的人造皮肤，可预防皮肤的二次感染 ，人工皮肤可作为一种新的体外经皮给药系统模型(J Control
Release, 2005; 108 (2-3) :341-350)。由于人工皮肤提供了进行该方面研究和应用的良好替代 平台，因此具有较大的实际应用前景。
在医学临床中，患者皮肤损伤或烧伤后所进行的皮片移植有助于创面修复。这个修复过 程包括移植皮片边缘的角质形成细胞分裂增殖，向创面移行，最后覆盖创面，新生表皮完成 修复和重塑的过程。这一过程涉及到皮肤的再生和发育，对这一过程的了解可以帮助人们认 识与皮肤发育和修复相关的诸多问题，有助于了解各种理化因素对组织修复的影响，寻找伤 口愈合的新药。 一般新药研究比较复杂，研制过程须多个步骤，以往多采用动物或人进行药 物的筛选、毒理学实验、以及生理功能研究等，这时需要大量的动物和人体皮肤进行不同浓 度的重复试验。这样，往往会导致人或动物的损伤，甚至导致动物死亡。多年来人们期望在 体外建立一种人工皮肤损伤修复模型，以便用这个模型对影响皮肤生长的各种因素(如细胞 因子、激素、物理因素及各种药物等)进行量化评估。
但是，由于技术的限制，尚无理想的方法客观测量人工皮肤的生长。1986年Coulomb B 等人曾用染料染色人工培养的皮肤组织，观察皮肤的生长(Br J Dermatol 1986; 114(1) :91-101)。该方法的缺点是染料对细胞生长有影响，难以准确反映新生皮肤的 生长过程。另外他们选用混合胶原凝胶作真皮替代物，这种皮肤替代物也存在明显的不足即 胶原凝胶会严重收縮，导致表皮生长受影响。后来，申请人曾用二乙酸荧光素结合荧光显微
成像和图像分析技术，以人的去表皮真皮组织(HDED)作为真皮替代物初步建立了一种客观量 化重建皮肤生长的方法(陆洪光等，中华皮肤科杂志2005; 38 (12) :738-741)。 二乙酸荧光素 是一种细胞染色用荧光色素，为活细胞指示剂，广泛应用于动植物细胞活力的标记及检测 (Hassan M:Biotechnol Bioeng. 2002 ; 80 (6) :677-84)。但是在实际应用中发现经二乙酸荧 光素染色的人工皮肤荧光时间维持较短，时间长了以后荧光图像易出现模糊，不利于较长时 间对人工皮肤生长过程的观察。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种图像清晰、荧光持续时间更久的利用荧光成像 来观测人工皮肤生长过程的方法，该方法利于对人工皮肤的生长过程进行连续性观察并随时 同步摄像，从而记录、量化人工重建皮肤的生长速率。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下的方法利用荧光成像技术来观测人工皮肤的生 长过程
在人工皮肤的培养过程中，需要观测人工皮肤的生长情况时，吸去人工皮肤的培养液， 在人工皮肤表面滴加5 —氯甲基二乙酸荧光素，然后移至荧光显微镜下观察，新生人工皮肤 呈兰绿色荧光，以兰绿色荧光判断人工皮肤的生长情况，观测人工皮肤的生长情况后，吸去 5 —氯甲基二乙酸荧光素，加入培养基后继续培养。
其中，5 —氯甲基二乙酸荧光素是浓度为2. 4mM的5 —氯甲基二乙酸荧光素的二甲基亚砜 溶液。
为了能真实地反映皮肤的生长过程，所用到的人工皮肤最好采用如下的方法制备将皮 片的真皮面涂上混合组织胶并表皮部分向上、真皮部分向下地置于去表皮真皮组织上，所述 混合组织胶是用体积比为l: 1: l的胶原胶、氨甲环酸和凝血酶新鲜配制的。
发明人对5—氯甲基二乙酸荧光素的荧光成像的时效和其对人工皮肤生长过程的影响进 行了研究，具体如下
实验一、二乙酸荧光素和5 —氯甲基二乙酸荧光素荧光成像的比较
将二乙酸荧光素150y l滴加至人工皮肤表面，将同体积的浓度为2.4yM的5 —氯甲基二 乙酸荧光素滴加至另一人工皮肤表面，分别移到荧光显微镜下观察，记时观察人工皮肤的荧 光图像，15秒钟后分别经两种荧光素处理的人工皮肤均出现荧光图像，5分钟时最为清晰， 清晰图像保持15分钟，经二乙酸荧光素处理的荧光图像30分钟后出现模糊，而5-氯甲基二乙 酸荧光素处理的荧光图像在30分钟后依然清晰，轮廓清楚，图像于l小时后边缘才开始模糊 ，尽管荧光图像随时间的延长荧光强度逐渐减低，但是72小时后仍可见5-氯甲基二乙酸荧光
素处理的荧光图像。说明5 —氯甲基二乙酸荧光素的成像效果和持续时间均优于二乙酸荧光素。
实验二、 5 —氯甲基二乙酸荧光素对人工皮肤生长的影响
实验分5 —氯甲基二乙酸荧光素组和溶剂二甲基亚砜组每组12个人工皮肤标本进行器 官培养，连续培养10天。
5 —氯甲基二乙酸荧光素组在连续性培养的第3天，第5天，第7天及第10天加荧光素摄 取人工皮肤荧光图像并计算新生皮肤生长面积；二甲基亚砜组作为对照组，于培养的第3天 ，第5天，第7天加同剂量的二甲基亚砜并于第10天加二乙酸荧光素后摄像并计算新生皮肤生 长面积。统计学显示于培养的第10天，5-氯甲基二乙酸荧光素组新生皮肤生长面积为21.97 ±5. 03mm2 、 二甲基亚砜组为23. 37±2. 36mm2，两组比较无统计学差异(P>0. 05)。
结论5 —氯甲基二乙酸荧光素处理的人工皮肤荧光图像更加清晰，轮廓清楚，在人工 皮肤生长的连续性培养过程中，荧光图像维持时间较长，有利于人工皮肤生长情况的观察， 并且5—氯甲基二乙酸荧光素作为一种活细胞指示剂不会影响人工皮肤的生长。
与现有技术相比，本发明采用5 —氯甲基二乙酸荧光素作为荧光成像物质来观测人工皮 肤的生长过程，其成像更加清晰，轮廓清楚，并且荧光图像的维持时间更长，而且，5 —氯 甲基二乙酸荧光素作为活细胞指示剂不会影响人工皮肤的生长。此外，该方法还具有过程稳 定、易操作以及重复性强的特点，便于量化检测各种因素(尤其是药物)对皮肤生长的影响 和调控等。
具体实施例方式
实施例l:
表皮皮片的制备取整形外科切除的正常皮肤，置于超净工作台，自然平展标本，用
2mm活检器取样。然后将取下的皮片放于盛有PBS的平皿中，在解剖显微镜下用剪刀小心去除 皮下组织及深层真皮组织，保留浅层真皮组织，即得表皮皮片。
去表皮真皮组织的制备取整形外科切除的皮肤标本，常规消毒，在超净工作台中，在 解剖显微镜下修剪至2. 5mm厚，用10mm的活检器取材，将取下的标本浸于PBS中，然后置于56 。C的水浴箱中30min，取出后将表皮与真皮分离，将真皮部分置于平皿中室温下约lh将其凉 干，然后放置于聚乙烯塑料瓶中，加一滴DMS0，封闭瓶盖，迅速置入液氮(-12(TC -16CTC )中5 7min，取出后于室温放置30min，然后再置入液氮中。这样连续反复10个循环，得到 含有基底膜成分的三维基质材料，即人的去表皮真皮组织(HDED)。
人工皮肤的构建为使人工皮肤组织能够在空气一液面状态下培养，将70um目筛细胞
过滤器(cell strainer)修剪成培养支撑架，其方法是剪去过滤器周边的尼龙膜，将保 留的四只腿修成5mm高，然后放入6孔的培养皿孔中，这样，培养液能够通畅地穿过细胞过 滤器的孔筛，并保障皮肤组织在接触空气的液面生长。接种时，将表皮皮片的真皮面涂上混 合组织胶并表皮部分向上、真皮部分向下地置于去表皮真皮组织上，去表皮真皮组织放置在 支撑架上，所述混合组织胶是用体积比为l: 1: l的胶原胶、氨甲环酸和凝血酶新鲜配制的 。人工皮肤于37'C、 5 7。C02环境中进行空气一液面培养，连续培养10天左右，可以观察到新 生表皮细胞分裂、增殖、在HDED上移行生长，直至新生表皮覆盖整个HDED，在体外完成重建 皮肤修复和整塑过程，在整个连续性培养过程中，人工皮肤24 48小时需换培养液一次。这 里所用到的培养液是以DMEM: F12的体积比为3: l的比例配制的，其中，胰岛素的含量为5y g/ml，腺嘌磷的含量为O. 18mM，氢化考的松的含量为O. 5 y g/ml，霍乱弧菌毒素的含量为 10—1QM，链霉素的含量为IOO yg/ml，青霉素的含量为100U/ml，非必需氨基酸的含量为1% ，胎牛血清的含量为10%。由于内含较高营养和诱导皮肤角质形成细胞的生长成分，该培养 基利于皮肤表皮组织的培养。根据实验目的，可在基础培养基中加入其它成分。
人工皮肤生长过程的观测在人工皮肤的培养过程中，需要观测人工皮肤的生长情况时 ，吸去人工皮肤的培养液，在人工皮肤表面滴加浓度为2.4uM的5 —氯甲基二乙酸荧光素的 二甲基亚砜溶液，然后移至荧光显微镜下观察，新生人工皮肤呈兰绿色荧光，以兰绿色荧光 判断人工皮肤的生长情况，并用数码相机摄像。摄像后用吸管吸去5 —氯甲基二乙酸荧光素 溶液，加入培养基继续培养。
对人工皮肤生长模型的组织学检査
1、 常规石蜡切片4%甲醛溶液固定标本，4'C过夜，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡 ，包埋，石蜡连续切片，4ym，烘干。
2、 苏木素-伊红染色将组织切片先后浸于二甲苯，100%、 95%、 70%酒精中脱蜡。苏木 素浸染5min，流水冲洗，伊红酒精染色片刻，流水冲洗，选片，70%、 95%、 100%酒精分化， 5分钟/次。烘干后封片。
3、 透射电镜观察将组织用二甲苯脱蜡，酒精脱蜡，PBS浸泡，锇酸固定，丙酮逐级脱 水一Epon812浸泡，环氧树脂包埋剂与100%丙酮1:1比例浸泡24小时，用Epon812环氧树脂包 埋剂包埋，修块机修块定位，超薄切片机切片，醋酸铀、硝酸铅双重染色，投射电镜观察。
组织学检测结果如下
苏木素-伊红染色观察到重建皮肤的组织结构，新生表皮由基底层、棘细胞层、颗粒细 胞、角质细胞层组成。表皮与其下的真皮替代物(HDED)犬牙交错，表皮突呈高低不平的乳
头状伸入真皮。透射电镜观察到重建皮肤的基底层与真皮连接处的纤维丝状结构，与真皮的 弹力纤维紧密相连。表皮细胞浆中可见成束排列的张力细丝，相邻棘细胞间可见突起的桥粒 结构。组织学检测结论如下本发明人工皮肤损伤修复模型的组织学发育与正常人皮肤组织结 构基本一致。 实施例2:本实施例提供利用荧光成像观测人工皮肤生产过程的方法的一个应用实例。 用于检测细胞因子(表皮生长因子抑制剂)对人工皮肤的生长面积和生长速率的影响如下已往研究证明，表皮生长因子对皮肤生长有促进作用，而近来正在研究和开发的表皮生长因子抑制剂(EGF rec印tor tryrosine kinase inhibitor)对皮肤生长的作用尚待研究 。发明人用本发明方法研究了EGF对人工皮肤生长面积和生长速率的影响。方法是在基础培 养基中加入10ul表皮生长因子抑制剂(浓度为luM，以二甲基亚砜为溶剂)，以基础培养 基中加入10yl二甲基亚砜为对照，用上述方法进行人工皮肤培养，连续培养10天，并以5-氯甲基二乙酸荧光素染色人工皮肤的生长，用图像分析软件计算新生皮肤生长荧光面积(" r2)，并计算其新生皮肤生长速率。结果显示10天后加入表皮生长因子抑制剂的新生皮肤生 长面积为15. 29±2. 33mm2，对照组为21. 18±3. 15mm2，有统计学差异(p〈0. 05)。加入表皮 生长因子抑制剂的新生皮肤生长速率为O. 063mm2/h，不加表皮生长因子抑制剂的新生皮肤生 长速率为O. 088mm2/h，说明表皮生长因子抑制剂对皮肤生长有抑制作用。
权利要求
1.一种利用荧光成像观测人工皮肤生长过程的方法，其特征在于在人工皮肤的培养过程中，吸去人工皮肤的培养液，在人工皮肤表面滴加5-氯甲基二乙酸荧光素，然后移至荧光显微镜下观察，新生人工皮肤呈兰绿色荧光，以兰绿色荧光判断人工皮肤的生长情况，观测人工皮肤的生长情况后，吸去5-氯甲基二乙酸荧光素，加入培养基后继续培养。
全文摘要
本发明公开了一种利用荧光成像观测人工皮肤生长过程的方法在人工皮肤的培养过程中，需要观测人工皮肤的生长情况时，吸去人工皮肤的培养液，在人工皮肤表面滴加5-氯甲基二乙酸荧光素，然后移至荧光显微镜下观察，新生人工皮肤呈兰绿色荧光，以兰绿色荧光判断人工皮肤的生长情况，观测人工皮肤的生长情况后，吸去5-氯甲基二乙酸荧光素，加入培养基继续培养。本发明采用5-氯甲基二乙酸荧光素作为荧光成像物质来观测人工皮肤的生长过程，其成像更加清晰，轮廓清楚，并且荧光图像的维持时间更长，而且，5-氯甲基二乙酸荧光素作为活细胞指示剂不会影响人工皮肤的生长。此外，该方法还具有过程稳定、易操作以及重复性强的特点。
文档编号G01N21/64GK101158646SQ200710202748
公开日2008年4月9日 申请日期2007年11月29日 优先权日2007年11月29日
发明者陆洪光 申请人:陆洪光