专利名称：检测孕酮的胶体金免疫试纸的制作方法
技术领域：
检測孕酮的胶体金免疫试纸技术领域本发明涉及一种通过检测人体尿液中的孕稱水平，判断女性卵巢功能，属于胶体金免疫 诊断技术领域。
技术背景孕酮是21位碳原子的类固醇激素，分子量为314.5。孕酮与雌激素一起调节与月经周期 有关附属器官功能，尤为重要的是维持妊娠以及为胚细胞着床到子宫内膜做准备。非孕女性 孕酮主要由黄体分泌，而孕妇则主要由胎盘分泌。男女两性的肾上腺皮质及男性的睾丸也分 泌少量孕,。血循环中的孕醣主要与皮质类固醇结合球蛋白(CBG)，性激素结合球蛋白 (SHBG)以及白蛋白结合而运输，所有循环的孕兩中，只有2-10%为游离形式。血中及尿中孕酮浓度随月经周期而有明显变化。卵泡期小于lng/ml (3.2tnol/L),在黄体 期为10-20ng/ml(32-64mol/L)最高水平是在排卵后4 7天，并继续保持高水平4 6天，直到 月经前24小时降回到抹卵前水平。因为孕兩水平的升降与卵泡和黄体功能有关，测定血浆或 尿液孕酮水平临床用于判断有无排卵和非孕妇的黄体功能。如果没有排卵，黄体不形成，就 没有血浆孕翻水平的周期性升高。异常的孕,分泌与经前期紧张、了宫内膜不规律剥脱、痛 经和黄体功能不全有关。孕酮的测定方法有气相层析法、蛋白结合分析法及放射免疫法及化学发光法。由于血中 孕覿含量较低，目前应用较多的方法为蛋白结合分析、放射免疫分析法(RIA)及磁性微粒分离 的免疫酶联测定法(IEMA)及发光法。这些方法需要特殊防护设备、严苛的条件、价格昂贵的 仪器和训练有素的人员，而且操作费时、样本存储困难，不易于推广应用。免疫分析为孕酮的检溯提供了一个新的分析检测途径，现已有利用兔疫胶体金方法制成 试纸的报道中国专利200510109165.3用于奶牛早期妊娠诊断的试纸及其检测方法。该发明 为通过胶体金免疫法来检测配种后奶牛乳汁中的孕鹏含量，现场诊断奶牛早孕的检测试纸及 其检測方法。本发明为通过检测人体尿液中的孕兩，体外定性检测女性卵巢功能,技术特点及 用途均不同，不构成侵权。发明内容本发明克服了现有技术中存在的一些缺点，提供了一种通过胶体金免疫法检测人体尿液 中的孕酮，从而体外定性检測女性卵巢功能。 本发明是通过以下技术方案实现的-在孕酮胶体金诊断试纸底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线和一条 羊抗鼠多克隆抗体控制线，在底板一端端头为吸水层，另一端端头为尿液吸液层，硝酸纤维 素膜两端分别与吸水层和单克隆抗体金标垫相互交叠连接(交叠连接部分在l一2毫米范围)， 在单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。硝酸纤维素膜上有一条试验线和一条多克隆抗体控制线。控制线是由羊抗鼠多克隆抗体 包被制成；通过免疫筛选出针对一种免疫原的两种配对单抗， 一种称为单克隆抗体I用于包 被试验线，另一种称为单克隆抗体II用于胶体金标记，共同与免疫原有亲合作用，利用双抗 夹心法原理制成的试纸。把孕酮胶体金诊断试纸的样品吸液层端放入待測的尿液中(液面不得超过MAX线)，由 于毛细管作用尿液将沿着试纸条吸水层端移动，在上行过程中，尿液中的孕翻与抗孕鹏单克 隆抗体金标探针发生特异结合，当移动至固定有孕酮单克隆抗体I的试验线时，尿液中的孕 酮另一位点又与试验线中的孕翻单克隆抗体I相结合，因此其胶体金滞留于试验线上，试验 线处显示红色，为阳性；相反如果尿液中没有孕酮，抗孕爾单克隆抗体金标探针就不会与试 验线上的孕爾单克隆抗体I发生特异结合，没有胶体金滞留。即仅有一条红色控制线为阴性， 这就是双抗夹心法原理。根据此原理，两条线为阳性， 一条线为阴性得出诊断。当移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，无论尿液中有无相应抗原，标记的金标探针都会 与已设定好的羊抗鼠多克隆抗体结合滞留，使控制线显示红色。因此控制线无色带产生则代 表操作有误，检測时尿液液面超过MAX线或试纸已经过期。由于釆用上述技术方案，本发明所提供的检测孕酮的胶体金免疫试纸具有这样的有益效 果，即特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门技术人员操作，而且结果易读。
图1为本发明的主视结构图。 图2为图1的俯视剖视结构图。 图3为阴性结果图。 图4为阳性结果图。图中1、吸水板，2、硝酸纤维素膜，3、羊抗鼠多克隆抗体控制线，4、试验线，5、单 克隆抗体金标垫，6、尿液吸液层，7、底板，8、 MAX线。具体实施例1. 化学合成方法合成两种不同结合位点的孕酮免疫原(孕翻-BSA)。2. 孕酮单克隆抗体的制备。(1) 将制备的两种不同结合位点的孕兩-BSA分别免疫BALB/c小鼠。用SP20细胞融合 建立瘤株进行筛选，取瘤细胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水。(2) 提取小鼠腹水纯化筛选，获得与孕酮分子不同位点结合的两种孕酮单克隆抗体I 、 孕鹏单克隆抗体II。3. 胶体金的制备及与孕醣单克隆抗体的结合。(1) 取双蒸水加适量的氯金酸磁力搅拌加温到90 95X:，加入适量枸橼酸三纳继续加热 搅拌至沸腾5分钟，冷却后避光保存备用。(2) 把孕翻单克隆抗体标记的胶体金液，吸附纤维材料上，干燥后备用。4. 制膜机制膜利用电脑控制传动速度，保证每单位膜上包被的抗体量相等。5. 试纸条组合在孕酮胶体金诊断试纸底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试 验线和一条羊抗鼠多克隆抗体控制线，在底板一端端头为吸水层，另一端端头为尿液吸液层, 硝酸纤维素膜两端分别与吸水层和单克隆抗体金标垫相互交叠连接(交叠连接部分在l一2毫 米范围)，在单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。6. 使用方法收集晨尿，将试纸吸液层端插入尿液中，待测样本界面勿超过诊断试纸上的 "MAX"线，5分钟内观察结果。显色区为两条红色线，且检测线比控制线颜色深或相等，则检测结果为阳性；当反应线浅于控制线或仅出现一条控制线时为阴性；控制线未出现色 带，表明试纸过期或操作不当，请另取试纸重新检测。
权利要求1. 一种检测孕酮的胶体金免疫试纸，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纤维素膜(2)、单克隆抗体金标垫(5)、样品吸液层(6)、 MAX线(8)组成；底板中部为硝酸纤 维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线(4)和一条多克隆抗体控制线(3)，底板一端端 头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和单克隆抗体金 标垫相互交叠连接，在单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。
2. 根据权利要求1所述的一种检测孕酮的胶体金免疫试纸，其特征在于控制线是由羊抗鼠多 克隆抗体包被而成。
专利摘要本实用新型涉及一种检测孕酮的胶体金免疫试纸，通过检测人体尿液中的孕酮水平，从而体外检测女性卵巢功能，属于胶体金免疫检测领域。试纸是由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、单克隆抗体金标垫、样品吸液层组成；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线和一条多克隆抗体控制线，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和单克隆抗体金标垫相互交叠连接，在单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层，通过胶体金免疫双抗夹心方法制成试纸。具有特异性强，灵敏度高，易储存，结果易读，无须专门技术人员操作的优点。
文档编号G01N33/558GK201021925SQ20072000514
公开日2008年2月13日 申请日期2007年2月14日 优先权日2007年2月14日
发明者万志强, 万志静 申请人:万华普曼生物工程有限公司