专利名称：：一种适用于地西泮残留分析的酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种适用于地西泮(DZP)残留分析的酶联免疫检测试剂盒，属于酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒
技术领域：
。
背景技术：
：地西泮(Diazepam)为苯二氮卓类镇静安眠药，化学名称为1-甲基-5-苯基-7-氯-l,3-二氢-2H-l，4-苯并二氮卓-2-酮。曾用作动物饲料添加剂，作为生长促进剂,具有使动物嗜睡少动，生长快且有改变肉质的作用。也用在屠宰和动物检疫之前:或将动物转移屠宰之前，起镇静作用，以减轻动物紧张状态，降低动物伤害和死亡率。此类药物常见嗜睡，可见无力、头痛、晕眩、.恶心、便秘，偶见皮疹、肝损害、骨髓抑制等不良反应。若随意在饲料中添加此类药物，蓄积的药物通过食物链进入人体，将造成巨大的危害。为此许多国家将此类药物列入禁用药物名单。目前，国内外有关地西泮的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等，但这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，对检材的要求也比较高，需要进一步的提纯处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。近年来，国外已经开展了对苯二氮卓类免疫分析方法的研究，但国内在这方面的研究起步较晚，大部分的检测产品还需要依赖国外进口。为了加强对国内肉制品的监督力度和保障人民的身体健康，有必要展开对苯二氮卓类免疫分析方法的研究，有必要建立一种快速有效的地西泮的酶联免疫吸附检测方法。
发明内容(一)要解决的技术问题本发明的目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测试剂盒，用于地西泮残留的批量、快速(二)技术方案为实现上述目的，本发明提供了一种地西泮残留分析的酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括包被了地西泮包被抗原的酶标板、海绵支架、地西泮标准品、地西泮多克隆抗体、酶标二抗、浓縮洗涤液、显色液和反应终止液。其中，包被了地西泮包被抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被原是地西泮的半抗原3-半琥珀酸酯地西泮与卵清蛋白(OVA)的偶联复合物，所用包被液是0.05MpH9.6碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含2XOVA的上述包被液。3其中，地西泮多克隆抗体是用3-半琥珀酸酯地西泮与牛血清白蛋白(BSA)的偶联复合物常规方法免疫制备。其中，酶标二抗是辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体。其中，浓缩洗漆液(PBST)的配方为20mL蒸馏水中加入8g氯化钠，0.2g磷酸二氢钾，3g磷酸氢二钠，0.4g氯化钾，0.5mL吐温-20，浓縮洗涤液的浓度是正常使用时的50倍。其中，显色液包括A液和B液，A液配方为每100mL水中加入0.933g柠檬酸，3.68gNa2HP(V12H20和18pL30%H2O2;B液配方为60mg四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇，使用时按A:B=5:1的比例使用。本发明试剂盒的检测分析原理是酶标板上的每个孔均包被有相同量的地西泮抗原，加入待测地西泮样品和地西泮多克隆抗体后，固相包被抗原和待测地西泮相互竞争与多克隆抗体反应，由于每个孔中的固相抗原和加入的多克隆抗体含量均一致，所以当待测样品的地西泮浓度高时，则被结合在固相抗原上的多克隆抗体少，加入的酶标二抗与被固定抗体结合量少，用洗涤液洗涤后加入底物液(即显色液A液)和显色液(即B液)，显色反应浅，用酶标仪检测的吸光值低，表明抑制率高；反之，当待测样品的地西泮浓度低时，则所测的吸光值高，抑制率低。根据用已知的地西泮浓度检测所作的标准曲线，可以推算出待测样品的地西泮的浓度。(三)有益效果本发明提供的地西泮残留检测试剂盒采用了地西泮多克隆抗体，能准确灵敏地检测尿液、组织中地西泮及其他结构相似的苯二氮卓类残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法，而且本发明试剂保存时间长，无放射性污染。本发明对解决大批量样品的地西泮残留现场监控技术具有重要的现实意义。图l地西泮的标准抑制曲线。具体实施例方式以下是实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明所要保护的范围。实施例1试剂盒操作及结果计算待测样品经前处理后，用PBST定容备用。拆开真空包装袋并取出酶标板，在室温下平衡5分钟备用。配制Ong/mL，0.7ng/mL，1.4ng/mL，2.8ng/mL，5.6ng/mL，11.2ng/mL，56ng/mL，112ng/mL的地西泮标准液，加入50标样或处理好的待测样品到各孔中，标样和样品做4个重复，加入50pL稀释的抗体，37'C孵育30分钟；倒出孔中的液体，用稀释好的PBST洗5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍千；加入按1:3000稀释好的酶标羊抗兔二抗100^L，37°C孵育30分钟；倒出孔中的液体，用稀释好的PBST洗板5次，拍干；取A液和B液按5:1混匀，每孔加100pL，在暗处显色10~15分钟，每孔加入50的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的吸光值。将含0ng/mL标准品孔的吸光值定为B。，其余孔的吸光值定为B;以B/Bj直为纵坐标，相应标准品浓度的log值为横坐标，绘制地西泮标准抑制曲线。根据曲线的回归方程可以求出对应待测样品中地西泮的浓度，也可以求出地西泮IC5o(B/Bo-50X)及最小检测限LOD(90%抑制率对应的浓度)。IC5Q为50.12ng/mL，LOD为5.12ng/mL，检测范围(20%80°/。抑制率对应的浓度)为9.12~251.2ng/mL，线性方程y=-0.4068x+1.1899,R2=0.9921。实施例2地西泮残留分析酶联免疫吸附检测试剂盒的组建-本例中，试剂盒包含如下部分(1)包被了地西泮抗原的酶标；(2)海绵支架；(3)1mg/mL地西泮标准品(Sigma公司)；(4)地西泮多克隆抗体；(5)辣根过氧化酶标记羊抗兔抗体(康成生物工程公司)；(6)浓縮洗涤液配方为8g氯化钠，0.2g磷酸二氢钾，3g磷酸氢二钠，0.4g氯化钾，0.5mL吐温-20和20mL蒸馏水；(7)显色液A液配方0.933g柠檬酸，3.68gNa2HP04'12H20，18pL30%H202，n100mL超纯水(8)显色液B液配方60mg四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇实施例3保存期实验将试剂盒放置于4"C保存，分别取0、10、20、30、60、90、120、150和180d的试剂盒，以5.25pg/mL抗原工作浓度和1.2pg/mL抗体工作浓度为工作浓度，进行标准样品检测以测定其检测效果。保存期测定结果见表1，表明IC5()变化不大，试剂盒在4"C下可保存6个月以上。表1试剂盒保存实验<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例4试剂盒特异性实验:选择地西泮的结构类似物作为待测物，测得各种物质的抑制中浓度(IC50)，再用下式计算抗体对这些物质的交叉反应性；交叉反应率愈小，则抗体对地西泮的特异性愈强，反之则抗体的特异性差。交叉反应(01%)=105。(地西泮)/1(:5。(供试物>100%。实验测定结果见表2，采用间接ELISA法，地西泮多克隆抗体对分子结构相似的其他苯二氮卓类药物具有较好的特异性，交叉反应率均较小。表2交叉反应反应物质交叉反应率(％)地西泮100硝西泮4.57-氨基硝西泮<17-氨基氯硝西泮<0.1氯硝西泮<0.1氯氮卓<0.1三唑仑<0.1盐酸异丙嗪<0.1盐酸二氧丙嗪<0.1实施例5添加回收实验:(1)样品的提取净化取lmL尿样于离心管中，加入4mL、O.lMNaOH溶液振荡2-5min,加入5mL的正己垸，漩涡5min后，15°C3000rpm离心5min:取上层有机相，氮气吹干，加入lmL的标准品稀释液，作为试样供分析。(2)在空白的人尿中添加标准品储液，使其浓度为5.0ng/mL、15.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL。各浓度分别制备样品五份，测定其含量，将实测浓度与添加浓度进行比较。在空白尿样中添加不同浓度的地西泮，按上述的前处理方法进行提取，浓縮后分析。结果见表3。可以看出，尿样中的回收率在68.8%~92.5%之间。该分析方法重复性良好，相对标准偏差低于4.24%。表3添加回收率的测定添加浓度(ng/mL)_实测浓度(ng/mL)_回收率(％)5.03.73.13.43.73.368.8±4.115.011.31313.513.113.485.6±4.2450.047.646.347.543.246.692.48±2.42100.091.292.692.593.093.192.5±1.2权利要求1.一种适用于地西泮残留分析的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于包含包被了地西泮包被抗原的酶标板、海绵支架、地西泮标准品、地西泮多克隆抗体、酶标二抗、浓缩洗涤液、显色液和反应终止液；所述地西泮包被抗原为3-半琥珀酸酯地西泮与卵清蛋白的偶联复合物；所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体。2.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于浓縮洗涤液的配方为20mL蒸馏水中加入8g氯化钠，0.2g磷酸二氢钾，3g磷酸氢二钠，0.4g氯化钾，0.5mL吐温-20。3.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于显色液包括A液和B液，A液配方为每IOOmL水中加入0.933g柠檬酸，3.68gNa2HP04'12H20和1830%H202;B液配方为60mg四甲基联苯胺溶于lOOmL乙二醇。4.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于反应终止液为2mol/L的硫酸液。全文摘要一种适用于地西泮残留分析的酶联免疫检测试剂盒，属于酶联免疫吸附分析试剂盒
技术领域：
。本发明试剂盒，包含包被了地西泮包被抗原的酶标板、海绵支架、地西泮标准品、地西泮多克隆抗体、酶标二抗、浓缩洗涤液、显色液和反应终止液；地西泮包被抗原为3-半琥珀酸酯地西泮与卵清蛋白的偶联复合物；酶标二抗是辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体。本发明试剂盒采用了地西泮多克隆抗体，能准确灵敏地检测尿液或组织中地西泮及其他结构相似的苯二氮类残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法，而且本发明试剂盒保存时间长，无放射性污染，对解决大批量样品的地西泮残留现场监控具有重要的现实意义。文档编号G01N33/543GK101315374SQ200810022159公开日2008年12月3日申请日期2008年6月30日优先权日2008年6月30日发明者刘丽强,彭池方,李秋生,胡拥明,胥传来,缓袁申请人:江南大学