专利名称：基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器，以及用该 传感器作为电化学发光分析探针的免疫检测方法。
背景技术：
半导体纳米晶体(NCs)由于其独特的荧光特性而广泛应用于生物标记与免疫分析 中。近几年来，半导体纳晶的电致化学发光(ECL)研究引起了人们极大的兴趣。较之 荧光分析，半导体纳晶的ECL通过电化学控制，不需激发光源，背景小，灵敏度高，线 性范围宽，在ECL生物传感器和免疫分析中具有潜在的应用价值。但是到目前为止，基 于半导体纳晶的ECL进行生物分子的检测还很少有报道，可能是由于半导体纳晶的ECL 强度不如传统的发光试剂如鲁米诺和Ru(bpy)^+。因此，发展新的半导体纳晶材料以及 提高半导体纳晶的ECL强度成为研制ECL生物传感器的当务之急。[参见(a) Constantine， C. A.; Gattas-AsfUra， K. M.; Mello， S. V.; Crespo, G.; Rastogi， V.; Cheng， T. C.; DeFrank， J. J.; Leblanc， R. M. / P/z". C/ie/n. 5 2003, 707， 13762-13764. (b) Constantine, C. A.; Gattas-Asfiira， K. M.; Mello， S. V.; Crespo， G.; Rastogi， V.; Cheng, T. C.; DeFrank， J. J.; Leblanc, R. M. iawgw"z> 2003， 79, 9863-9867. (c) Goldman, E. R.; Balighian， E. D.; Mattoussi， H.; Kenneth Kuno， M.; Mauro, J. M.; Tran， P. T.; Anderson, G. P.j附.G/iew. Soc. 2002,"《6378-6382. (d) Goldman, E. R.; Clapp, A. R.; Anderson, G. P.; Uyed4 H. T.; Mauro， J. M.; Medintz, I. L.; Mattoussi, H. ^wa/. CZie附.2004， 76， 684-688.]最近的研究表明，纳晶薄膜技术为研制ECL传感器提供了一种有效的方法，向CdSe 或CdSe/CdS纳晶膜施加负电位能极大地提高发光强度。CdSe NCs因其具有优良的光学 特性而成为ECL研究的热门材料。碳纳米管(CNTs)由于具有良好的导电性能够极大地 提高半导体纳米晶体的ECL强度。此外，壳聚糖(CHIT)具有极好的成膜能力和生物相 溶性，碳纳米管溶于壳聚糖已广泛用于生物传感器中。CdSe NCs/CNT-CHIT纳米复合 物具有很强的ECL，良好的生物相溶性，极好的稳定性，是用于研制ECL生物传感器的 良好的纳米材料，在免疫生物学和临床检验学等研究中将会有广阔的应用前景。[参见:(e) Jie， G.; Liu, B.; Pan, H.; Zhu， J. J.; Chen, H. Y. J"a/. C/ww. 2007， 79， 5574-5581. (f) Poznyak， S. K.; Talapin, D. V.; Shevchenko， E. V.; Weller， H. Mwo丄e比2004，《693-698. (g) Weller， H. Awgew. C//ew. /"A 1993， 32， 41-53. (h) Murray, C. B.; Norris， D丄； Bawendi， M. G. J. J附.C/ie/n. Soc. 1993， //5， 8706-8715.目前，基于纳晶复合物的电化学 发光免疫传感器用作免疫分析探针还未见报道。发明内容本发明的目的是提供一种新型的基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器， 以及用该传感器作为电化学发光分析探针的免疫检测方法。 本发明的技术方案如下一种基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器，它是在金电极表面上覆盖有 CdSe纳晶-碳纳米管-壳聚糖复合物膜，并用硅烷偶联剂处理后固定抗体的电化学发光免 疫传感器。一种制备上述基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器的方法，它由下列步 骤组成步骤l.将一定量壳聚糖溶于含有0.05MHC1的热水(80-90 °C)中，得到0.50%的壳 聚糖溶液，然后过滤得到无色的滤液，多壁碳纳米管在混酸(硫酸与硝酸的体积比为3:1) 中超声氧化4小时，离心后用二次水洗涤，直至pH值为 7,然后将纯化处理后的多壁碳 纳米管分散于壳聚糖溶液(0.50 mg mL")超声15分钟，得到一均匀的黑色CNT-CHIT复合 溶液，步骤2.将0.05 mM的CdSe纳晶溶液用盐酸调至pH 5.5,然后与上述步骤l得到的 CNT-CHIT复合溶液以1:3的体积比超声混合0.5小时，得到CdSeNCs/CNT-CHIT复合溶 液，备用，步骤3.将4 mm直径金电极依次用l.O, 0.3和0.05 的三氧化二铝抛光粉抛光处 理，再用二次水冲洗干净，然后将电极置于在0.5MH2SO4溶液中，在-0,2 1.6V下扫 描至循环伏安曲线稳定，步骤4.将步骤3的金电极冲洗干净，待电极干燥后取IO n L步骤2的CdSe NCs/CNT-CHIT混合溶液滴在电极表面于空气中凉干，然后浸在质量百分比浓度为l-3y。的硅垸偶联剂KH550的水溶液中0.5-2小时，二次水冲干净后浸入2.5-5 %的戊二醛 (GLD)溶液中10-20 min，步骤5.将步骤4的电极冲洗干净后浸入到0.5-l mg/mL的羊抗人IgG的50 mM磷酸 缓冲溶液(pH7.4)中反应12-20小时，然后用50mM的磷酸缓冲液冲洗干净，浸入质量 百分浓度为2-3%的牛血清蛋白(BSA)中封闭l-2小时，即制得基于CdSe纳晶复合物的 电化学发光免疫传感器。一种采用基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器作为电化学发光分析探针 的免疫检测方法，它由下列步骤组成步骤1.将上述方法制得的基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器清洗后 再浸入40^L要检测的样品(人的IgG)，在37'C下温育50分钟，步骤2.电化学发光(ECL)免疫检测将步骤l处理后的基于CdSe纳晶复合物的 电化学发光免疫传感器清洗，在含有0.1 M K2S208和0.1 M KC1的0.1 M PBS (pH 7.4) 缓冲液中，进行电化学发光的测试，发光强度与待测样品(HIgG)的浓度成线性关系。所述的电化学发光测试是以修饰好的金电极(基于CdSe纳晶复合物的电化学发光 免疫传感器)为工作电极、Pt电极为对电极、甘汞电极为参比电极的三电极体系，用 MPI-A型电致化学发光仪，在0到-1.5 V进行循环伏安扫描，光电倍增管高压设为 50(K700V。本发明中CNT-CHIT比CNTs具有更开放的多空结构(扫描电子显微镜图1A， 1B)， 使复合的CdSeNCs ECL不仅能在修饰电极和溶液界面产生，而且能在膜的内部产生， 极大的提高了发光强度。而且，CdSeNCs/CNT-CHIT具有极好的生物相溶性和稳定性， 是组装ECL免疫传感器的良好材料。KH550不仅用作ECL传感器组装过程中固定抗体 的偶联剂，而且因氨基功能团的催化效应能够极大的增强ECL (见图2)。ECL检测表 明抗原浓度在0.02到200 ng/mL范围内，ECL强度随着浓度的增大而降低，与浓度的 对数成线性关系(见图2中的插图)，检测限达到0.001 ng/mL。本发明的电化学发光传感器表现出了优良的准确性、高灵敏性，稳定性与重现性， 免疫分析检测迅速、方便，可用于实际样品的检测。
图1为本发明中CNTs (A)与CNT-CHIT (B)的扫描电子显微镜(SEM)表征结果。图2采用电化学发光技术，在检测范围内， 一系列不同浓度的人的IgG (0,0.02，0.1， 0.5， 2， 10, 50， 100， 200 ngmU1)的光学免疫分析结果，及标准曲线。
具体实施方式
实施例l.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测首先将直径4mm金电极依次用1.0， 0.3和0.05pm的三氧化二铝抛光粉抛光处理， 二次水冲净后置于在0.5MH2SO4溶液中，在-0.2 1.6丫下扫描至循环伏安曲线稳定。取IO u L CdSe NCs/CNT-CHIT混合溶液滴在电极表面于空气中凉干，然后浸在质量百分比浓度为3y。的硅垸偶联剂KH550的水溶液中0.5小时。二次水冲干净后浸入2.5%的戊 二醛(GLD)中15min。将上述电极洗净后浸入到0.5 mg/mL的羊抗人IgG (50 mM PBS， pH 7.4)反应12小 时，然后用50 mM的PBS缓冲液冲洗干净，浸入质量百分浓度为2%的牛血清蛋白 (BSA)中封闭1小时。清洗后再浸入40^L要检测的样品(人的IgG)，在37'C下温 育50分钟，抗体与抗原反应，完全清洗后的电极可用于电化学发光检测。 实施例2.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测将硅烷偶联剂KH550的浓度改为P/。，制备的其他条件同实施例l，得到形貌与性 质类似于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例1。 实施例3.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测将"浸在质量百分比浓度为3%的硅垸偶联剂KH550的水溶液中0.5小时"改为"浸 在质量百分比浓度为3%的硅烷偶联剂KH550的水溶液中2小时"，制备的其他条件同 实施例l，得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例l。实施例4.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测将"浸入2.5%的戊二醛(GLD)中15 min。"改为"浸入2.5%的戊二醛(GLD)中 20min。"，制备的其他条件同实施例1,得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。 免疫检测结果同实施例l。实施例5.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测将"浸入2.5%的戊二醛(GLD)中15min。"改为"浸入5%的戊二醛(GLD)中10 min。"，制备的其他条件同实施例l，得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。 免疫检测结果同实施例l。实施例6.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测将"0.5 mg/mL的羊抗人IgG (50 mM PBS， pH 7.4)"改为"1 mg/mL的羊抗人IgG (50mMPBS，pH7.4)"，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的 免疫传感器。免疫检测结果同实施例l。实施例7.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测将"浸入到0.5 mg/mL的羊抗人IgG (50 mM PBS, pH 7.4)反应12小时"改为"浸 入到0.5 mg/mL的羊抗人IgG (50 mM PBS, pH 7.4)反应16小时"，制备的其他条件同 实施例l，得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例l。实施例8.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测将"浸入到0.5 mg/mL的羊抗人IgG (50 mM PBS， pH 7.4)反应12小时"改为"浸 入到0.5 mg/mL的羊抗人IgG (50 mM PBS， pH 7.4)反应20小时"，制备的其他条件同 实施例l，得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例l。实施例9.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测将封闭1小时改为封闭2小时，制备的其他条件同实施例1,得到形貌与性质类1以 于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例1。 实施例IO.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测将"2%的牛血清蛋白(BSA)"改为"3%的牛血清蛋白(BSA)",制备的其他条 件同实施例l，得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例 1
权利要求
1.一种基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器，其特征是它是在金电极表面上覆盖有CdSe纳晶-碳纳米管-壳聚糖复合物膜，并用硅烷偶联剂处理后固定抗体的电化学发光免疫传感器。
2. —种制备权利要求1所述的基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器的方 法，其特征是它由下列步骤组成步骤l.将一定量壳聚糖溶于含有0.05 M HCl的80-90 。C的热水中，得至ij0.50。/o的壳聚 糖溶液，然后过滤得到无色的滤液，多壁碳纳米管在3份硫酸与1份硝酸组成的混酸中超 声氧化4小时，离心后用二次水洗涤，直至pH值为 7，然后将纯化处理后的多壁碳纳米 管分散于0.50mg/mL的壳聚糖溶液超声15分钟，得到一均匀的黑色碳纳米管-壳聚糖复 合溶液，步骤2.将0.05mM的CdSe纳晶溶液用盐酸调至pH5.5，然后与上述步骤l得到的碳 纳米管-壳聚糖复合溶液以l:3的体积比超声混合0.5小时，得到CdSe NCs/CNT-CHIT复 合溶液，备用，步骤3.将4 mm直径金电极依次用l.O, 0.3和0.05 pm的三氧化二铝抛光粉抛光处 理，再用二次水冲洗干净，然后将电极置于0.5MH2SO4溶液中，在-0.2 1.6V下扫描 至循环伏安曲线稳定，步骤4.将步骤3的金电极冲洗干净，待电极干燥后取IO p L步骤2的CdSeNCs/CNT-CHIT混合溶液滴在电极表面于空气中凉干，然后浸在质量百分比浓度为 l-3。/。的硅烷偶联剂KH550的水溶液中0.5-2小时，二次水冲干净后浸入2.5-5 %的戊二醛 溶液中10-20min，步骤5.将步骤4的电极冲洗干净后浸入到0.5-l mg/mL的羊抗人IgG的50 mM磷酸 缓冲溶液(pH7.4)中反应12-20小时，然后用50mM的磷酸缓冲液冲洗干净，浸入质量 百分浓度为2-3%的牛血清蛋白(BSA)中封闭l-2小时，即制得基于CdSe纳晶复合物的 电化学发光免疫传感器。
3. —种采用权利要求1所述的基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器作为 电化学发光分析探针的免疫检测方法，其特征是它由下列步骤组成步骤1.将上述方法制得的基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器清洗后 再浸入40pL要检测的样品(人的IgG)，在37'C下温育50分钟，步骤2.电化学发光(ECL)免疫检测将步骤l处理后的基于CdSe纳晶复合物的 电化学发光免疫传感器清洗，在含有0.1MK2S2Os和O.lMKCl的0.1 M磷酸缓冲、液 中，pH7.4,进行电化学发光的测试，发光强度与待测样品(HIgG)的浓度成线性关系。
4.根据权利要求3所述的免疫检测方法，其特征是所述的电化学发光测试是以基 于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器为工作电极、Pt电极为对电极、甘汞电极 为参比电极的三电极体系，用MPI-A型电致化学发光仪，在O到-1.5 V进行循环伏安 扫描，光电倍增管高压设为500 700V。
全文摘要
一种基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器，其特征是它是在金电极表面上覆盖有CdSe纳晶-碳纳米管-壳聚糖复合物膜，并用硅烷偶联剂处理后固定抗体的电化学发光免疫传感器。将本发明的传感器完全清洗后再浸入40μL不同浓度的待测样品(HIgG)中，在37℃下温育50分钟，然后进行电化学发光的测试，发光强度与待测样品(HIgG)的浓度成线性关系。本发明公开了基于纳晶复合物的电化学发光免疫传感器的制法。
文档编号G01N33/52GK101251535SQ20081002450
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月25日 优先权日2008年3月25日
发明者接贵芬, 朱俊杰 申请人:南京大学