专利名称：一种dna损伤修复能力遗传风险评估的方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA损伤修复能力遗传风险评估的方法，用于评估基因损伤修复能力的强弱，针对性的提示受检者面对于各种可能导致基因损伤的外界因素时应采取的恰当应对措施，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
在基因组核酸复制的过程中，细胞内具有复杂的机制保证遗传信息被正确的复制，因为DNA的遗传保守性是维持物种相对稳定的主要因素。但是，在生物体内外环境多种因素影响下，也会出现DNA损伤，也称DNA突变。绝大多数损伤被机体内一整套十分有效的修复系统所修复，有些损伤则可造成机体的不可逆损害，出现细胞衰老、死亡或形成肿瘤等。
多种因素可引起DNA损伤，如紫外线、电离辐射、烷化剂等。修复的形式也是多样的。某些DNA损伤可以直接修复；切除修复是常见的修复方式；重组修复是DNA损伤较多时的修复方式；SOS修复是DNA损伤严重时的应急修复方式；细胞周期检查点控制是真核生物诱导修复的主要机制。由于遗传因素的不同，每个个体对于基因损伤的修复能力也有所差异，而这种差异会影响到机体对诸多疾病，尤其是癌症的易感性。
DNA损伤是基因突变的前奏，是癌变、畸变的分子基础。外界环境和生物体内部的许多因素都会经常导致DNA分子的损伤或改变，但由于存在强大的DNA修复系统，DNA分子的损伤或突变可以通过多种机制修复(如碱基切除修复，核苷酸切除修复，重组修复及错配修复等)。
DNA损伤的修复机制可保护细胞的基因免遭致癌因素的侵害，从而维持细胞中基因组的完整性。近年来的分子生物学研究进展已证实，DNA修复机制是由一类DNA修复基因所控制，DNA修复基因存在多态性，其多态性可影响到DNA修复能力的高低。如果DNA修复能力有缺陷，受损的基因不能修复，便会大大地增加基因的突变的概率，使个体处于非常高的肿瘤罹患危险之中，增加了肿瘤的易感性。而肿瘤已成为二十一世纪的人类第一杀手。在2005年全世界5800万死亡总数中，癌症占所有死亡的760万(或13％)。并且2005年所有癌症死亡的70％以上发生在低收入和中等收入国家。预计全世界癌症死亡将继续增加。据估计，2015年将有900万人死于癌症，并且2030年将有1140万人死亡。在我国，癌症发病及死亡率一直呈上升趋势，在城镇居民中，癌症已占死因的首位。为此，我国制定了《中国癌症预防与控制规划纲要(2004-2010)》，确定肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌及鼻咽癌为我国癌症防治重点，强调癌症的早期发现、早期诊断及早期治疗。
目前临床上关于基因损伤修复能力遗传的检测至今尚无完善的检测方法和统一的标准。曾有Todd等用氯霉素酰基转移酶(CAT)反映细胞内源性P53活性来检测DNA损伤，结果灵敏稳定。但CAT的检测要用放射性同位素，不够安全，而且费用较高，限制了其推广应用。
目前的基础研究已能从理论上证明基因分型检测可以用于判断基因损伤修复能力的强弱，而且检测方法简便、检测成本在可接受程度中、检测结果可信。因此，基因分型检测用于评估DNA损伤修复能力的可行性是明确的。
不同的人在相同的环境下基因损伤修复能力存在个体差异。面对不同的基因损伤修复能力风险，需要采取不同的风险预防手段。因此，综合利用现代科学研究成果，开发一项基于分子遗传基础的基因损伤修复能力评估及个性化干预提示产品会对由于基因损伤修复能力缺陷而引起疾病的发生起到预警、个性化防治的作用，具有很强的社会意义和市场前景。目前对涉及基因损伤修复通路的一些基因已经进行了大量研究。其作用机制、生化功能、通路情况、调控、转录等等方面都有明确可靠的研究结果；已经有可靠的检测方法、仪器设备和检测试剂等。因此利用现有科学、技术研究成果来开发这样一个产品，时机是成熟的。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA损伤修复能力遗传风险评估的方法，可以让受检者了解自身基因损伤修复能力的强弱，加强对可能发生基因损伤的环境的辨别能力，采取适当措施防止或降低基因损伤的程度，从而有效减少由于基因损伤带来的癌症风险。
为实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种利用基因检测和软件分析进行DNA损伤修复能力遗传风险评估的具体实施方法。
为实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种DNA损伤修复能力遗传风险评估的方法，其特征在于，其方法为 步骤1.检测的样品类型与采样方法 用采样拭在20-30被测者口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本； 步骤2.基因组DNA的抽提方法 采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时-2.5小时，共抽提20-30个被测者样本，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测； 步骤3荧光定量PCR反应 将每一个被测者样本分别放入5个反应孔，同时检测5个位点，即多聚ADP核糖转移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQID NO2Arg194Trp、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp；20-30个被测者样本就有100-150个反应孔，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔； 每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan
-MGB技术，进行检测试剂合成； 在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman
MGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl2溶液、0.02μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、去离子水4.98μl、5个位点分别采用不同的正向引物(20μM，0.225μl)、反向引物(20μM，0.225μl)、VIC荧光探针(10μM，0.25μl)和FAM荧光探针(10μM，0.25μl)工具进行检测(详见下表)；
将101-151个反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，并自动将20-30个被测者样本检测5个点位的数据对号入座到5个图中，同时生成5张图，即多聚ADP核糖转移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala图、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp图、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln图、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln图、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp图； 步骤4SNP基因型分析 将ABI7900型荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的5个表和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型； (1)、多聚ADP核糖转移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala 在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.4-0.5、Y坐标轴0.2-0.4区域为空白对照、X坐标轴0.2-0.4、Y坐标轴1.0-1.3区域为TT基因型、X坐标轴0.7-0.9、Y坐标轴0.7-1.0区域为TC基因型、X坐标轴0.8-0.9、Y坐标轴0.3-0.4区域为CC基因型，其中，CC为风险基因型，携带风险基因型时酶的活性降低，导致多种癌症的发生风险增加； (2)、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp 在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.1-0.2、Y坐标轴0.2-0.3区域为空白对照、X坐标轴0.1-0.2、Y坐标轴0.9-1.1区域为CC基因型、X坐标轴0.3-0.5、Y坐标轴0.75-0.95区域为TC基因型、X坐标轴0.5-0.6、Y坐标轴0.5-0.6区域为TT基因型，其中，TT为风险基因型，携带风险基因型时XRCC1活性降低，导致个体的DNA修复能力下降，癌症的发生风险增加； (3)、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln 在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.1-0.2、Y坐标轴0.3-0.4区域为空白对照、X坐标轴0.1-0.2、Y坐标轴2.1-2.2区域为TT基因型、X坐标轴0.4-0.6、Y坐标轴1.1-1.7区域为TC基因型、X坐标轴0.8-1.0、Y坐标轴0.4-0.5区域为CC基因型，其中，TT为风险基因型，携带风险基因型时个体的DNA修复能力下降，癌症的发生风险增加； (4)、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln 在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.0-0.1、Y坐标轴0.2-0.3区域为空白对照、X坐标轴0.05-0.15Y坐标轴1.5-2.0区域为AA基因型、X坐标轴0.7-0.9、Y坐标轴1.4-1.6区域为AG基因型、X坐标轴0.7-1.2、Y坐标轴0.3-0.5区域为GG基因型，其中，AA和AG为风险基因型，携带风险基因型时基本转录因子复合物不能正确识别DNA损伤位点，DNA上致癌损伤积累，癌症的发生风险增加； (5)、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp 在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.1-0.2、Y坐标轴0.4-0.5区域为空白对照、X坐标轴0.0-0.1、Y坐标轴2.3-2.8区域为TT基因型、X坐标轴0.8-0.1、Y坐标轴2.2-2.5区域为GT基因型、X坐标轴0.8-1.0、Y坐标轴0.4-0.5区域为GG基因型(该基因型在中国人群中频率很低，附图30个样本中未检出该基因型)，其中，GT和GG为风险基因型，携带风险基因型时ERCC2参与构成的转录因子复合物性能弱化，癌症的发生风险增加； 每一个被测者的5个点落在5个表上哪个区域，即可知道被测者DNA损伤修复能力的遗传风险； 步骤5，根据检测结果给予个性化指导建议，主要有以下几点 一、避免过多、过强的紫外线照射阳光中适量的紫外线照射对人体有益，但过多、过强的紫外线，尤其是紫外线灯等的照射，会引起胸腺嘧啶二聚体的形成，还可以引起DNA之间的交联，DNA与蛋白质的交联，甚至DNA链的断裂。紫外线对人的伤害主要限于皮肤； 二、避免电离辐射引起的基因损伤电离辐射可导致DNA分子的多种变化，如碱基变化、脱氧核糖变化、DNA键断裂、DNA链交联等。这些辐射可能会引起癌症的发生。电离辐射广泛存在于人们的生活环境中，包括天然辐射和人造辐射。在日常生活中，应注意尽量避免接触含有放射性物质的东西，如夜光手表等； 三、注意防止烷化剂引起的DNA损伤烷化剂种类很多，如芥子气、硫酸二乙酯等。很多烷化剂都是致癌物。现在工业中大量使用烷化剂，应尽量避免接触。烷化剂引起的损伤有碱基烷基化、碱基脱落、DNA断链、DNA链交联等； 四、戒烟酒并注意营养补充吸烟和饮酒会抑制DNA的修复，缺乏叶酸会增加DNA双链打开的可能性，而这不容易修复，往往造成DNA永久的损伤。在日常生活中，应注意多补充富含各种营养元素的新鲜水果蔬菜及菜花、酵母等富含叶酸的食物。
本发明通过同时检测多聚ADP核糖转移酶家族成员1(Poly ADP-ribosepolymerase family，member 1，PARP1)的单核苷酸多态性(SNP)位点、X射线交错互补修复基因1(X-ray repair complementing defective repair inChinese hamster cells 1，XRCC1)的单核苷酸多态性位点与切除修复复合物2(Excision Repair Cross-complementing Rodent Repair Deficiency，Complementation Group 2，ERCC2)的单核苷酸多态性位点来评估个体对DNA损伤修复能力的遗传风险，并根据遗传风险评估结果进行个性化健康指导，针对性的提示受检者面对于各种可能导致基因损伤的外界因素时应采取的恰当应对措施。
目前，经证实并且机理研究清楚的与基因损伤修复能力密切相关的基因有多聚ADP核糖转移酶(PARP1)、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)、切除修复复合物2(ERCC2)等。在不同人群中与基因损伤修复有显著相关性的基因位点包括PARP1 Val762Ala、XRCC1 Arg194Trp、XRCC1 Arg399Gln、ERCC2Lys751Gln和ERCC2 Asn312Asp。以上位点有国内外大量的关联分析数据支持。
一、多聚ADP核糖转移酶(PARP1) PARP1全称poly(ADP-ribose)polymerase family，member 1，多聚ADP核糖转移酶，又简写为ADPRT，位于第一号染色体1q41-q42位置。基因全长47.3kb，mRNA全长3861bp，共有23个外显子，该突变位点位于第17个外显子。PARP1编码多聚ADP核糖转移酶。这种酶通过聚ADP核糖基化反应修正多种核蛋白。这种修正以DNA为基础，参与多种重要的细胞活动例如分化，增殖，肿瘤转移等。同时也参与分子水平的活动，例如修复DNA受损的细胞等等。PARP1是一种高丰度核蛋白，人类的PARP1有三个蛋白结构域，其中包括一个DNA结合区域。当DNA受损时，PARP1立刻结合到DNA链断裂，通过共价作用修改各种参与DNA修复作用的蛋白的属性，同时通过对自己的核糖基化作用，脱离DNA链，让其他DNA修复蛋白与DNA链断裂点结合，进行修复。当DNA受损过于严重时，PARP1能起到消耗细胞中NAD(nicotinamide adenine dinucleotide)和ATP的作用，同时停留在DNA链断裂处，阻止其他DNA修复蛋白进行修复，启动细胞死亡路径。这也就是说，在某个细胞DNA受损过于严重的情况下，PARP1还能起到导致细胞死亡的作用，从而避免受损的DNA继续被复制。另有其他的研究证实，PARP1能与DNA转录启动因子SPA1结合，通过这个途径，其可以抑制转录的进行，进而调控基因的转录，并且可以在DNA未修复情况下引发调亡。rs1136410是位于第一号染色体上PARP1基因上的一个C/T多态，引起PARP1基因编码的蛋白第762个氨基酸由Val变为Ala，目前研究表明该氨基酸替换能直接导致ADPRT酶的活性的降低，进而影响到机体的基因损伤修复能力。
在关联分析研究方面2004年，Kristin L等人对PARP1 Val762Ala多态与前列腺癌的研究中(488 cases，524 controls，高加索人)发现PARP1 Ala/Ala基因型在前列腺病人中比例明显高出非患病人群。PARP1 Ala/Ala基因型的前列腺癌危险度为(OR＝2.65；95％CI，1.08-6.49)；PARP1 Val/Ala基因型为(OR＝1.18；95％CI，0.85-1.64)。同时利用PARP1 Val/Val基因型为参照，PARP1多态与前列腺肿瘤的关联性在年轻男性中更加显著[(＜65岁)男性(OR，4.77；95％CI，1.01-22.44)，(＞65岁)男性(OR，1.78；95％CI，0.55-5.82)]。在利用PARP1 Ala/Ala基因型的淋巴细胞进行氧化破坏的实验中还发现，PARP1酶有针对氧化破坏的功能。2004年，Bingtao Hao等人使用ESCC(etiology ofesophageal squamous cell carcinoma)对数个BER基因进行研究。在对419个食道癌患者的研究中发现，PARP1 62Ala的肠癌危险度为1.25[95％(CI)1.02-1.53]，同时也发现了PARP1 Val762Ala与XRCC1 Arg399Gln的易感性在中国人口ESCC中的基因-基因交互作用。
2005年，Zhang X等人的研究发现PARP1 Val762Ala与XRCC1 Arg399Gln多态性与蛋白质能以及BER活动性有关。在针对这两个多态性以及吸烟的因素与肺癌的关联性研究中得出(样本量1000，1000对照)PARP1 Ala/Ala基因型相对于Val/Val基因型 的肺癌危险度OR＝1.68[95％confidence interval(95％CI)，1.27-2.23]；在Ala/Ala基因型中，不抽烟人群和抽烟人群(＜＝16，16到28，＞28条/年)的肺癌危险度分别为1.13(0.79-1.62)，1.35(0.68-2.70)，2.46(1.35-4.51)和17.09(8.15-35.83)，(P＜0.001)。当PARP1 762Ala/Ala和XRCC1 399Gln/Gln基因型同时出现时，肺癌危险度为5.91(95％CI，2.09-16.72)。研究结果显示，PARP1 762Ala/Ala在吸烟引发的肺癌发生中起到重要作用。2001年-2003年张志等人以聚合酶链反应-限制性片段长度多态分析方法，检测236例胃癌患者和708例无肿瘤正常对照的基因型。以logostic多因素回归模型计算各基因型的胃癌风险以及基因-基因交互作用对胃癌风险的影响。结果PARP1 Ala/Ala基因型患胃癌的风险比PARP1 Val/Val基因型高2倍(OR＝2.07；95％CI＝1.33-3.21；P＝0.001)。
二、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1) XRCC1基因全称X-ray repair cross--complementing gene 1，人类X射线交错互补修复基因1，位于第19号染色体1q13.2-13.3位置。基因全长32.3kb，mRNA全长2087bp，共有17个外显子，编码634个氨基酸的蛋白。XRCC1编码的蛋白对因电离辐射和烷基化物引起的DNA单链断裂能起到有效的修复作用。XRCC1编码的蛋白与DNA连接酶III、聚合酶β、多聚ADP核糖转移酶交互作用，参与DNA的碱基切除修复(Base Excision Repair，BER)通路。众多研究显示，XRCC1基因上部分位点的多态性，与癌症发生有密切的关系。
XRCC1有三个主要的功能区域，XRCC1通常利用与其它酶的结合，改变其它酶的活性，参与DNA修复。XRCC1在机体内各个组织中的表达量均不高，在大肠中的表达相对较大。XRCC1参与的DNA修复通路的遗传性或获得性缺陷将破坏基因的完整性，导致细胞向恶性转变，从而影响个体对肿瘤疾病的易感性。
rs1799782是位于第19号染色体XRCC1基因上的一个C/T多态，引起XRCC1基因编码的蛋白第194个氨基酸由Arg变为Trp，可能引起XRCC1活性降低，导致个体的DNA修复能力下降。rs25487是位于第19号染色体XRCC1基因上的一个G/A多态，引起XRCC1基因编码的蛋白第399个氨基酸由Arg变为Gln。Arg399Gln位于第10号外显子，XRCC1蛋白BCRT I区域。突变型的Gln氨基酸可能可以加强XRCC1蛋白与DNA-致癌物加合物的结合能力，从而影响个体的肿瘤易感性。
关联分析研究方面，目前国内外学者已作了大量研究，主要成果有1、rs1799782 Chen等对中国人群109例肺癌患者和109例正常对照的研究发现，194Trp/Trp基因型个体发生肺癌的相对危险性增加(OR＝3.06，95％CI0.94~9.92)。2001年，宋春英和谭文等人对中国北京、四川、广东和江苏地区总共222例食管癌病例和433例健康对照的研究中发现XRCC1 26304TT变异基因型在病例组和对照组中的频率分别为12.6％和6.7％，携带该基因型的个体发生食管癌的风险比携带其他基因型者高1.8倍。
2002年，Xing D和Qi J等人对中国人群中433例食管癌病例和524例健康对照的研究中发现XRCC1 Arg194Trp位点Trp/Trp基因型在病例组和对照组中的频率分布存在显著差异，食管癌风险度为2.07(95％ CI 1.34-3.20)。结果显示，XRCC1基因多态性可能是中国人群中食管癌遗传易感因素之一。张薇采用PCR-RELP分析技术检测242例膀胱癌患者及225例人群对照XRCC1基因194位点的多态性。应用非条件Logistic回归模型，调整混杂因素后，分析各基因型与膀胱癌发生的关系以及是否与吸烟因素存在着交互作用。其结果膀胱癌病例组的194Trp/Trp突变基因型频率(11.2％)显著高于对照组(4.0％)。调整年龄、性别、吸烟、高危职业史、膀胱感染和体质指数等因素后，携带194Trp/Trp基因型个体患膀胱癌的风险是194Arg/Arg基因型个体的3.64倍(95％CI 1.60-9.30)。此基因型与吸烟对增加膀胱癌发病风险无明显交互作用。去除了吸烟的混杂效应后，194Trp/Trp基因型个体患膀胱癌的危险性是其它基因型个体的3.16倍(95％CI 1.45-6.88)。结论XRCC1基因194Trp/Trp突变基因型增加膀胱癌发病风险，与吸烟无交互作用。
2、rs25487 2001年，Divine KK和Gilliland FD等对西班牙人和非西班牙白人进行研究，通过调整年龄、种族和吸烟后，具有399Gln/Gln基因型者患肺腺癌的危险性增加，OR值为2.45(95％CI1.1～5.8，P＝0.03)。以上研究表明，个体XRCC1多态位点是否有突变以及携带各突变等位基因的数目不同都可能影响肺癌的易感性。Park JY等人在一项对于韩国人群的肺癌病例对照研究中，针对192个肺癌病人和135个健康人做出了分析，发现XRCC1上399位氨基酸处Gln单倍型的存在会增加鳞癌的发病风险(OR＝1.77，95％CI＝1.06-2.93)，带有Gln/Gln基因型的携带者来说，肺癌的发病风险更高(OR＝3.26，95％CI＝1.17-9.15)。当将病例组按照吸烟量分为≥40包/年和≤40包/年两组时，Gln单倍型仅仅在≤40包/年组中增加肺癌发病风险(Arg/Gln校正OR＝1.48，95％CI＝0.78-2.8；Gln/Gln校正OR＝5.75，95％CI＝1.46-22.69)。该研究提示在吸烟量较少的鳞癌发病中，XRCC1的399氨基酸编码位点可能是一个重要的遗传影响因素。在国内，张文娟等人对郑州大学第一、二附属医院和河南胸科医院的149例河南汉族肺癌病例和157例正常人对照进行研究发现肺癌患者中，XRCC1 194Trp变异基因型频率为12.8％，高于对照组6.4％(P＜0.05)；此种基因型个体发生肺癌的风险是其他基因型的2.0倍(调整OR＝1.6，95％CI＝0.57～4.47)。399Gln基因型频率在病例组中为10.7％，高于对照组8.3％(P＜0.05)；经性别、年龄和吸烟状况调整，此基因个体发生肺癌的风险是其他基因型的2.1倍(95％CI＝0.73～6.15)。
XRCC1基因这两个多态位点之间没有明显的联合作用，但基因型均与吸烟之间有联合作用而增高肺癌风险。李鸣川等人对中国医科大学附属医院和辽宁省肿瘤医院的126例汉族女性肺癌手术病例和157例正常人对照进行研究发现，与携带399Arg/Arg基因型者比较，携带399Gln/Gln基因型者患肺腺癌的风险是其8.695倍(95％CI为3.343～22.614)。携带等位基因399Gln又有油烟暴露的个体患肺腺癌的风险明显增高，校正的比值比为5.21(95％CI为1.85～14.70，P＜0.001)。结论XRCC1基因Arg399Gln多态性可能是非吸烟女性肺腺癌的遗传易感因素。
三、切除修复复合物2(ERCC2) 切除修复复合物2(ERCC2)，位于13号染色体19q13.3位置，共有23个外显子。基因全长19.0kb，mRNA全长2355bp，编码含761个氨基酸的蛋白。核苷酸切除修复通路是几条DNA损伤修复通路之一。由ERCC2编码的蛋白参与转录偶联的核苷酸切除修复，并且是基本转录因子复合物BTF2/TFIIH的一个组成成分。该蛋白具有ATP依赖性的DNA解旋活性，并且属于RAD3/XPD解旋酶亚家族。ERCC2基因的突变或者失活可能导致的疾病包括癌症、着色性干皮病、毛发营养不良、柯凯因氏综合症等。ERCC2在体内最主要参与的通路是NER(NucleotideExcision Repair)通路。
rs13181是位于第19号染色体ERCC2基因第23号外显子段Lys751Gln的G/T多态。世界人群中的频率约为G∶T＝0.202∶0.798，杂合度0.322。目前的多项研究表明，Lys751Gln的氨基酸替代位于ERCC2蛋白C-末端部，这个位点的多态性与肺癌、膀胱癌、乳腺癌、皮肤癌等疾病有关。rs1799793是位于第19号染色体ERCC2基因第10号外显子段Asp312Asn的G/A多态。世界人群中的频率约为G∶A＝0.778∶0.222。目前的多项研究表明，该位点的多态会导致ERCC2参与构成的转录因子复合物的性能发生弱化，从而使得对DNA损伤修复的能力下降，转录因子的能力也同时发生下降，导致一系列诸如肺癌，前列腺癌等疾病的发生。
在关联性分析研究方面，国内外学者对于上述两个位点的研究成果主要有 1、rs13181 2002年，Hou SM和Falt S等人对瑞典人群中185例肺癌病例和162例健康最招的研究中发现70岁以下的在非吸烟人群，携带ERCC2Lys/Gln和Gln/Gln基因型的肺癌风险度为OR＝3.2，95％CI＝1.3-8.0。2004年，Harms C和SalamaSA等人对110例原发性肺癌病例和119吸烟者对照的研究中未发现ERCC2Lys751Gln位点多态性与肺癌存在显著关联性，但是携带ERCC2 Lys/Gln和Gln/Gln基因型的个体有显著的染色体异常(P＜0.05)。Popanda等进行的463名肺癌病例460名医院非肿瘤对照的病例2对照研究结显示，751Gln基因型的个体患肺癌的险性升高(OR＝1.39，95％CI＝0.90-2.14)。
2003年，邢德印等人对383人正常对照，肺癌患者351例，食管癌患者325例的研究发现吸烟剂量＞＝29包每年的ERCC2 751Gln携带者患肺鳞癌的危险度(OR)为10.74(95％CI 4.51-25.57)。2003年，Liang G和Xing D等人对中国人群中1006例原发性肺癌病例和1020例健康对照的研究中发现与携带ERCC2 Lys/Lys基因型的个体相比，携带ERCC2 Gln/Gln基因型的个体肺癌发生危险度为OR＝2.71，95％CI＝1.01-7.24。Yu等对135名食管鳞癌患者和15名对照的研究结果显示，XPD 751Gln/Gln基因型个体患食管鳞癌的危险性升高(OR＝6.71，95％CI＝1.90-23.73)；在吸烟者中，XPD 751Gln/Gln基因型比751Lys/Lys基因型者患食管鳞癌的危险性增加8倍(OR＝8.42，95％CI＝1.02-69.58)。
2、rs1799793 Zhou W等人在高加索人群中做的1000多对肺癌和正常人的Case-control研究显示，Asp312Asn多态位点的Asn/Asn基因型携带者患肺癌的风险对Asp/Asp携带者患肺癌风险的OR为1.47(95％CI，1.1-2.0)。此外基因和环境互作的分析结果发现Asp312Asn位点与环境有比较强的相互作用效应。Hou SM等人的对瑞典人群的肺癌Case-control研究中发现，Asp312Asn位点上的突变型主要影响了非抽烟人群的肺癌发生率。在小于70岁的非吸烟人群中为OR＝2.6，(95％(CI)＝1.1-6.5)。2003年，Liang G和Xing D等人对中国人群中1006例原发性肺癌病例和1020例健康对照的研究中发现ERCC2 Asp312Asn位点Ash/Asn基因型携带者与Asp/Asp基因型携带者相比的肺癌发生危险度为(adjusted OR＝10.33，95％ CI＝1.29-82.50)。
2003年，Xing DY和Qi J等人对中国人群中351例肺癌病例和383例健康对照的研究中发现ERCC2 Asp312Asn位点Asp/Asn和Asn/Asn基因型携带者与Asp/Asp基因型携带者相比，患肺鳞癌的风险度为(OR 1.80；95％CI1.10-2.93)；但是在肺腺癌病例中未发现携带Asp/Asn和Asn/Asn基因型的风险度。结果显示，ERCC2 Asp312Asn位点多态性是中国人群中肺鳞癌遗传易感因素之一。Hu Z等人的对这一位点进行了Meta分析，验证了Asn是肺癌发生的风险因子。
本发明所需检测的DNA可以利用口腔粘膜上皮细胞进行抽提获得，采用口腔粘膜上皮细胞采样方法和器材进行样本采集，样本的DNA抽提利用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提并进行DNA浓度和纯度的测定。
本发明5个位点的基因分型可以采用TaqMa
-MGB技术对这些位点进行基因分型。经重复实验验证，基因分型的准确率达到了99％以上，重复性达到了100％。除此之外，基因测序等技术也可以作为备选的基因分型手段。
本发明的优点是 1.可在基因损伤发生前就采取干预措施，从而避免基因损伤，从而降低与基因损伤相关的如肿瘤疾病的发病率和死亡率； 2.从分子机理上进行肿瘤发病机理的分析，可用于肿瘤分子流行病学调查和肿瘤防治措施的制定。
图1为即多聚ADP核糖转移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala示意图； 图2为人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp示意图； 图3为人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln示意图； 图4为切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln示意图； 图5为切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp示意图。
具体实施例方式 以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 一种DNA损伤修复能力遗传风险评估的方法为 步骤1.检测的样品类型与采样方法 用采样拭在26被测者口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮45次，以保证采集到足量的细胞样本； 步骤2.基因组DNA的抽提方法 采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时，共抽提26个被测者样本，并用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测； 步骤3荧光定量PCR反应 将每一个被测者样本分别放入5个反应孔，同时检测5个位点，即多聚ADP核糖转移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp；26个被测者样本就有130个反应孔，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔； 每一个反应孔Ash312Asp SNP位点的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan
-MGB技术，进行检测试剂合成； 在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman
MGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl2溶液、0.02μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物1和2各0.225μl、20μM的反义引物1和2各0.225μl、10μM的荧光探针1和2各0.25μl，去离子水4.98μl；采用5个位点的正向引物、反向引物、VIC荧光探针和FAM荧光探针工具进行检测； 本发明5个位点的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan
-MGB技术，进行检测试剂合成。
将131个反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟检测，经重复实验验证，基因分型的准确率达到了99％以上，重复性达到了100％。反应结束后取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，并自动将26个被测者样本检测5个点位的数据对号入座到5个图中，同时生成5张图，即图1为多聚ADP核糖转移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala图、图2为人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp图、图3为人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln图、图4为切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln图、图5为切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp图； 采用仪器为ABI Prism
7900型荧光定量PCR仪，检出率可达99％以上，可重复性达到100％。每小时可进行10000个SNP多态性终点检测分析，可满足从中通量到高通量的SNP多态性实验的需求。
步骤4SNP基因型分析 将ABI7900型荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的5个表和NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；(1)、多聚ADP核糖转移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala 在检测结果图1中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.4-0.5、Y坐标轴0.2-0.4区域为空白对照、X坐标轴0.2-0.4、Y坐标轴1.0-1.3区域为TT基因型、X坐标轴0.7-0.9、Y坐标轴0.7-1.0区域为TC基因型、X坐标轴0.8-0.9、Y坐标轴0.3-0.4区域为CC基因型，其中，CC为风险基因型，携带风险基因型时酶的活性降低，导致多种癌症的发生风险增加； (2)、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp 在检测结果图2中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.1-0.2、Y坐标轴0.2-0.3区域为空白对照、X坐标轴0.1-0.2、Y坐标轴0.9-1.1区域为CC基因型、X坐标轴0.3-0.5、Y坐标轴0.75-0.95区域为TC基因型、X坐标轴0.5-0.6、Y坐标轴0.5-0.6区域为TT基因型，其中，TT为风险基因型，携带风险基因型时XRCC1活性降低，导致个体的DNA修复能力下降，癌症的发生风险增加； (3)、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln 在检测结果图3中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.1-0.2、Y坐标轴0.3-0.4区域为空白对照、X坐标轴0.1-0.2、Y坐标轴2.1-2.2区域为TT基因型、X坐标轴0.4-0.6、Y坐标轴1.1-1.7区域为TC基因型、X坐标轴0.8-1.0、Y坐标轴0.4-0.5区域为CC基因型，其中，TT为风险基因型，携带风险基因型时个体的DNA修复能力下降，癌症的发生风险增加； (4)、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln 在检测结果图4中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.0-0.1、Y坐标轴0.2-0.3区域为空白对照、X坐标轴0.05-0.15Y坐标轴1.5-2.0区域为AA基因型、(该基因型在中国人群中频率很低，附图30个样本中未检出该基因型)、X坐标轴0.7-0.9、Y坐标轴1.4-1.6区域为AG基因型、X坐标轴0.7-1.2、Y坐标轴0.3-0.5区域为GG基因型，其中，AA和AG为风险基因型，携带风险基因型时基本转录因子复合物不能正确识别DNA损伤位点，DNA上致癌损伤积累，癌症的发生风险增加； (5)、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp 在检测结果图5中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴O.1-0.2、Y坐标轴O.4-0.5区域为空白对照、X坐标轴0.0-0.1、Y坐标轴2.3-2.8区域为TT基因型、X坐标轴0.8-0.1、Y坐标轴2.2-2.5区域为GT基因型、X坐标轴0.8-1.0、Y坐标轴0.4-0.5区域为GG基因型(该基因型在中国人群中频率很低，附图30个样本中未检出该基因型)，其中，GT和GG为风险基因型，携带风险基因型时ERCC2参与构成的转录因子复合物性能弱化，癌症的发生风险增加； 每一个被测者的5个点落在5个表上哪个区域，即可知道被测者DNA损伤修复能力的遗传风险结果； 步骤5，根据检测结果给予个性化指导建议，主要有以下几点 一、避免过多、过强的紫外线照射阳光中适量的紫外线照射对人体有益，但过多、过强的紫外线，尤其是紫外线灯等的照射，会引起胸腺嘧啶二聚体的形成，还可以引起DNA之间的交联，DNA与蛋白质的交联，甚至DNA链的断裂。紫外线对人的伤害主要限于皮肤； 二、避免电离辐射引起的基因损伤电离辐射可导致DNA分子的多种变化，如碱基变化、脱氧核糖变化、DNA键断裂、DNA链交联等。这些辐射可能会引起癌症的发生。电离辐射广泛存在于人们的生活环境中，包括天然辐射和人造辐射。在日常生活中，应注意尽量避免接触含有放射性物质的东西，如夜光手表等； 三、注意防止烷化剂引起的DNA损伤烷化剂种类很多，如芥子气、硫酸二乙酯等。很多烷化剂都是致癌物。现在工业中大量使用烷化剂，应尽量避免接触。烷化剂引起的损伤有碱基烷基化、碱基脱落、DNA断链、DNA链交联等； 四、戒烟酒并注意营养补充吸烟和饮酒会抑制DNA的修复，缺乏叶酸会增加DNA双链打开的可能性，而这不容易修复，往往造成DNA永久的损伤。在日常生活中，应注意多补充富含各种营养元素的新鲜水果蔬菜及菜花、酵母等富含叶酸的食物。
位点序列的确定
根据文献提供的位点序列信息和rs号，在NCBI SNP数据库中进行检索比对，获得以上5个位点的参考序列如下
1.PARP1 Val762Ala SEQ ID NO1rs1136410
CCTTGTTAAC ATTCCAGAAA GTCCTTATGA GCTCTCAATA TGTGCAGCAG 50
GTAACAGGCT GGCCCTGACC AGCAGGAGGG TTTGCCATTC ACTGTGTTGG 100
ACCTTCTCTG CATGTAGGTT TTCTCTGCCA CCTGGGTGAG TCTGTCTCAT 150
TCACCATGAT ACCTAAGTCG GGGGCTTTCT TTTGCTCCTC CAGGCCAAGG 200
C/T SNP
GGAAATGCTT GACAACCTGC TGGACATCGA GGTGGCCTAC AGTCTGCTCA 250
GGGGAGGGTC TGATGATAGC AGCAAGGATC CCATCGATGT CAACTATGAG 300
AAGCTCAAAA CTGACATTAA GGTAACAGGG TCAGGCCTTC CTCAAGCATC 350
TTAACCTCTC ATCCTGAGAG CAGCGGTCCC AAACTTCCAT GTGTGTTAGG 400
ATCTCCTGGA AAGCTTGTTA AAACACAGGT GGCTGGCGCC CAATAATTCA 450
CTTTTCTAAC AAGTTCCCGG ACATTGCTGC TGGTGGTCCT TTGAGAACCT 500
TTGGGCGTTT CACGTGTAGA TAATGCACCT TGTTT 535
2.XRCC1 Arg194Trp SEQ ID NO2rs1799782
CCCTTTGGCT TGAGTTTTGT ACGGTTTCAT AGCCCCCCAG ACAAAGATGA 50
GGCAGAGGCC CCGTCCCAGG TAAGCTGTAC CTGTCACTCC CCATGGCCTT 100
CTCCCTGCCT CTCCACCCCC ACCTGCCAGC AGCCCACCTA TAATACTGAC 150
CTTGCGGGAC CTTAGAAGGT GACAGTGACC AAGCTTGGCC AGTTCCGTGT 200
17
GAAGGAGGAG GATGAGAGCG CCAACTCTCT GAGGCCGGGG 240
GCTCTCTTCT TCAGC255
C/T SNP
GGATCAACAA GACATCCCCA GGTGAGCTCG GACAACGTGG GTCCTGAGTG 305
AGTAGGGTTG AGACCTAGAC TCGTGGGTCT GAGGGTAGAG GGGGCTGGGG 355
CTCAGATTCC TGGGTCTGAG GGAGGAGGGT AGTGGAGTCC TGGACTCCTG 405
GGTCTCAGGG TGGAGGAAGG TGGGCCTGGC CTCTTGTGTC CTGAGGGTTG 455
AGAGGTCTGG AGGCTGGGAC TCCTGGATCA CTGGTGGGTT TTGGCAACAA 505
TATTC
3.XRCC1 Arg399Gln SEQ ID NO3rs25487
ACCTCTTTTT GTTTCTCCCA CCTCAATCTC ATGATCTGTC TGTCTGTCTG 50
TCTCTCTCTC TCTCTGTCTG TCTCCCCTGT CTCATTCCCC TTTGCCCCTC 100
AGATCACACC TAACTGGCAT CTTCACTTCT GCCCCCCACC AGCTGTGCCT 150
TTGCCAACAC CCCCAAGTAC AGCCAGGTCC TAGGCCTGGG AGGCCGCATC 200
GTGCGTAAGG AGTGGGTGCT GGACTGTCAC CGCATGCGTC GGCGGCTGCC 250
CTCCC 255
G/A SNP
GAGGTAAGGC CTCACACGCC AACCCTGCTC CTTATCCTGT GCTGGGCAAT 305
GCCAGGAATC TGGAGGGGAG TCAGACTGGG GCCTGCCAGC GGAGAACACA 355
GGTGGTCCCA GCCCAGAGCC AGCAGACTAC TGAGAGGAGC GGGGCAGGGG 405
CTGGGGTACT CCAGATGAGG GAAGGAGGAC CTGCCTGGGA GGTCACAGAG 455
GGCTCTGTGA AGCCTGCTTA TCAGAAAAGG CTGGAGGAGC AGTTTGTGCA 505
AAAAC 510
4.ERCC2 Lys751Gln SEQ ID NO4rs13181
GGATGGGCTG GTGGGGTGAG AGGGGGTCTA TCATCTCCTG GCCCCCCCTT 50
GCCTCTGGGT ACCTGGTGGA TAGCTGCCTT CTCCTGCGAT TAAAGGCTGT 100
GGACGTGACA GTGAGAAATG TCACCTGACT TCATAAGACC TTCTAGCACC 150
ACCGCCGCTG GGAACCAGGG CCAGGCAAGA CTCAGGAGTC ACCAGGAACC 200
GTTTATGGCC CCACCCGCCC CACTCAGAGC TGCTGAGCAA 240
TCTGCTCTAT CCTCT255
G/T SNP
CAGCGTCTCC TCTGATTCTA GCTGCTCCAG GCTGAGCAGG GACAGGCCCA 305
GCTGATCCTC CTGCAGAGAA CAGAGGAAAG GGAGAGGGGG GCACTGTTGG 355
GCAGGGGCCC AGGCAGCTGC TGCACTTCCC CAACCACCCC CCCGAATGGC 405
CAGTAGGGAC AGGATGTTTG AATGAATTTG GAGATGTCCG TATAATCCAG 455
AGCGGGCCAT CCCTGTCAAC ATAAGATGGG GCTGAGGGAG GAGCCAGCTA 505
GGGAG 510
5.ERCC2 Asp312Asn SEQ ID NO5rs1799793
ACCTCACCCG CCGGACCCTT GACCGGTGCC AGGGCAACCT GGAGACCCTG 50
CAGAAGACGG TGCTCAGGTG GGGCCGGGGA CGTCTGGCGG TGGTGCCCGC 100
CCTGCCCCTG GGACCCTGGC CCCTGTCTGA CTTGTCCCCA GGGTTGCCAG 150
CCCCCTCCCA GCCCCAGCTC ATCTCTCCGC AGGATCAAAG AGACAGACGA 200
GCAGCGCCTG CGGGACGAGT ACCGGCGTCT GGTGGAGGGG CTGCGGGAGG 250
CCAGCGCCGC CCGGGAGACG GACGCCCACC TGGCCAACCC CGTGCTGCCC 300
A/G SNP
ACGAAGTGCT GCAGGGTGAG CCCCGACCCC CCGCTGCCCC CCAGTCCCTT 350
TCCCGCCTCC CCGTCGCCGC TGATAGCGTC TCCTCGCAGA GGCAGTGCCT 400
GGCTCCATCC GCACGGCCGA GCATTTCCTG GGCTTCCTGA GGCGGCTGCT 450
GGAGTACGTG AAGTGGCGGC TGCGTGTGCA GCATGTGGTG CAGGAGAGCC 500
CGCCCGCCTT CCTGAGCGGC CTGGCCCAGC GCGTGTGCAT CCAGCGCAAG 550
CCCCTCAGGT GCGGCCCCAG ACAGCGCGCG GGGTGGGGGC CCGGCAGGTC 600
权利要求
1.一种DNA损伤修复能力遗传风险评估的方法，其特征在于，其方法为
步骤1.检测的样品类型与采样方法
用采样拭在20-30被测者口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；
步骤2.基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时-2.5小时，共抽提20-30个被测者样本，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入5个反应孔，同时检测5个位点，即多聚ADP核糖转移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp；20-30个被测者样本就有100-150个反应孔，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan
-MGB技术，进行检测试剂合成；
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman
MGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl2溶液、0.02μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、去离子水4.98μl、5个位点分别采用不同的正向引物(20μM，0.225μl)、反向引物(20μM，0.225μl)、VIC荧光探针(10μM，0.25μl)和FAM荧光探针(10μM，0.25μl)工具进行检测(详见下表)；
将101-151个反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，并自动将20-30个被测者样本检测5个点位的数据对号入座到5个图中，同时生成5张图，即多聚ADP核糖转移酶(PARP1)SEQID NO1图；Val762Ala、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQID NO2图；Arg194Trp、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO3图；Arg399Gln、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO4图；Lys7516ln、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO5步骤4SNP基因型分析
将ABI7900型荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的5个表和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；
(1)、多聚ADP核糖转移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala
在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.4-0.5、Y坐标轴0.2-0.4区域为空白对照、X坐标轴0.2-0.4、Y坐标轴1.0-1.3区域为TT基因型、X坐标轴0.7-0.9、Y坐标轴0.7-1.0区域为TC基因型、X坐标轴0.8-0.9、Y坐标轴0.3-0.4区域为CC基因型，其中，CC为风险基因型，携带风险基因型时酶的活性降低，导致多种癌症的发生风险增加；
(2)、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp
在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.1-0.2、Y坐标轴0.2-0.3区域为空白对照、X坐标轴0.1-0.2、Y坐标轴0.9-1.1区域为CC基因型、X坐标轴0.3-0.5、Y坐标轴0.75-0.95区域为TC基因型、X坐标轴0.5-0.6、Y坐标轴0.5-0.6区域为TT基因型，其中，TT为风险基因型，携带风险基因型时XRCC1活性降低，导致个体的DNA修复能力下降，癌症的发生风险增加；
(3)、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln
在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.1-0.2、Y坐标轴0.3-0.4区域为空白对照、X坐标轴0.1-0.2、Y坐标轴2.1-2.2区域为TT基因型、X坐标轴0.4-0.6、Y坐标轴1.1-1.7区域为TC基因型、X坐标轴0.8-1.0、Y坐标轴0.4-0.5区域为CC基因型，其中，TT为风险基因型，携带风险基因型时个体的DNA修复能力下降，癌症的发生风险增加；
(4)、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys7516ln
在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.0-0.1、Y坐标轴0.2-0.3区域为空白对照、X坐标轴0.05-0.15Y坐标轴1.5-2.0区域为AA基因型、X坐标轴0.7-0.9、Y坐标轴1.4-1.6区域为AG基因型、X坐标轴0.7-1.2、Y坐标轴0.3-0.5区域为GG基因型，其中，AA和AG为风险基因型，携带风险基因型时基本转录因子复合物不能正确识别DNA损伤位点，DNA上致癌损伤积累，癌症的发生风险增加；
(5)、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp
在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.1-0.2、Y坐标轴0.4-0.5区域为空白对照、X坐标轴0.0-0.1、Y坐标轴2.3-2.8区域为TT基因型、X坐标轴0.8-0.1、Y坐标轴2.2-2.5区域为GT基因型、X坐标轴0.8-1.0、Y坐标轴0.4-0.5区域为GG基因型，其中，GT和GG为风险基因型，携带风险基因型时ERCC2参与构成的转录因子复合物性能弱化，癌症的发生风险增加；
每一个被测者的5个点落在5个表上哪个区域，即可知道被测者DNA损伤修复能力的遗传风险；
步骤5，根据检测结果给予个性化指导建议，主要有以下几点
一、避免过多、过强的紫外线照射阳光中适量的紫外线照射对人体有益，但过多、过强的紫外线，尤其是紫外线灯等的照射，会引起胸腺嘧啶二聚体的形成，还可以引起DNA之间的交联，DNA与蛋白质的交联，甚至DNA链的断裂。紫外线对人的伤害主要限于皮肤；
二、避免电离辐射引起的基因损伤电离辐射可导致DNA分子的多种变化，如碱基变化、脱氧核糖变化、DNA键断裂、DNA链交联等。这些辐射可能会引起癌症的发生。电离辐射广泛存在于人们的生活环境中，包括天然辐射和人造辐射。在日常生活中，应注意尽量避免接触含有放射性物质的东西，如夜光手表等；
三、注意防止烷化剂引起的DNA损伤烷化剂种类很多，如芥子气、硫酸二乙酯等。很多烷化剂都是致癌物。现在工业中大量使用烷化剂，应尽量避免接触。烷化剂引起的损伤有碱基烷基化、碱基脱落、DNA断链、DNA链交联等；
四、戒烟酒并注意营养补充吸烟和饮酒会抑制DNA的修复，缺乏叶酸会增加DNA双链打开的可能性，而这不容易修复，往往造成DNA永久的损伤。在日常生活中，应注意多补充富含各种营养元素的新鲜水果蔬菜及菜花、酵母等富含叶酸的食物。
全文摘要
本发明公开了一种DNA损伤修复能力遗传风险评估的方法，其特征在于，通过同时检测分析个体的PARP1基因、XRCC1基因、ERCC2基因SNPs位点基因携带型为所有的受检者提供DNA损伤修复能力的遗传风险评估、相关疾病风险规避的个性化健康指导。本发明的优点是可在基因损伤发生前就采取干预措施，从而避免基因损伤，从而降低与基因损伤相关的如肿瘤疾病的发病率和死亡率；从分子机理上进行肿瘤发病机理的分析，可用于肿瘤分子流行病学调查和肿瘤防治措施的制定。
文档编号G01N21/64GK101302562SQ20081004031
公开日2008年11月12日 申请日期2008年7月8日 优先权日2008年7月8日
发明者傅咏南, 校 王, 毛丹丹 申请人:上海中优医药高科技有限公司