专利名称：：一种检测恩诺沙星药物残留的胶体金试纸卡的制作方法
技术领域：
：本发明涉及兽药残留的免疫化学速测
技术领域：
，更具体地涉及一种检测恩诺沙星药物残留的胶体金试纸卡，借助胶体金标记显色的免疫层析反应，快速检测恩诺沙星药物残留。
背景技术：
：恩诺沙星(enrofloxaicn，ENR)药物是近20年来迅速发展起来的一类十分重要的广谱抗生素。在化学结构上，本类药物属于吡酮酸衍生物(pyridonecarboxylicacids,PCAs)。抑制细菌DNA螺旋酶，抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透能力强，抗菌作用是磺胺类的近千倍，可与第三代头孢抗生素相媲美。因化学结构，价格低廉，故在医学上和兽医学中很快取得广泛应用。在兽医临诊和水产养殖中最重要的抗感染药物之一，但由于其耐药性和潜在的致癌性引起广泛的关注。目前恩诺沙星药物残留常用的检测方法有两种。一种是色谱分析，如高效液相色谱法(HPLC)，由于复杂的仪器设备和繁瑣的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。另一种为免疫学方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)，它的缺点是检测时间长，费用较高，不利于在基层单位推广使用。而且，这两种方法都需要专业技术人员进行操作。胶体金免疫层析(gold-immunochromatographyassay,GIGA)是将胶体金作为示踪物应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标金技术。
发明内容本发明的目的在于提供一种敏感度高、操作简单、成本低的恩诺沙星药物残留快速检测试纸卡。本发明的试纸卡包括反应膜、样本垫、结合物释放垫、吸水垫和背衬，在上述反应膜具有包被有恩诺沙星药物-载体蛋白偶联物的测试区和包被有羊抗鼠IgG的质控区，所述结合物释放垫包被有恩诺沙星药物单克隆抗体-胶体金标记物。与常规试纸卡不同的是，本发明试纸卡的结合物释放垫并非完全覆盖在样本垫的下面，而是部分覆盖在样本垫的下面。这样做的好处是可以延长检测结果观察时间，样品垫也可以将检测液体充分吸收与金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。本发明将恩诺沙星-载体蛋白偶联抗原固化于反应膜测试区内，并用胶体金标记恩诺沙星单克隆抗体，通过待测样本中的恩诺沙星药物和包被在反应膜上的恩诺沙星-载体蛋白偶联物共同竞争恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物，根据测试区条颜色深浅或有无红色条带来判断待测样本液中是否含有恩诺沙星残留。检测时，样本溶液滴入试剂卡孔内，当恩诺沙星在样本中浓度低于40ng/ml时，胶体金抗体在层析过程中会被固定在反应膜上的恩诺沙星的偶联物结合，在测试区(T)和质控区(C)内各出现一条红色条带。如果恩诺沙星在样本中浓度高于40ng/ml时，胶体金抗体与样本中的恩诺沙星全部结合，从而在(T)区内因为竟争反应不与恩诺沙星偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗体抗原竟争反应，将会在(T)区与(C)区内出现红色条带。如图2所示。阳性当(C)区显示出红色条带，而(T)区不显色，判为阳性，表示恩诺沙星含量超过40ng/ml，用"+"表示。阴性当(C)区显示出红色条带，(T)区同时显示出红色条带，且(T)带颜色接近或浅于(C)带时，判为阴性，表示恩诺沙星含量小于40ng/ml，用"-"表示。无效当(C)区不显示出红色条带，则无论(T)区显示出红5色条带与否，该试纸卡判为无效。本发明还提供了制备上述试纸卡的方法，其包括步骤1)制备包被恩诺沙星药物单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；2)制备具有包被恩诺沙星药物-载体蛋白偶联物的测试区和包被羊抗鼠IgG的质控区的反应膜；3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本垫、吸水垫和背衬组装成试纸卡。具体地说，其步骤包括(1)将恩诺沙星与载体蛋白偶联，形成恩诺沙星-载体蛋白偶联物；(2)用恩诺沙星-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(3)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体；(4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；(5)将制备的恩诺沙星单克隆抗体加入制备的胶体金中，得到恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物；(6)将结合物释放垫用含0.10.5%酪蛋白的磷酸氢二钾和辚酸二氢钾混合缓冲液浸泡30秒，在37'C烘2h，然后将恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上；(7)将恩诺沙星-人血清白蛋白偶联物包被在反应膜上构成测试区，并将羊抗鼠IgG包被在反应膜上构成质控区，用含0.5%脱脂奶粉的封闭液进行封闭；(8)将样本垫用含0.050.1%人清蛋白、0.5~1%吐温-50的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾混合缓冲液浸泡2h,在37X:烘2h;(9)在背衬上按顺序贴上反应膜、吸水垫、结合物释放垫和样6本垫，将样本垫盖住结合物释放垫。最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装。将样本垫盖住结合物释放垫可以延长检测结果观察时间，可使样本垫将检测液体充分吸收并与金标抗体充分反应，从而减少误差。本发明试纸卡具有灵敏度高、操作简单、检测时间短、储存简单、保质期长成本低等优点，能够现场监控，适合大量样本筛查。图i为本发明检测试纸卡的组装示意图；图2为本发明的检测结果分析示意图。图中1、样本垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、测试区；6、质控区；7、背衬。具体实施例方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入发明的保护范围。实施例1恩诺沙星检测试纸卡的制备1、恩诺沙星-载体蛋白偶联物的合成与鉴定(1)恩诺沙星-人血清蛋白偶联物的合成30mg恩诺沙星用lml二甲基甲酰溶解。冷却至10度，加40ul氯甲酸异丁酯，IO度搅拌反应30分钟。120mgHSA用2ml5Ommol/LNa2C02溶解。10度反应4小时(必要时加NaOH,维持溶液的pH为9.0),然后4度过夜。冷冻干燥，-20°。保存。(2)恩诺沙星-牛血清蛋白的合成取EDC100mg,用pH8.0的1Ommol/LPBS液1.5mL使之充分溶解(I液)。取恩诺沙星40mg,用0.2mol/LNaOH溶液2ml溶液溶解(II液)。取BSA100mg，溶于3mll0mmol/LPBS(pH8.0)液中(in液)。将II液与m液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液(余下0.5ml)。室温下避光搅拌l小时，逐滴加入余下的I液。4度搅拌12小时。静置10小时(4度)。用蒸馏水使之充分透析(约48小时)，冷冻干燥，-2(TC保存。(3)恩诺沙星-载体蛋白偶联物的鉴定将载体蛋白恩诺沙星药物半抗原、恩诺沙星药物-载体蛋白偶联物用pH7.4PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH9PBS调零，用紫外分光光度计在200-800nm波长进行扫描，得到载体蛋白恩诺沙星药物、恩诺沙星药物-载体蛋白偶联物的吸收曲线。并出现不同的吸收曲线，表明恩诺沙星药物与载体蛋白偶联成功。2、恩诺沙星单克隆抗体的制备(1)动物免疫将免疫原注入Balb/c小鼠体内，剂量为50吗/只，使其产生多克隆抗体。(2)细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5:l比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竟争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并意外发现，其中一株效价显著高于其它杂交瘤细胞株，将该杂交瘤细胞株命名为C-1-2，该细胞株已于2007年12月25曰保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京巿朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.2298。(3)细胞冻存和复苏将恩诺沙星的单克隆杂交瘤细胞株C-l-2用冻存液制成lxl()S个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37'C水洛中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的制备与纯化将Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油，剂量为0.4ml/只，7天后腹腔注射恩诺沙星的单克隆杂交瘤细胞株C-l-25xl0S个/只，7天后釆集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20。C环境中保存。3、羊抗鼠抗抗体的制备以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。4、恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物的制备(1)胶体金的制备用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%,置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每100ml0.01。/。的氯金酸加入2ml1%的柠檬酸三钠，继续煮沸，液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期为一个月。(2)恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下，用O.IM碳酸钾调胶体金的pH值至8.2,按12pg/ml抗体胶体金加入恩诺沙星单克隆抗体，继续搅拌混匀30min,加入10。/。BSA至终浓度为1。/。，静置30min。12000rpm、4°C离心30min,弃去上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4。C备用，保存60天。复溶缓冲液含牛血清白蛋白(BSA)0.02~0.1%,吐温-200.05~0.2%，维生素C(Vit-C)0.r/。，0.02MpH9.0的硼酸复溶缓冲液。5、结合物释放垫的包被将结合物释放垫放入含有0.10.5%酪蛋白的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾混合缓冲液浸湿30秒，37'C烘2h备用；用Biodot点膜仪将制备好的恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物均匀包被在结合物释放垫上，每5cm结合物释放垫包被9^tl恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标9记物，真空干燥，真空封装，置4'C备用。6、反应膜的制备将硝酸纤维素膜上分别包被恩诺沙星-载体蛋白偶联物构成测试区和羊抗鼠IgG构成质控区，再用含0.5%的脱脂奶粉的封闭液进行封闭。包被过程用磷酸钾缓冲液(含3%的甲醇)将恩诺沙星-人血清白蛋白(BSA)偶联物稀释至15ng/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜作为测试区，包被量为0.7吗/cm2,测试区靠近结合物释放垫端，距结合物释放垫端约8mm;用0.01M碟酸钾缓冲液(含3%的甲醇)将羊抗鼠IgG抗体稀释到200|Lig/ml，用Biodot点膜仪将其包被于纤维素膜作为质控区，包被量为0.7pg/ml2，质控区靠近吸水垫，距吸水垫约8mm,两线距离58mm。37"C烘干，封装。7、胶体金免疫试纸卡的组装在PVC背衬上按顺序贴硝酸纤维素膜、吸水垫、结合物释放垫，最后贴样本垫，将样本垫盖住结合物释放垫。切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装。原包装应储存于1825°C，有效期一年。本发明的试纸卡将样品垫覆盖在结合物释放垫二分之一处，可以延长检测结果观察时间，样品垫也可以将检测液体充分吸收与金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。实施例2样本中恩诺沙星残留的检测1、样本前处理(1)动物组织前处理(鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝、鱼、虾)称取1.0士0.05g匀质过的组织样本于离心管中，加入4ml去离子水，盖紧瓶盖。将装有样本的离心管在微沸的水洛锅中水浴10min,吸取三滴以上溶液倒1.5ml的离心管中。如有明显黄色浑浊请离心，然后使用上清液作为待测样本溶液。(2)血清样本的前处理将少量血清样本放于离心管中，加入4ml去离子水，混合后作为待测样本溶液。2、用本发明的试纸卡进行检测用滴管向试剂卡孔内滴加3滴样本，58min后观察结果。超过10min，则样本检测判读结果无效。3、检测结果分析恩诺沙星在样本中浓度高于40ng/ml时，胶体金抗体与恩诺沙星全部结合，从而在(T)区因为竟争反应不会与恩诺沙星偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗体抗原竞争反应，将会在(T)区与(C)区内出现红色条带。阳性当(C)区显示出红色条带，而(T)区不显色时，判为阳性，用"+"表示。阴性当(C)区显示出红色条带，(T)区同时显示出红色条带时，且(T)区颜色接近或浅于(C)区时，判为阴性，用"-"表示。无效当(C)区不显示出红色条带，则无论(T)区显示出红色条带与否，该试纸卡判为无效。如图2所示。实施例3样本检测实例取已知恩诺沙星药物残留浓度大于40ng/g的猪肉、鸡肉、猪肝、虫下、血清样本各20份和各种阴性样本各20份，每个样本重复检测2次，计算其阴阳性率。结果如表1表5所示。表l猪肉样本阴阳性率检测样本编号样本l样本2样本3样本4样本5检测结果样本编号样本6样本7样本8样本9样本10阴性检测样本结果11样本编号样本11样本12样本13样本14样本15检测结果样本编号样本16样本17样本18样本19样本20检测结果样本编号样本l样本2样本3样本4样本5检测结果++++阳性样本编号样本6样本7样本8样本9样本10样本(>10检测结果++++++ng/g)样本编号样本11样本12样本13样本14样本15检测结果++++++样本编号样本16样本17样本18样本19样本20检测结果++++++表2鸡肉样本阴阳性率检测样本编号样本l样本2样本3样本4样本5检测结果阴性样本编号样本6样本7样本8样本9样本10样本检测结果-一-一——_-一样本编号样本11样本12样本13样本14样本15检测结果----+——-一-一样本编号样本16样本17样本18样本19样本20检测结果样本编号样本l样本2样本3样本4样本5<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表4虾样本阴阳性率检测<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表5血清样本阴阳性率检测<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>结果表明猪肉、鸡肉、猪肝、虾、血清20份阳性样本和20份各自的阴性样本，每个样本重复检测2次，猪肉样本中其阴阳性符合率均为100%，鸡肉样本中假阳性率8%以下，其阳性符合率均为100%，阴性符合率均为92%以上。猪肝样本中其阴阳性符合率均为100%，虾样本中假阳性率10%以下，其阳性符合率均为100%,阴性符合率均为90%以上。血清样本中假阳性率13%以下，其阳性符合率均为100%,阴性符合率均为87%以上。说明本发明的检测试纸卡完全可以作为常规方法用于巿场上对恩诺沙星残留的快速检测。实验例1敏感性和特异性试验特异性试验本发明检测试纸卡的标准品阳性检测浓度为10ng/ml,检测恩诺沙星药物及阴性标准品，同样将依诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、达氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、噁喹酸、氟甲喹、麻保沙星、氨氟沙星、双氟沙星、沙拉沙星按5，6，7,8,9,10、20、40、60、120、500、1000、5000、25000ng/ml进行稀释，用本发明的试纸卡进行检测，结果为依诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、达氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、噁喹酸、氟甲喹、麻保沙星、氨氟沙星、双氟沙星、沙拉沙星、双氟沙星、沙拉沙星均在20000、50000ng/ml浓度时测试区不显，通过计算可得出交叉反应率，全都小于1%。如表6所示。交叉反应越大，说明此试纸卡对恩诺沙星检测的特异性就越好。表6本发明试纸卡特异性试验结果药物交叉反应率(％)恩诺沙星100%依诺沙星小于1%诺氟沙星小于1%氧氟沙星小于1%达氟沙星小于1%培氟沙星小于1%环丙沙星小于1%洛美沙星小于1%噁喹酸小于1%氟甲喹小于1%麻保沙星小于1%氨氟沙星小于1%双氟沙星小于1%沙拉沙星小于1%1权利要求1、一种检测恩诺沙星药物的胶体金试纸卡，包括反应膜、样本垫、结合物释放垫、吸水垫和背衬，其特征在于所述反应膜上具有包被有恩诺沙星药物-载体蛋白偶联物的测试区和包被有羊抗鼠IgG的质控区，所述结合物释放垫包被有恩诺沙星药物单克隆抗体-胶体金标记物。2、如权利要求1所述的胶体金试纸卡，其特征在于所述恩诺沙星药物-载体蛋白偶联物由恩诺沙星药物与载体蛋白偶联得到。3、如权利要求1或2所述的胶体金试纸卡，其特征在于所述恩诺沙星药物单克隆抗体-胶体金标记物中的恩诺沙星药物单克隆抗体是以恩诺沙星药物与载体蛋白偶联得到偶联复合物作为免疫原制备获得。4、如权利要求1或2所述的胶体金试纸卡，其特征在于所述恩诺沙星药物单克隆抗体-胶体金标记物中的恩诺沙星药物单克隆抗体是由杂交瘤细胞株C-l-2CGMCCNo.2298分泌获得。5、如权利要求1或2所述的胶体金试纸卡，其特征在于，所述结合物释放垫的部分区域被覆盖于样本垫之下。6、权利要求15任一项所述胶体金试纸卡在检测恩诺沙星药物中的应用。7、一种制备权利要求15任一项所述胶体金试纸卡的方法，其包括步骤1)制备包被恩诺沙星药物单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；2)制备具有包被恩诺沙星药物-载体蛋白偶联物的测试区和包被羊抗鼠IgG的质控区的反应膜；3)将l)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本垫、吸水垫和背衬组装成试纸卡。8、一种检测样本中恩诺沙星药物残留的方法，其特征在于包括1)样本前处理；2)用权利要求15任意一项所述的试纸卡进行检测；3)分析检测结果。9、一种分泌恩诺沙星药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株C-l-2CGMCCNo.2298。全文摘要本发明提供了一种检测恩诺沙星药物的胶体金免疫试纸卡，包括反应膜、样本垫、结合物释放垫、吸水垫和背衬，在所述反应膜上具有包被有恩诺沙星药物-载体蛋白偶联物的测试区和包被有羊抗鼠IgG的质控区，所述结合物释放垫包被有恩诺沙星药物单克隆抗体-胶体金标记物。本发明还提供了一种应用上述试纸卡检测恩诺沙星药物的方法，它包括步骤首先进行样本前处理，然后用试纸卡进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的试纸卡可用于检测动物源性食品如猪肉、猪肝、鸡肉、鸡肝、血清、鱼、虾中的恩诺沙星药物残留量，其操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低，能够现场监控，满足大量样本筛查的需要。文档编号G01N33/558GK101498726SQ200810057198公开日2009年8月5日申请日期2008年1月30日优先权日2008年1月30日发明者万宇平,何方洋,冯才伟,冯才茂,吴小平,亮朱,汪善良,沈建忠,赵正苗申请人:北京望尔生物技术有限公司;北京望尔康泰生物技术有限公司