专利名称：一种半定量检测ngf含量的胶体金试纸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种胶体金试纸及其制备方法，具体地涉及一种半定量检测NGF含量的 胶体金试纸及其制备方法。
背景技术：
对神经生长因子(NGF)的检测目前主要采用高效液相色谱法(HPLC )和酶联免 疫吸附测定法(ELISA)。 HPLC法灵敏、准确，检测下限可达0.25ng/mL,但由于这种方 法需要HPLC等贵重仪器、样品前处理繁琐、分析速度慢，需要几小时至几十小时、检 测样品量少，需受过专门训练的人员才能操作，检测费用高，对批量样品的检测难度大， 应用面窄。ELISA法是目前研究较多的NGF检测方法，具有灵敏度髙，检测量大，样品 前处理简单，比仪器分析时间短、成本低，检测下限可达0.09ng/mL。欧美多家公司己有 ELISA试剂盒投放市场，如CHEMICON公司的试剂盒销往全球。但该方法仍需使用酶标 仪等设备，分析时间1 3小时，难以适用于现场检测。
现有用于免疫诊断的试纸条(TestStrip)在免疫诊断试剂中最为方便和快捷。但目前 的这些试纸条主要用于胶体金的定性检测，检测结果只能判定病原物的有无而不能判定其 含量是否髙于某种诊断标准。而在实际应用中，判断某种待检出物的含量多少对于临床诊 断来说更具参考价值。对于需要检测传染疾病病原的感染程度、内分泌的失调与否、肿瘤 标志物是否高于正常水平及违禁药物摄取量是否超标来说，定性类的胶体金免疫诊断试纸 无法提供量化的检测结果。
发明内容
本发明的目的是提供一种不需要特定仪器设备辅助的、能迅速判定NGF含量是否达 标并能对检测结果进行半定量水平检测，即能检测出高于、等于或低于标准对比样品的浓 度的胶体金试纸，以解决现有技术中的上述问题。
本发明的另一 目的是提供一种上述半定量检测NGF含量的胶体金试纸的制备方法。
本发明提供的技术方案如下
一种半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸，由下而上分为第一区样品吸收区、第二区 固相化胶体金标记NGF多克隆抗体区、间隔窄缝对称分布在左右两侧的第三区固相化的 另一种NGF多克隆抗体区和第四区固相化NGF区、第五区吸水区，其特征在于第四区 固相化NGF区从下而上依次由一条杂信号去除条带和2 7条递减浓度的NGF条带组成。垂直设置在第三区和第四区之间的窄缝平行于试纸侧边，将试纸分为独立、对称的两 个部分。其中，第三区作为样品的检测区，第四区作为标准浓度显色对照的半定量区。第 四区固相化NGF区采用了抗原抗体反映的平衡性置换原理不同于以往的多条检测带使用 抗体捕捉的技术,可判定待测NGF溶液的多个浓度区间,提供更有价值的NGF浓度信息。 杂信号去除条带也可以看作质控条带，由5ng/mL-10ng/mLNGF固化条带组成，2 7条 递减浓度的NGF条带为半定量检测条带，其浓度的递减方式不设任何限制，既可以是等 差递减方式，也可以是不等差递减方式。其最大浓度不设上限，可根据需要自行调整。
前述半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸中，第三区和第四区设置在层析介质上。
前述半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸中，所述层析介质为硝酸纤维膜、醋酸纤维 膜或玻璃纤维膜中的一种。
前述半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸中，所述胶体金的颗粒大小在5nm 40nm 之间。
前述半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸中，第二区固相化胶体金标记NGF多克隆抗 体区为均匀分布有固相化胶体金标记NGF多克隆抗体的无菌吸水薄海绵。
前述半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸中，所述窄缝的长度大于检测条带点样区长 度，所述窄缝的宽度为1 mm 3mm。
前述半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸用胶固定在PVC板上，吸水区的上部还可留 置一段空白PVC段做为手柄，以方便试纸的获取和使用。
前述半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤
a) 选取无菌层析介质薄膜裁剪成矩形长条，中间垂直作一平行于膜侧边的窄缝，窄 缝的长度大于检测条带点样长度，窄缝左侧为第三区，窄缝右侧为第四区；
b) 在第三区喷涂可与胶体金标记NGF多克隆抗体特异结合的另一种NGF多克隆抗 体条带，干燥；在第四区喷涂1条杂信号去除条带和2 7条递减浓度的NGF条 带，干燥；选用与无菌层析介质薄膜等宽度的无菌吸水薄海绵吸附做成5nm 40nm胶体金标记NGF多克隆抗体物垫，干燥；
c) 截取与无菌层析介质薄膜等宽度的PVC板,从下而上依次用胶连续固定样品吸收 区、胶体金标记NGF多克隆抗体物垫、无菌层析介质薄膜和吸水区，密封包装后 获得。
本发明中所提及的"上"和"下"以试纸使用时的方向为准，即以样品吸收端为下方， 吸水区为上方。除非特别指名,这里所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域一般
技术人员通常所理解的含义相同。同样，所有在此提及的出版物、专利申请、专利及其他
参考资料均可以引入本发明作为参考。
本发明中的半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸利用免疫层析原理，可迅速目检出纳
米胶体金标记物和样品结合后的颜色,并通过测试区左右颜色对比和右侧区条带多少来判 定检测的半定量结果，具有反应迅速，可迅速判定样品中待测物的有无及其含量高低的特 性。该试纸的生产方法简单，成本低，在原有的胶体金标记体外免疫诊断方法上进一步实 现了对NGF更有意义的半定量检测。在检测过程中半定量区的最下条带为质量控制的最 低标准，半定量区条带显示越多则NGF含量越高。检测全过程在IO分钟内判定结果，可 以方便的实现现场检测。具有特异性高，检测程序简单，结果准确可靠。操作人员无需专 业培训，按说明书指导即可得到半定量的检测结果。
具体实施方式
实施例l
使用NGF蛋白免疫兔和小鼠，分别得到抗NGF的鼠源性特异多克隆抗体McAB和 兔源性特异多克隆抗体TAB。
选择兔源性特异多克隆抗体TAB作为胶体金标记抗体，使用柠檬酸钠还原法制备并 测定其最适标记纳米金颗粒大小为20 50nm, 9500rpm/min转速离心20分钟，制备金储 液。用PH9. 0硼酸盐缓冲液将标记单抗做5 50pg/mL的梯度液，加入金储液后再加入 10^NaCl作稳定实验，5分钟后离心静止，在520 600nm测光吸收值(OD),得光密度 稳定时得TAB蛋白浓度为10 40吗/mL。取浓度为10 40吗/mL的TAB蛋白溶液， 加入金储液，而后加入PEG做成胶体金稳定液。
将标记好的胶体金标记抗体TAB用lcm宽、1.5cm长和0.05cm厚度的无菌吸水海绵 吸附作成金标记物垫，4'C黑暗环境，氮气缓慢吹干待用。
选取无菌硝酸纤维素薄膜，裁剪成lcm宽、5cm长的矩形条，中间垂直作一平行于膜 侧边的窄缝，窄缝的长度为20mm,窄缝的宽度为lmm,窄缝左侧为第三区，即检测区， 窄缝右侧为第四区，即半定量区；检测区横向喷涂25吗/mL的McAB条带，该条带距膜 探样端2. 2cm;半定量区分别从下而上依次横向喷涂5pg/mL、 100ng/mL、 50ng/mL和 20吗/mL四条NGF条带，McAB条带和NGF条带的长0.2cm,宽0.05cm。将喷涂McAB 和NGF的无菌硝酸纤维素薄膜在4'C黑暗环境过夜，5%牛血清白蛋白(BSA)封闭10
小时，C02缓慢吹干待用。裁剪与硝酸纤维膜等宽的洁净pvc塑料板，从下而上依次用强力双面胶连续固定样 品吸收区、胶体金标记NGF多克隆抗体物垫、无菌层析介质薄膜和吸水区，上述各个区 域不相互交叉。其中，吸水区的上部还可留置2cm的空白pvc段作为检测用手柄。吸水 区采用与硝酸纤维膜等宽、1.5cm长、0.25cm厚度的无菌吸水海绵；样品吸收区采用与 硝酸纤维膜等宽、lcm长高级滤纸；制备好的胶体金标记抗体TAB物垫设置在样品吸收 区和硝酸纤维膜之间。整个过程要求避免其它蛋白的沾染，铝箔袋密封、4x:干燥保存制 得。
使用时，在检测前将试纸连包装拿出，室温放置5分钟左右。取出试纸，将探样区浸 于小鼠颌下腺匀浆上清液中，液面不要没过探样区。2 5秒后拿出，水平放置在干净操 作台上，5 10分钟内即可肉眼见到结果。
如果半定量区只显示一条带则表明小鼠颌下腺匀浆上清液样品中存在的NGF蛋白小 于100pg/mL水平；如果半定量区出现多条条带则条带愈多则小鼠颌下腺匀浆上清液中 NGF蛋白含量越高显示两条带则表明小鼠颌下腺匀浆上清液样品中存在的NGF蛋白大 于等于100ng/mL;如果100ng/mL条带与左侧水平颜色差异不大则小鼠颌下腺匀浆上清 液样品中存在的NGF蛋白接近于lOOpg/mL水平；3条显示则浓度为100 150 pg/mL, 4 条显示则为150 170吗/mL。
实施例2
与实施例1不同的是，半定量区从下而上依次横向喷涂lOpg /mL 、 lOOng /mL、 50ng/mL三条NGF条带；使用时，如果半定量区只显示一条带则表明小鼠颌下腺匀浆上 清液样品中存在的NGF蛋白小于lOOpg/mL水平；显示两条带则表明小鼠颌下腺匀浆上 清液样品中存在的NGF蛋白大于等于100ng/mL;如果1(XVg/mL条带与左侧水平颜色差 异不大则小鼠颌下腺匀浆上清液样品中存在的NGF蛋白接近于100pg/mL水平；如果半 定量区出现三条条带则小鼠颌下腺匀浆上清液中NGF蛋白浓度为100 150吗/mL。
实施例3
与实施例1不同的是，半定量区从下而上依次横向喷涂lOpg/mL 、 150pg/mL、 120pg /mL、 KXVg/mL、 80ng/mL、 60ng/mL、 40ng/mL和2(Vg/mL八条NGF条带；使用时， 如果半定量区只显示一条带则表明小鼠颌下腺匀浆上清液样品中存在的NGF蛋白小于 100pg/mL水平;半定量区出现多条条带则条带愈多则小鼠颌下腺匀浆上清液中NGF蛋白 含量越高显示两条带则表明小鼠颌下腺匀浆上清液样品中存在的NGF蛋白大于等于 1(X^g/mL;如果1(XVg/mL条带与左侧水平颜色差异不大则小鼠颌下腺匀浆上清液样品中存在的NGF蛋白接近于100ng/mL水平；三条显示则浓度为150 270 pg/mL,四条显示 则为270 370ng/mL，五条显示为370 450吗/mL,六条显示为450 510吗/mL,七 条显示为510 550ng/mL,八条显示为550 570吗/mL, 8条完全显示为570~580 pg /mL。
上述仅为本发明的几个具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构 思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
权利要求
1、一种半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸，由下而上分为第一区样品吸收区、第二区固相化胶体金标记NGF多克隆抗体区、间隔窄缝对称分布在左右两侧的第三区固相化的另一种NGF多克隆抗体区和第四区固相化NGF区、第五区吸水区，其特征在于第四区固相化NGF区从下而上依次由一条杂信号去除条带和2～7条递减浓度的NGF条带组成。
2、 根据权利要求1所述的半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸，其特征在于杂信号去除 条带由5pg/mL- lOpg/mLNGF固化条带组成。
3、 根据权利要求2所述的半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸，其特征在于第三区和第 四区设置在层析介质上。
4、 根据权利要求3所述的半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸，其特征在于所述层析介 质为硝酸纤维膜、醋酸纤维膜或玻璃纤维膜中的一种。
5、 根据权利要求4中所述的半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸，其特征在于所述胶体 金的颗粒大小在5nm 40nm之间。
6、 根据权利要求l、 2、 3、 4或5中一项权利要求中所述的半定量免疫诊断NGF的胶体 金试纸，其特征在于第二区固相化胶体金标记NGF多克隆抗体区为均匀分布有固相 化胶体金标记NGF多克隆抗体的无菌吸水薄海绵。
7、 根据权利要求6所述的半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸，其特征在于所述窄缝的 长度大于检测条带点样区长度，所述窄缝的宽度为1 mm 3mm。
8、 权利要求l、 2、 3、 4或5中任一项权利要求中所述的半定量免疫诊断NGF的胶体金 试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤a) 选取无菌层析介质薄膜裁剪成矩形长条，中间垂直作一平行于膜侧边的窄缝，窄 缝的长度大于检测条带点样区长度，窄缝左侧为第三区，窄缝右侧为第四区；b) 在第三区喷涂可与胶体金标记NGF多克隆抗体特异结合的另一种NGF多克隆抗 体条带，干燥；在第四区喷涂1条杂信号去除条带和2 7条递减浓度的NGF条 带，干燥；选用与无菌层析介质薄膜等宽度的无菌吸水薄海绵吸附做成5nm 40nm胶体金标记NGF多克隆抗体物垫，干燥；c) 截取与无菌层析介质薄膜等宽度的PVC板，从下而上依次用胶连续固定样品吸收 区、胶体金标记NGF多克隆抗体物垫、无菌层析介质薄膜和吸水区，密封包装后 获得。
9、 根据权利要求8中所述的半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸的制备方法，其特征在于第二区固相化胶体金标记NGF多克隆抗体区为均匀分布有固相化胶体金标记NGF多 克隆抗体的无菌吸水薄海绵。
10、 根据权利要求8中所述的半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸的制备方法，其特征 在于所述窄缝的长度大于检测条带点样区长度，所述窄缝的宽度为1 mm 3mm。
全文摘要
本发明公开了一种半定量免疫诊断NGF的胶体金试纸及其制备方法，该试纸由下而上分为第一区样品吸收区、第二区固相化胶体金标记NGF多克隆抗体区、间隔窄缝对称分布在左右两侧的第三区固相化的另一种NGF多克隆抗体区和第四区固相化NGF区、第五区吸水区，其特征在于第四区固相化NGF区由一条杂信号去除条带和2～7条递减浓度的NGF条带组成。本发明中的胶体金试纸利用免疫层析原理，可迅速目检出纳米胶体金标记物和样品结合后的颜色，并通过测试区左右颜色对比和右侧区条带多少来判定检测的半定量结果，具有反应迅速，可迅速判定样品中待测物的有无及其含量高低的特性。
文档编号G01N33/558GK101556279SQ20081007234
公开日2009年10月14日 申请日期2008年12月8日 优先权日2008年12月8日
发明者付晓妍, 付永超, 张键荣, 熊玲媛, 邹宇飞, 马凌燕 申请人:厦门北大之路生物工程有限公司;任宏伟