一种炎症和血栓药物的靶标,以及针对该靶标的药物的制作方法

专利名称：一种炎症和血栓药物的靶标,以及针对该靶标的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体的讲，本发明涉及一种炎症和血栓药物的靶标，以 及针对该靶标的药物。
背景技术：
近年来细胞粘附分子及其研究已成为热点，对其调节细胞与胞外基质间相互作用等 功能，以及在细胞生长发育、免疫应答、炎症反应、血液凝固、组织修复和肿瘤转移等 生理和病理过程中的重要作用，也给予高度关注。
选择素(selectins)作为细胞粘附分子中一个家族，包括P-selectin， E-selectin和 L-selectin，其主要功能为介导活化血小板、内皮细胞与白细胞、肿瘤细胞等粘附和相互 作用，并与免疫损伤、炎症、血栓形成及肿瘤转移等密切相关。P-选择素(P-selectin) 是选择素家族中的一个成员，分子质量为140kDa的膜糖蛋白，定位于血小板的ot颗粒和 内皮细胞棒管状(Weibel-palade)小体内。全长由789个氨基酸残基组成，N末端730 个氨基酸构成胞外区，C末端24个氨基酸组成跨膜区，此外35个氨基酸组成胞浆短尾。 胞外区包括1个凝集素样区、1个表皮生长因子样区(EGF区)和9个被称为补体调节 蛋白的较短重复序列(SCR区)。其中凝集素样区可以结合某些碳水化合物，是选择素结 合配体部位。胞浆区可能与细胞骨架相连。P-选择素识别的是一些寡糖基团，主要是唾 液酸化的路易斯寡糖(sialyl Lweisx， sLex，即CD15s)或类似结构分子。
P-选择素糖蛋白配体l (P-selectin glycoprotein ligand l,PSGL-l, CD 162)是一种具有 同源二聚体结构的跨膜糖蛋白，表达于几乎所有白细胞表面，是迄今为止阐述得最为详 尽的选择素配体。PSGL-1与P-选择素有高度的亲和性，同时也是L-选择素和E-选择素 的配体。PSGL-1是一个高度唾液酸化的黏蛋白，每个单体的相对分子量为120kDa左右， 其蛋白骨架上带有1-3个N-连聚糖和数目众多的唾液酸化的O-聚糖，唾液酸化(sialylkx) 和O-聚糖(O-glycans)结构对PSGL-1功能发挥具有重要作用。
血小板和内皮细胞活化后，P-选择素被转运到细胞膜上(Blann AD, Nadar SK， Lip GY Eur Heart. J. 2003; 24: 2166 —2179; McEver RP. Selectins. Curr. Opin. Immunol.1994;6:75-84)。 P-选择素和其白细胞上的配体P-选择素配体PSGL-1相互结合，起始白细胞与 内皮细胞或血小板的黏附过程。
尽管白细胞与内皮细胞之间的黏附作用是构成机体屏障的重要一环，但白细胞内皮 细胞的过度黏附是有害的。例如，在缺血/再灌注损伤中，再灌注后细胞黏附增加会激发 炎症渗出加剧，造成比缺血更大的组织和器官损害。血栓的发生发展涉及机体许多复杂 的病理生理反应。血栓形成除与血浆中一些凝血因子有关外，更与P-选择素介导的白细 胞、内皮细胞和血小板之间的黏附密切相关(Li N, Hu H， LindqvlstM, etal. Arterioseler Thromb Vase Biol. 2000. 20: 2702 2708)。黏附分子P-选择素介导的血小板与内皮细 胞间，以及这些细胞与白细胞之间的细胞黏附，是炎症和血栓形成病理生理过程中的基 本现象和共同过程。通过各种途径和药物抑制和调节P-选择素及其介导的细胞黏附与作 用，已证明可成为炎症和血栓性疾病的有效防治手段。
抗细胞黏附最直接的是阻断受体配体之间的结合。在灵长类动物的血栓形成模型 中，针对P-选择素的单克隆抗体加速了血栓的溶解，并且在冠状动脉内皮损伤模型中， 可减少血栓形成和缺血损伤。此外在静脉血栓形成的大鼠模型中，针对P-选择素的单克 隆抗体不仅具有有效的抗血栓作用，同时也可减少炎症细胞的浸润。目前抗P-选择素抗 体可通过导人用于血栓和/或炎症的定位诊断以及靶向性治疗，已成功的使用在前临床模 型中。针对P-选择素的抗体及人源化单抗也被研究开发，如重组可溶性P-选择素糖蛋白 配体-1和小分子选择素抑制剂已进入临床试验，抗人P-选择素凝集素-表皮生长因子功能 域的单克隆抗体也已经申请中国专利(申请号200310108522.5)。
由于选择素均可识别唾液酸化的路易斯糖x (sLex)结构，所以sLex拟似剂因其高 亲和力迅速被开发，如TBC1269,分子量小于1000，作为治疗哮喘和银屑病的候选药物 己进入II期临床。非碳水化合物分子如OC229648，在体外实验中较TBC1269有更强的 抑制作用，且成功地应用于动物炎症模型。因此，抗黏附治疗将随着P-选择素与炎症和 血栓性疾病的研究深入和阐明，不失为一种防治手段，具有良好的临床应用价值和前景。
在起始黏附过程中，PSGL-1不仅可通过与选择素间的作用建立白细胞与内皮细胞间 联系，同时也可作为信号受体向细胞内传递信号引起白细胞的活化。P-sdectin结合 PSGL國1能活化整合素ocm卩2 (Ma YQ， PlowEF， Geng JG. Blood. 2004;104:2549—2556)，但 是该活化通路的具体分子机制尚不清楚。
整合素是一大类跨膜异二聚体粘附分子，表达在几乎所有真核细胞的表面，在细胞
间和细胞与基质间的相互作用中起重要作用。整合素中的P2家族常被称作白细胞整合素，包括四个成员，由四个不同的a亚单位(aM， aL， ax和otD)和一个共同的P2亚单位构成， 其中表达在中性粒白细胞上的p2整合素主要是ocmP2 (CDllbCD18, Mac-l)和0^(32 (CDllcCD18, LFA-1)。这两种整合素能结合多种配基，包括血纤蛋白原，细胞间粘附 分子(ICAM-1， CD54)，凝血因子X，补体通路产物C3bi和几种细胞外基质蛋白。Mac-l 和LFA-1和配体的结合依赖于白细胞活化时其对配体亲和性的提高和其自身聚集而提高 的亲合力，也依赖于贮存于胞内的分子向细胞表面的分布。(32整合素的活化对于炎症及 血栓性疾病中白细胞在血管内皮表面的粘附起着关键的作用。
研究PSGL-1向细胞内传递信号的通路及其机制，可以找到新的与炎症性疾病和血 栓性疾病等发生发展密切相关的介质和分子靶标。

发明内容
本发明的发明人对P-选择素与其配基PSGL-1结合后的信号传导机制和体内功能进 行了研究，研究结果显示
1、 磷脂酰肌醇3位激酶(PI3K)参与了该活化过程中的信号通路，PSGL-l结合P-选择素后，可使PI3K的p85亚基结合到PSGL-l的胞内区上，并能增强PI3K的激酶活 性；
2、 Nafl和PSGL-1胞内区结合后，酪氨酸激酶Src在P-选择素作用下被活化，进而 磷酸化Nafl ，聚集PI3K的p85亚基结合到Nafl上；
3、 Nafl可作为转接蛋白，连接PSGL-1的胞内区和PI3K的p85亚基。
由于，P-选择素介导的血小板与内皮细胞间，以及这些细胞与白细胞之间的细胞黏 附，是炎症和血栓形成病理生理过程中的基本现象和共同过程。通过各种途径和药物抑 制和调节P-选择素及其介导的细胞黏附与作用，已证明可成为炎症和血栓性疾病的有效 防治手段。同时，抗黏附治疗作为一种防治手段，具有良好的临床应用价值和前景。而 且，p2整合素的活化对于炎症及血栓性疾病中白细胞在血管内皮表面的粘附起着关键的 作用。
因此，本发明的发明人根据上述研究结果，设计了一种能抑制P-选凝素引起的e2 整合素的活化的肽段PSGL-1胞内区肽段，并验证了该肽段的功能，确定该肽段能阻断 P-选择素活化P2整合素，从而可进一步用于炎症及血栓性疾病药物。
本发明的一个目的在于，提供蛋白Nafl和PSGL-1作为靶标用于筛选治疗炎症和/ 或血栓性疾病的药物以及用作炎症和/或血栓性疾病药物的药物靶标的用途。本发明的另一目的在于，提供蛋白Nafl和/或PSGL-l的一种特异性抗体以及一种含 有蛋白Nafl和/或PSGL-l的特异性抗体的、用于治疗炎症和/或血栓性疾病的药物。
本发明还有一个目的在于，提供一种以蛋白Nafl和/或PSGL-l为药物靶标的、用于 治疗炎症和/或血栓性疾病的药物。
本发明还有一个目的在于，提供一种能阻断Nafl和PSGL-l的胞内区结合的肽段以 及上述肽段用于炎症和/或血栓性疾病药物的应用。
本发明还有一个目的在于，提供一种源于Nafl第17个外显子的多肽。
本发明对P-选择素与其配基PSGL-1结合后的信号传导机制和体内功能进行了研究， 针对该信号传导通路，可以Nafl和/或PSGL-l为靶标，开发用于炎症及血栓性疾病的药 物；Nafl或PSGL-1的特异性抗体，以及含有所述特异性抗体的用于炎症及血栓性疾病 的药物；提供的肽段Tat-PSGL-l在阻断Nafl和PSGL-1的结合的同时，还能减弱白细胞 的粘附，并能抑制体内的炎症反应，从而为免疫损伤、炎症、血栓形成及肿瘤转移等疾 病的治疗提供新的方法。


图1显示Nafla和PSGL-l胞内区在酵母Y190中的相互结合。其中，图1A为(3-半 乳糖苷酶报告基因结果；图1B为His报告基因的结果。
图2显示酵母双杂交筛选得到NaflcDNA，制备Nafl抗体。
其中，图2A为Nafl基因的氨基酸序列及构建的酵母双杂交"诱饵"(bait)简图； 图2B为抗Nafl多抗的Western免疫印迹结果，分别检测HL-60裂解液、中性粒白细胞 裂解液和转染pCMV-Nafl的293裂解液，同时用抗c-myc的单抗9E10检测转染 pCMV-Nafl的293裂解液认识同样大小的条带，证明该多抗特异识别Nafl 。
图3显示Nafl和PSGL-1胞内区特异性结合，以及Nafl和PSGL-1相互结合的结合 位点。
其中图3A为人中性粒细胞裂解液上清分别和预载有GST蛋白或融合蛋白 GST-Nafl的谷胱甘肽基质(glutathione-s印harose)孵育的结果；图3B为结合在谷胱甘 肽基质上的融合蛋白GST-Nafl和GST蛋白洗脱后用考马斯亮兰染色定量的结果；图3C 为293细胞共转PSGL-1表达质粒pCDNA3.1-PSGL-l和带c-myc tag的Nafl表达质粒 pCMV-Nafl或单转pCMV-Nafl的结果；图3D为HL-60细胞的裂解上清分别用抗PSGL-1 多抗或兔免疫前IgG做免疫共沉淀的结果；图3E为HL-60细胞分别用人IgG或P-Rg刺激的结果；图3F为PSGL-1胞内区及缺失突变体的氨基酸序列简图；图3G为293细胞 共转PSGL-1缺失突变体和Nafl的结果；图3H为PSLG-1胞内区点突变示意图，黑体 氨基酸(R、 N、 Y、 S、 P、 T、 E)被突变为丙氨酸(A);图31为93细胞共转PSGL-1 缺失突变体和Nafl或PSGL-1野生型和Nafl的结果；图3J为NaflC端缺失突变示意图； 图3K为NaflC端缺失突变和PSGL-1免疫共沉淀的结果。 图4显示Nafl介导PSGL-1和p85的结合。
其中，图4A为293细胞共转进表达PSGL-1 ,p85和Nafl的载体或对照空载体pCMV 的结果；图4B为293细胞共转进表达p85和Nafl的载体或对照空载体pCMV的结果； 图4C为293细胞共转进表达p85和NaflY552F、 Nafl的载体或对照空载体pCMV的结 果；图4D为293细胞共转进表达PSGL-1， p85和Nafl或NaflY552F的载体或对照空 载体pCMV的结果。
图5显示PSGL-l/Nafl/p85在人中性粒细胞中形成复合物，P-Rg剌激能活化Src，进 而磷酸化Nafl并增强PI3K激酶活性的结果。
其中，图5A为人中性粒细胞分别和对照缓冲液PBS (-)， 10吗/ml的人IgG (hlgG) 或P-selectinRg (P-Rg)孵育20分钟后，免疫印迹检测结果；图5B为用人IgG (hlgG) 或P-selectinRg (P-Rg)刺激人中性粒细胞后，用3B8免疫检测的结果；图5C为抗PSGL-1 多抗或免疫前兔IgG从人中性粒白细胞的细胞裂解液上清中免疫共沉淀PI3K，然后用免 疫沉淀物去催化底物磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol， PI)和32P标记的ATP，后产物 放射自显影图，图中箭头标记为PIP;图5D为取斑点强度的相对值，将三次独立实验结 果取平均值的结果；图5E为白细胞和PP2， DMSO室温孵育、裂解后，用Nafl抗体将Nafl 免疫沉淀后3B8和5C4的免疫检测结果；图5F为白细胞的处理同5E，其它实验同图5A; 图5G为白细胞刺激后直接裂解，裂解液分别用Src抗体和抗Src416位酪氨酸磷酸化抗 体免疫检测的结果。
图6显示P-selectin通过Nafl和p85通路活化ocmP2整合素的结果。
其中，图6A为人中性粒白细胞或HL-60细胞的粘附细胞检测结果；图6B为用退火 的Sl和S4电转HL-60细胞后，抗Nafl多抗免疫印迹检测结果；图6C为转染Sl和S4 的HL-60细胞的免疫共沉淀检测PSGL-1和p85的结合的结果；图6D为转染Sl和S4 的HL-60细胞的细胞粘附结果。
图7显示突变体NaflY552F阻断PSGL-1和p85的结合并阻断P-选择素活化aMp2 整合素的信号通路的结果。其中，图7A为带有NaflY552F或LacZ基因的病毒颗粒感染HL-60后，用抗Nafl 抗体免疫检测的结果；图7B为带有NaflY552F或LacZ基因的病毒颗粒感染HL-60后， 免疫共沉淀检测PSGL-1和p85的结合的结果；图7C为带有NaflY552F或LacZ基因的 病毒颗粒感染HL-60后，细胞粘附检测结果。
图8显示PSGL-1胞内区Tat融合多肽被细胞吞噬，并阻断PSGL-1和Nafl的结合 的结果。
其中，图8A为所构建的融合多肽示意图；图8B为标记FITC的融合多肽用和小鼠 中性粒细胞孵育后，共聚焦显微镜结果；图8C和D为将结合有融合多肽的Ni beads和 人(C)或小鼠(D)中性粒细胞裂解液孵育，结合下来的Nafl用Nafl多抗Western免 疫检测的结果；图8E为将融合多肽加到人中性粒白细胞裂解液中，用Western检测的结 果。
图9为PSGL-1胞内区肽段在体外和体内阻断P-选择素活化整合素的示意图。 其中，图9A为人中性粒白细胞分别和融合肽段孵育30分钟后，用hlgG和P-Rg剌 激的粘附实验结果；图9B为用小鼠的中性粒白细胞和小鼠fibrinogen重复A的结果的示 意图；图9C为人中性粒白细胞分别和融合肽段或抗体孵育后，用hlgG和P-Rg刺激的 粘附实验结果；图9D为小鼠预先被静脉注射入相关试剂后，显微观察提睾肌上微血管中 的滚动和粘附白细胞的结果；图9E为小鼠预先被静脉注射入相关试剂后，急性腹膜炎实 验结果。
图10为HL-60细胞表达相应病毒后，用流式细胞仪结合相应抗体或P-Rg分别检测 (XM亚基(A)， PSGL-1 (B)的表达和P-Rg的结合(C)的结果。
图11为分离小鼠中性粒白细胞，和肽段孵育后，用流式细胞仪结合相应抗体或小鼠 P-Rg分别检测ocM亚基(A)， PSGL-1 (B)的表达和小鼠P-Rg的结合(C)的结果。
图12为抑制HL-60细胞内源的Nafl表达不影响细胞表面的PSGL-1和aM亚基的表 达以及P-Rg和PSGL-1的结合的结果。
其中，图12A为电转S1或S4的HL-60细胞用抗otM亚基的抗体44a孵育的结果， 对照用小鼠IgG;图12B为用兔IgG做对照，流式细胞仪测细胞表面荧光强度的结果； 图12C为用人IgG做对照，将P-Rg和电转后的HL-60细胞孵育后，用流式细胞仪测细 胞表面荧光强度的结果。
图13为P-选凝素对P-选凝素敲除小鼠中的深静脉血栓的作用的示意图，其中，C57 为直接结扎C57小鼠的实验结果，PKO为直接结扎P-sdectinKO鼠的实验结果，mP-Rg为P-selectin KO鼠静脉注射小鼠P-Rg的实验结果，12CA5为P-selectin KO鼠静脉注射 12CA5的实验结果，*表示卩<0.05，"表示pO.Ol。
图14为体内注射Tat-PSGL-l抑制小鼠深静脉血栓的结果，其中，分别以体内注射 Tat-PSGL-l Mut或生理盐水的小鼠为对照。
具体实施例方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验 指南(第三版)》(J.萨姆布鲁克等著，2003)中所述的条件和方法进行。
本发明中使用的材料
人胚肾转化细胞株293 (CRL-1573)和293T、原髓样白血病细胞株HL-60 (CRL-240) 均购自美国组织培养采集中心(ATCC)。以上细胞株分别用添加10n/。灭活胎牛血清、4mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100pg/ml链霉素的DMEM培养液(293和293T细胞) 或RPMI-1640培养液(HL-60细胞)，在37'C下5%0)2培养箱中培养。
抗人a-Tubulin单抗anti-a-Tubulin (clone B 5-1-2)、人和鼠IgG均购自Sigma公司 (St. Louis, MO)。 KPL-1 (抗PSGL-1单抗)，CBRM1/5 (ocM亚基的阻断性单抗)，2PH1 (小鼠PSGL-1的阻断性单抗)，Ml/70 (小鼠Mac-1的阻断性单抗)，M17/4 (小鼠LFA-1 的阻断性单抗)，RB40.34 (小鼠P-selectin的阻断性单抗)和亚型对照抗体购自BD Pharmingen公司(San Diego， CA)。单抗38购自Axxora公司(San Diego, CA)。抗p85 多抗购自Upstate公司(Lake Placid, NY)。 9E10 (抗c-myc单抗)，IB4 (p2亚基的阻断 性单抗)，OKM1 (aM亚基的非阻断性单抗)和44a (ocM亚基的阻断性单抗)均购自美 国组织培养采集中心(ATCC)。人纤维蛋白原购自Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN), pCDNA3.1/Hygro载体购自Invi加gen公司，pCMV-Tag 3B载体购自Stratagene 公司，其它试剂购自Sigma公司。
蛋白12CA5(购自美国组织培养采集中心，ATCC)，为HA单抗，具有与小鼠P-Rg(mP-Rg) 同样的Fc片段，在实验中可作为mP-Rg的对照。
人P-选择素和受体球蛋白融合蛋白(P-selectin Rg ， P-Rg)、 Gl (P-选择素向白细胞 粘附的阻断性单抗)、PSl(P-选择素向白细胞粘附的非阻断性单抗)见文献(MaL，Raycroft L， Asa D， Anderson DC, Geng J-G. J Biol Chem.1994; 269: 27739-27746; Geng J-GBevilacqua MP, Moore KL, et al. Nature. 1990;343:757-760.);免疫前兔IgG和抗人PSGL-1 肽段兔多抗的制备，釆用文献(J.G., Raub T丄，Baker C. A.， Sawada G. A., Ma L., and EIhammer A. P. J Ce〃历o/. 1997; 137: 743-754.)所述的方法；pCEP4F载体见文献(Zhu X， Mancini M A， Chang K H， Liu C Y， Chen C F， Shan B, Jones D， Yang-Feng T L, Lee W H. Mol Cell Biol. 1995; 15: 5017-5029)。
在本发明的下述实施例中，P-选凝素敲除小鼠(PKO，购自Jackson Laboratory)和 对照C57小鼠(购自中科院上海实验动物中心)，其余未具体提及的小鼠则购自中科院上 海实验动物中心，为SPF级词养。pllOSD^^，A突变小鼠参见文献(Okkenhaug K， Bilancio A, Farjot G Priddle H， Sancho S， PeskettE， Pearce ^V， Meek SE， Salpekar A， Waterfield MD, Smith AJ, Vanhaesebroeck B. Science. 2002; 297:1031-4)。
本发明中采用的的实验方法具体如下
1、 融合蛋白表达和抗体制备
参考Amersham Pharmacia Biotech的操作手册《GST Gene Fusion System》，将酵母双 杂交获得的Nafl cDNA片段(编码394-629位氨基酸)克隆进载体pGEX-4T-2 (Amersham Pharmacia Biotech)，制备GST融合蛋白。
用构建的GST融合蛋白作为免疫原免疫兔子，以制备抗Nafl的多抗，多抗的特异 性通过免疫印迹真核表达带有c-myc-tag的Nafla得到确认。
Nafl的特异性抗Y552位酪氨酸磷酸化单抗3B8和对照单抗5C4，通过将特定肽段 免疫小鼠制备，再通过ELISA方法筛选而获得。
该过程中，所使用的肽段的氨基酸序列如下HLCGAYPYALIPPMPAMVPHH(其中， U为pY，即为磷酸化的酪氨酸)，而对照肽段与U对应的氨基酸为未磷酸化的酪氨酸， 其序列如下HLCGAYPYAYPPMPAMVPHH。
2、 GST pull-down实验
分离人中性粒白细胞，分离方法参见文献(Ma YQ，PlowEF，GengJG. Blood. 2004; 104:2549-2556);再将分离得到的人中性粒白细胞在冰浴的CHAPS裂解液(3%CHAPS， 20mMTris， pH7.4， 150mMNaCl， 0.1%BSA， lmMPMSF， 2ng/ml aprotinin， 2(xg/ml leupeptin， 1吗/ml pepstaninA)中裂解l小时后，裂解物于12,000g， 4'C离心10分钟，收
集裂解上清。于4'C条件下，取含有约107个白细胞的裂解上清，与l(Hil预载有等量的GST或GST融 合蛋白的glutathione-sepharose beads (Amersham Pharmacia Biotech公司)，共孵育4小时。
孵育后，将glutathione-sepharosebeads用清洗液(0,05% TritonX-100， 20mMTris， pH7.4， 150mMNaCl)清洗3遍后，以非还原lxSDS上样缓冲液煮沸洗脱，然后通过Western
免疫印迹进行检测。
其中，所用的GST或GST融合蛋白，经表达纯化后通过CoomassieBlue染色进行定量。
3、 免疫共沉淀和Westem免疫印迹法
293细胞通过磷酸钙法(Chen C., and Okayama H.. Mol. Cell. Biol. 1987; 7: 2745-2752) 共转染进以下载体pCMV-Nafl载体，编码PSGL-1野生型或突变型的载体或相应的表 达载体。
转染48小时后，细胞用冰浴的lxPBS洗涤，并在冰浴的裂解缓冲液(lX TritonX-100， 50mMHEPES， pH7.4， 150tnMNaCl， 0，5mMEGTA， 10%甘油(glycerol), lmMPMSF， 2吗/ml aprotinin， 2pg/ml leupeptin， lng/ml pepstaninA，)(在有关磷酸化的实验中，该裂 解液中另外添加磷酸酶抑制剂10mMNaF和lmMNa3V04)中裂解1小时，再将裂解物 于12,000g， 4 。C离心10分钟，收集离心上清。上清与相应抗体及protein A-sepharose beads (Amersham Pharmacia Biotech公司)，于4'C孵育6-8小时，然后用清洗缓冲液(0.05% TritonX-100, 20mMTris， pH7.4， 150mMNaCl)清洗3遍后，将免疫沉淀复合物或相应的 细胞裂解液上清与还原性lxSDS上样缓冲液混合，煮沸5分钟，经由SDS-PAGE电泳后， 电转到PVDF膜上，用相应的一抗和HRP标记的二抗去检测，最后采用ECL化学发光 试剂盒(上海普飞生物技术有限公司)显色。
4、 激酶活性测定
分离得到的人中性粒白细胞，在含2X胎牛血清的M199培养基中饥饿2个小时，再 用10吗/ml的人IgG (hlgG)或P-selectin Rg (P-Rg)在22。C刺激15分钟后，于裂解液 (配方同方法"免疫共沉淀和Western免疫印迹法"中所述)中裂解细胞，再用抗PSGL-l 多抗(对照用免疫前兔IgG)免疫共沉淀磷脂酰肌醇3位激酶(PI3Ks)， PI3K激酶的活 性测定参照文献(Wallasch C., Weiss F.U., Niederfellner G., Jallal B., Issing W., and Ullrich A. EMBO.J. 1995; 14:4267-75)中的方法。5、 siRNA抑制实验
5.1、 HL-60的siRNA转染
使用Amaxa公司的Nucleofector Device (program T-19)禾口 the Cell Line Specific Nucleofector Kit V (Amaxa, Cologne, Germany)进行转染。其中，退火dsRNAi oligonucleotides (购自Ambion, Austin, TX)的转染浓度为lpM，其序列分别为 SI: 5，-GGAGAAUUCCCGGCUGAAGTT-3' /3' -TTCCUCUUAAGGGCCGACUUC-5，； S4: 5，-GCUUUUGGAAGAGUCCCAGTT-3， /3， -CTCGAAAACCUUCUCAGGGUC-5， 其中，S4能抑制内源的Nafl表达，Sl作为对照则不能抑制内源的Nafl表达。 转染24小时后，收集细胞用于免疫共沉淀和Western免疫印迹、粘附实验和流式细 胞分析。
5.2、 293T细胞转染
使用LIPOFECTAMINE 2000 Reagent(Invitrogen公司)进行转染。其中，退火dsRNAi oligonucleotides的转染浓度为100 nM (其序列同5.1，分别为Sl和S4)。 转染48小时后，收集细胞用于Western免疫印迹。
6、 细胞粘附实验
人中性粒白细胞或HL-60细胞在加或不加化合物(用DMSO作对照)的情况下，用 10ng/mlhlgG或P-Rg刺激，然后将细胞加到预先铺有血纤蛋白原(fibrinogen)的96孔 板中，于37。C， 5xco2培养箱中放置20min。
当用抗体抑制时，取10吗P-Rg先和20吗的Gl F(ab，)2或者20吗的PS1 F(ab，)2，在 30m1的pbs缓冲液(IxPBS, lmM CaCl2, 1 mM MgCl2)室温放置15分钟，然后加到人 中性粒白细胞中；或者人中性粒白细胞预先和lOpg/ml的44a和其亚形相配抗体9E10孵 育。
当用化合物抑制时，人中性粒白细胞中在用P-Rg刺激前先和0.1% DMSO， 25nM PP2， 150nM渥曼青霉素(Wortmannin)或10pM LY294002在室温孵育5 min。细胞粘 附的操作参见文献(MaYQ， PlowEF， Geng JG. Blood. 2004;104:2549-2556)所述的方法。
7、 流式细胞仪分析
收集HL-60细胞或转染后的HL-60细胞，用lxPBS洗一遍后，重新悬浮于PBS缓 冲液(lxPBS， 0.5%BSA， lmM CaCl2 ， lmM MgCl2)，并加入10吗/ml的P-Rg或2pg/ml13的相应抗体；于4'C孵育1小时后，再用PBS缓冲液洗一遍后，再重新悬浮于PBS缓冲 液，加入2 pg/ml的相应FITC标记二抗；再于4'C孵育1小时，用PBS缓冲液洗一遍后 收集细胞重新悬浮于PBS缓冲液中，将细胞用于流式细胞仪分析(BD公司的FACScan )。
8、 TAT融合蛋白表达与纯化
PSGL-1的胞内区以人PSGL-1全长cDNA为模板，以下述引物对作为引物，PCR扩 增获得，其中，所用引物对的序列分别为
5'-CTTATAATAGGATCCCGCCTCTCCCGCAAGGGCC-3'; 5'-TGGACCTGCAAGCTTCTAAGGGAGGAAGCTGTGC-3'; 人PSGL-1全长cDNA如SEQ ID NO: 2所示。
将获得的PCR产物，用BamHI和HindIII进行双酶切，并克隆到预先用BamHI和 HindIII双酶切了的pET30a ( + )载体(Novagen)中，构建的载体用来表达具有6xHis 的融合PSGL-1胞内区肽段(PSGL-I P)， PSGL-1 P具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基 酸序列。
参照产品说明书，使用MutanBEST Kit (TaKaRa〉将Tat序列(YGRKKRRQRRR) 插进pET30a (+) -PSGL-l-tail，所用引物对的序列分别为
5'-AGACAGCGACGAAGAGACGACAAGGCCATGGCTGATA-3';
5'-CCGCTTCTTCCTGCCATACACCAGACCAGAAGAATGATGA-3';
所构建的载体被用来表达Tat和6xHis融合的PSGL-1胞内区(Tat-PSGL-1 )， Tat-PSGL-l具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。
Tat和6xHis融合的PSGL-1胞内区突变体(Tat-PSGL-1 Mut)(其中，R345A， N346A， Y347A, P349A为突变位点)也是用MutanBEST Kit (TaKaRa)构建，所用引物对的序 列分别为
5'陽GCTGCTGCCTCCGCCACCGAGATGGTCTGCATCTCA-3'; 5'國CACGGGGTACATGTGGCCCTTGCGGGAGAGGCG-3'。 Tat-PSGL-l Mut具有具有如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。
所构建载体通过测序验证，以确保构建结果正确。融合多肽的表达和纯化依据BD公司操作手册(BD TALON Metal Affinity Resins User Manual)禾卩文献(Franken K.L., H.S. Hiemstra， K.E. Van Meijgaarden， Y. Subronto, J. Den Hartigh, T.H. Ottenhoff, and J.W. Drijfhout. J.Exp.Med. 2003; 197:63—75)中的方法进 行。
采用共聚焦显微技术，检测融合多肽被细胞吸收情况。分离的小鼠中性粒白细胞和 FITC标记的PSGL-1 P， Tat-PSGL-1或Tat-PSGL-1 Mut在37'C孵育30分钟后，固定细胞， 立即用共聚焦显微镜分析。
9、 体内显微实验
雄性C57 (体重约为25克/只)，静脉注射PBS或相应抗体或蛋白，30分钟后用 125mg/kg氯胺酮(ketamine)， 12.5mg/kg甲基噻嗪(xylazine)禾a 25吗/kg硫酸阿托品 (atropine sulfate)麻醉，放于37'C的保温板上，并将其提睾肌剥出拉开，用别针固定， 然后用倒置显微镜(CK40-F200, Olympus)观察(20x物镜，10x目镜)。观测方法如下
选择直径为20—4(Him的微静脉观察。将比血液中红细胞流动速度慢的滚动的白细 胞定义为"滚动的白细胞"，10分钟内观察视野内所有的滚动细胞数除以10得到每个老 鼠每分钟的平均滚动白细胞数。
将粘住超过30秒的白细胞定义为"粘附白细胞"，计数10分钟内在约15(Hirn长度 的血管上粘附的细胞总数。
每只老鼠计数3 — 5个视野。
10、 小鼠急性腹膜炎模型构建
Balb/c小鼠(6—8周，20g体重)用lml 3%巯基乙酸培养基或生理盐水(模型对照) 腹腔注射小鼠诱导急性腹膜炎，2小时后处死小鼠，然后，按照文献(YangK.K.,Dorner B.G.， Merkel U., Ryffel B.， Schutt C.， Golenbock D., Freeman M.W., and Jack R.S. mice丄Immunol. 2002, 169: 4475—4480; Ajuebor M.N., Gibbs L., Flower R丄，Das A.M., and PerrettiM. Br.J.Pharmacol. 1998,125:319—326)报道的方法，计数腹腔中渗出的白细胞总 数。
在肽段抑制或抗体对照实验中，在注射巯基乙酸前30分钟，采用尾静脉注射方式， 对实验小鼠注射肽段(30pg/只)或抗体U(Hig/只)，鼠P-Rg (20吗/只)。实施例l、酵母双杂交筛选与人PSGL-1胞内区结合的细胞内蛋白
参考Clontech公司的操作手册，将编码PSGL-1的胞内区334—402位氨基酸(序列
如SEQ ID NO: 3所示)的cDNA片段克隆进载体pAS2-l (Clontech公司)，构建重组质
粒pAS2-l-PSGL-lCT。
以该胞内区与GAL4的DNA结合结构域融合蛋白作为诱饵，应用Clontech公司的
酵母双杂交系统(Matchmaker Two-Hybrid System),筛选人的白细胞cDNA文库，获得
与人PSGL-1胞内区结合的细胞内蛋白。
根据激活P-半乳糖苷酶报告基因和His报告基因的结果，得到了一些阳性克隆，然 后对上述获得的这些阳性克隆进行测序分析。根据测序结果，其中一个克隆具有编码Nafl 蛋白的部分序列。
又利用酵母Y190的上述报告基因共转空载体和无关蛋白作对照实验，结果如图1 所示。
根据图1的结果，Nafl和PSGL-1具有特异作用。 实施例2、制备Nafl
以Human Leokocyte MATCHMAKER cDNA Library文库(Clontech)作为模板，以 Nafl forward和Nafl reverse作为引物，通过PCR制备全长Nafl cDNA序列。 引物Nafl forward和Nafl reverse的序列如下
Nafl forward: 5，-TTACGGATCCATGGAAGGGAGAGGACCGTAC-3，； Nafl reverse: 5，- CGCCAAGCTTAAATGACACAATCTGGTCTCACTG-3';
将获得的PCR产物以BamHI和HindIII双酶切，然后联接到同样经BamHI和HindIII 双酶切的pCMV-Tag 3B (Stratagene)载体，构建成带c-myc-tag的Nafl真核表达载体 pCMV-Nafl 。
通过测序，确认Nafl cDNA序列没有发生突变。
将全长Nafl cDNA序列(序列为SEQIDNO: 1)连接入pCEP4F载体，构建成真 核表达载体pCEP4F-Nafl 。
我们用细菌表达了Nafl全长和His-tag融合蛋白，然后，用该蛋白做抗原免疫兔子， 得到了抗Nafl多抗，用该多抗检测了 HL-60细胞和转染Nafl (带c-myc)的293细胞裂解液，同时用抗c-myc的单抗9E10同时检测转染Nafl的293细胞裂解液，结果如图2B 所示。
根据图2B的结果，该抗体特异识别转染Nafl， HL-60细胞内源表达Nafl，同时用 该多抗检测人中性粒细胞裂解液，也能测到人中性粒细胞表达Nafl。
我们将克隆到的Nafl在293细胞内进行了表达，先用抗FLAG抗体将蛋白从细胞裂 解液中免疫沉淀下来，然后用抗Nafl多抗免疫印迹检测免疫沉淀得到的蛋白，结果见图 2C。
根据图2C的结果，蛋白Nafl能在293细胞内表达，在还原条件下，Nafl约为80kDa。
实施例3、 Nafl的功能
3.1、 Nafl和PSGL-1的结合位点
3丄1、 Nafl和PSGL-1胞内区的结合具有特异性
利用含有Nafl序列的GST融合蛋白进行pull-down实验，结果见图3A、 3B。根据 图3A、 3B的结果，结合GST-Nafl的beads能从白细胞裂解物中将PSGL-1结合下来， 而对照GST蛋白这不能。
该结果显示Nafl和PSGL-1胞内区的结合具有特异性。 3丄2、 Nafl和PSGL-1胞内区在瞬时表达的哺乳动物细胞中能相互结合 在293细胞中共转染表达PSGL-1和Nafl或只转染表达Nafl ，用相应抗体进行免疫 共沉淀试验，其中共转染表达PSGL-1和Nafl时，使用的抗体为兔IgG、 a-PSGL-l， 只转染表达Nafl时，使用的抗体为a-PSGL-l、 9E10，结果如图3C所示。
根据图3C的结果，用抗PSGL-1的抗体能将Nafl免疫共沉淀下来，而对照抗体则 不能，只转染Nafl的细胞用抗PSGL-1的抗体和9E10做免疫沉淀作为免疫共沉淀对照， 抗PSGL-1的抗体不能将Nafl从只转染Nafl的细胞中免疫共沉淀下来。
以上结果证明Nafl和PSGL-1胞内区在瞬时表达的哺乳动物细胞中能相互结合。
3丄3、 Nafl和PSGL-1在正常生理状态下的相互作用
制备HL-60细胞裂解提取物，然后将HL-60细胞裂解提取物分别用抗PSGL-1兔源 多抗和免疫前兔IgG做免疫沉淀并用Western分析，结果如图3D所示。
根据图3D的结果，抗PSGL-1多抗能将内源的PSGL-1及内源的Nafl免疫共沉淀 下来，而对照免疫前兔IgG则不能。进一步，在用P-Rg刺激的条件下做免疫共沉淀，结果如图3E所示。 根据图3E的结果，Nafl和PSGL-1的结合不比人IgG对照增强。 上述结果说明，在正常生理条件下，Nafl和PSGL-l是能相互结合的。
3丄4、 PSGL-1胞内区与Nafl的结合的序列
对PSGL-1的胞内区进行缺失突变，将PSGL-1胞内区从C端向N端进行缺失突变， 共构建了五个缺失突变体(Ml， M2， M3， M4, M5)，结果如图3F所示。
将这些缺失突变体和Nafl共转染进293细胞，然后进行免疫共沉淀实验，结果如图 3G所示。
根据图3G的结果，Ml ， M2， M3能将Nafl免疫共沉淀结合下来，而M4和M5则 不能。
根据上述结果，可以推断出PSGL-1胞内区中345位到351位的RNYSPTE序列，对 PSGL-1和Nafl的结合是重要的。
3.1.5、 PSGL-1胞内区与Nafl的结合的关键位点
进一步对该序列进行点突变，将345位到351位的七个氨基酸分别突变为丙氨酸，
构建了七个点突变体，结果见图3H所示。
然后，将点突变体和Nafl共转染进行免疫共沉淀实验，结果如图3I所示。 根据图3I结果，突变体R345A， N346A， Y347A， P349A不能将Nafl免疫共沉淀
结合下来。
根据该结果，PSGL-1胞内区345， 346， 347， 349位的氨基酸是PSGL-1和Nafl结
合的关键位点。
3丄6、 Nafl上对PSGL-1和Nafl结合关键的区段 对Nafl的C端进行缺失突变，结果如图3J所示。 这些缺失突变和PSGL-1免疫共沉淀的结果，结果如图3K所示。 根据图3K的结果，C3， C4,C5突变体不能被PSGL-1的多抗免疫共沉淀下来，该结 果显示第17个外显子对PSGL-1和Nafl结合起关键作用。3.2、 Nafl中介导PSGL-1和PI3K的p85亚基的结合的关键结构域
3.2.1、 体夕卜Nafl介导PSGL-1和PI3K的p85亚基的结合
在293细胞中，共转染进表达PSGL-1 ， p85和Nafl的质粒载体或相应的对照空载 体pCMV， 48小时后裂解细胞。取细胞裂解液上清，分别用抗PSGL-1多抗或免疫前兔 IgG免疫共沉淀，沉淀物用抗p85多抗免疫印迹检测，用KPL-1检测免疫沉淀下来的 PSGL-1，同时用抗p85多抗免疫印迹检测细胞裂解液上清中的p85作为对照，结果如图 4A所示。
根据图4A结果，在共转染进表达PSGL-1, p85和Nafl的质粒载体的293细胞中， 抗PSGL-1多抗能将p85免疫沉淀下来，而对照免疫前兔IgG则不能；在转染表达PSGL-1 ， p85和对照空载体pCMV的293细胞中，抗PSGL-1多抗则不能将p85免疫沉淀下来； 用KPL-1检测，抗PSGL-1多抗能将PSGL-1免疫沉淀下来，而对照免疫前兔IgG则不 能。
另一方面，293细胞共转染进表达p85和Nafl的质粒载体或相应的对照空载体 pCMV，细胞裂解液上清用9E10或对照小鼠IgG做免疫共沉淀，免疫沉淀物分别用抗P85 多抗和9E10检测，结果如图4B所示。
根据图4B的结果，9E10能将p85免疫沉淀下来，而对照小鼠IgG则不能。同时， 在共转染进表达p85和对照空载体pCMV的293细胞中，9E10则不能将p85免疫沉淀下 来。用9E10在9E10的免疫沉淀物中能检测到Nafl,而对照小鼠IgG则不能将Nafl免 疫沉淀下来。细胞裂解液上清直接用抗p85多抗检测p85的表达作为对照，各组间结果 无明显差别。
以上结果直接证明了 Nafl能作为转接蛋白，介导PSGL-1和PI3K的p85亚基的结合。
3.2.2、 Nafl中与p85的结合的关键结构域
将Nafl第552位的酪氨酸(Y)突变为F (苯丙氨酸)，构建Nafl的突变体，命名 为麵Y552F。
将该突变体和p85共转染进293，用免疫共沉淀去检测，结果如图4C所示。 根据图4C的结果，Nafl第552位的突变使Nafl失去了和p85结合的能力。 再将突变体NaflY552F、 p85、 PSGL-1共转染进293细胞，用抗PSGL-1多抗去免 疫印迹检测，结果见图4D。根据图4D的结果，第552位的突变使Nafl失去了作为转接蛋白介导PSGL-1和p85 结合的能力。
NaflY552F突变体阻止了 552位Y的磷酸化，因而该位点的磷酸化对于Nafl与p85 的结合是关键的。
3.3、人的中性粒细胞中，Nafl第552位的酪氨酸磷酸化，诱导PSGL-1和PI3K的 p85的结合
3.3.1、 在人的中性粒细胞中，Nafl介导PSGL-1和p85的结合 分离人中性粒细胞后，分别将人中性粒细胞和对照缓冲液PBS (-) ，1(Vg/ml的人IgG
(hlgG)或P-selectinRg (P-Rg)在37。C孵育20分钟，用细胞裂解液裂解。取细胞裂 解上清，用抗PSGL-1多抗免疫共沉淀，沉淀物用抗p85多抗免疫印迹检测，结果见图 5A。
根据图5A的结果，p85只有从P-Rg刺激后的中性粒细胞中才能免疫共沉淀下来(从 图中可看出结合下来的p85量不多，这和p85和细胞中很多蛋白都结合相一致)，而从加 PBS或人IgG的中性粒细胞中不能被免疫共沉淀下来。抗PSGL-1多抗免疫沉淀下来的 PSGL-1作为对照可以被KPL-1免疫印迹检测到，细胞裂解上清直接用抗p85多抗免疫 印迹检测作为对照。
在使用原髓样白血病细胞株HL-60重复上述实验时，能完全重复上述实验的结果。 根据上述实验结果，作为P-selectin配体的PSGL-l，和P-Rg结合后，传递活化信号 到细胞内将PI3K的p85亚基聚集并结合到其胞内区，也就是说P-selectin能在人中性粒 细胞中触发PSGL-l/Nafl/p85复合物的形成，即在人的中性粒细胞中，Nafl作为转接蛋 白介导PSGL-1和p85的结合。
3.3.2、 Nafl第552位的酪氨酸磷酸化，诱导PSGL-1和p85的结合 采用与实施例3.3.1相同的条件，分别用人IgG (hlgG)或P-selectin Rg (P-Rg)刺
激人中性粒细胞，再将细胞直接用还原性上样缓冲液煮沸5分钟，然后分别使用针对Nafl 第552酪氨酸磷酸化的特异性单抗3B8和对照单抗5C4进行免疫检测，结果如图5B所 示。
根据图5B的结果，Nafl第552位的酪氨酸磷酸化明显增强。将人中性粒白细胞用人IgG或P-Rg刺激20分钟后，用抗PSGL-1多抗或免疫前兔 IgG从细胞裂解液上清中去免疫共沉淀PI3K，然后去测免疫沉淀物的激酶活性，结果如 图5C所示。
根据图5C的结果，当P-Rg刺激时，用抗PSGL-1多抗免疫沉淀下来的沉淀物的激 酶活性比用人IgG刺激时增强，即P-selectin能增强人中性粒白细胞中PI3K激酶的活性。
图5D为根据图5C的结果取三次实验结果的平均，标准偏差也同时标出(用t-test 检验，其中*表示p〈0.05)。
用Src激酶的特异抑制剂PP2先和细胞室温孵育15分钟，再用P-Rg刺激中性粒白 细胞10分钟，对照用其溶剂DMSO，然后用Nafl的抗体将Nafl免疫沉淀下来。用抗 Nafl第552酪氨酸磷酸化的特异单抗3B8免疫检测，同一张膜再用对照抗体5C4免疫检 测，结果如图5E所示。
根据图5E的结果，PP2能抑制Nafl第552位酪氨酸的磷酸化。
白细胞同上处理，细胞裂解后，用抗PSGL-1多抗免疫共沉淀，沉淀物用抗p85多 抗免疫印迹检测，结果如图5F所示。
根据图5F的结果，当使用PP2抑制Nafl第552位酪氨酸的磷酸化时，同时也能抑 制P-selectin诱导的PSGL-1和p85亚基的结合。
白细胞刺激后直接裂解，裂解液分别用Src抗体和抗Src416位酪氨酸磷酸化抗体免 疫检测(能识别中性粒白细胞中的Hck， Lyn的416酪氨酸磷酸化)，结果如图5G所示。
根据图5G的结果，P-Rg刺激能活化Src激酶。
上述实施例3.3中的实验结果显示，人的中性粒细胞中，Nafl第552位的酪氨酸磷 酸化，诱导PSGL-1和PI3K的p85的结合。
实施例4、 P-selectin结合PSGL-l，通过Nafl活化p85，进而活化otMP2整合素 4.1 、 PI3K参与从P- selectin到06[^2活化的信号通路
将P-Rg预先和GlF (ab') 2 (Gl是P-selectin向白细胞粘附的阻断性单体)或PS1 F (ab，) 2 (PSl是P-selectin向白细胞粘附的非阻断性单抗)在PBS缓冲液(lxPBS,lmM CaCl2, lmMMgCl2)室温孵育15分钟后，进行细胞粘附实验。
根据细胞粘附实验结果，Gl能中和P-selectinRg诱导的活化(白细胞的粘附增强)， 而PSl则对P-sdectinRg诱导的活化没影响，说明该活化是P-sdectinRg和PSGL-l结合特异 引导的。将人中性粒细胞预先和44a (44a是P2亚基的粘附阻断性单抗)或9E10 (作为44a的亚 型对照抗体)在PBS缓冲液(lxPBS, lmMCaCl2, 1 mMMgCl2)室温孵育15分钟后，进 行细胞粘附实验。
根据细胞粘附实验结果，44a能阻断人中性粒白细胞向固化的血纤蛋白原粘附的增
强，而9E10没影响，证明(XMP2在该过程中具有特异性。
当细胞预先和PI3K的特异性抑制剂wortmannin， LY294002和PP2孵育时，P-Rg诱导 的人中性粒白细胞向固化的血纤蛋白原的粘附增强被抑制，对照DMSO没影响，说明PI3K 参与从P- sdectin到aMp2活化的信号通路。以上实验结果如图6A所示。
根据上述实验结果，P-selectinRg能增加人中性粒白细胞或HL-60向固化的血纤蛋白 原(fibrinogen)的粘附，而对照人IgG则不能。
4.2、 Nafl参与P-选择素活化(XMP2整合素的信号通路
在HL-60细胞中，分别转染Sl和S4后，用相应抗体对Nafl、 PSGL-1、 aM、 p85 和tubulin进行免疫印迹检测，结果如图6B所示。
根据图6B结果，当内源的Nafl表达被抑制下去时，PSGL-1， p85, ocM的表达不受 影响。
再用流式细胞术实验对其进行验证，结果如图12所示。
根据图12结果，在内源的Nafl表达被抑制下去时，HL-60细胞表面的PSGL-1和 ocM亚基的表达以及P-Rg和PSGL-l的结合不受影响。
同时，用Sl和S4在293T细胞中也得到了和在HL-60中同样的抑制结果，结果如 图6B所示。
在内源的Nafl表达被抑制下去时，用免疫共沉淀检测了 PSGL-1和p85亚基的结合 情况，结果如图6C所示。
根据图6C的结果，当内源的Nafl表达被抑制下去时，在P-Rg的刺激条件下，PSGL-1 和p85亚基的结合和对照相比明显减弱，和图4A的结果相一致，说明Nafl在PSGL-1 和p85亚基的结合中起转接蛋白的作用。
在HL-60细胞中分别转染Sl和S4，再分别不刺激、P-Rg刺激和hlgG刺激的情况 下，进行细胞粘附实验，结果如图6D所示。根据图6D的结果，当HL-60细胞中的内源性Nafl被转染S4抑制下去时，P-Rg刺
激不能活化0CmP2，而转染对照S1的细胞则不受影响。
将S4和Nafl表达质粒共同转染HL-60后，再进行细胞粘附实验。 结果显示，相对于单转S4抑制Nafl后，粘附细胞数有一定程度的恢复增加。 综合以上实验结果得出了以下结论Nafl作为转接蛋白介导PSGL-1和p85亚基的
结合，传递了从PSGL-1到p85的细胞内活化信号，在P-选择素活化ocMP2整合素的信号
通路中起重要作用。
实施例5、 Nafl第552位酪氨酸的磷酸化对其传递P-选择素活化aM(32整合素的信号 起关键作用
参考操作手册，使用ViraPower lentiviral expression systems (invi加gen公司)，将突 变体NaflY552F构建成病毒颗粒，同时构建带LacZ基因的病毒颗粒做为对照。将带 Nafl Y552F的病毒颗粒感染HL-60细胞，并检测了其表达，结果如图7A所示。
根据图7A的结果，PSGL-1， p85,ctM的表达不受NaflY552F过表达的影响。
并用流式细胞术实验进行了检测，结果如图10所示。
根据图10的结果，当NaflY552F过表达时，HL-60细胞表面的PSGL-1和ctM亚基 的表达以及P-Rg和PSGL-1的结合不受影响。
当在HL-60细胞中过表达NaflY552F时，用免疫共沉淀检测了 PSGL-1和p85的结 合情况，结果如图7B所示。
根据图7B的结果，过表达的NaflY552F，能阻断PSGL-1和p85的结合。该结果说 明，突变体NaflYS5SF具有显性失活(dominant-negative)作用。
再用细胞粘附实验检测过表达NaflY552F的HL-60細胞上ocmP2整合素的活化情况， 结果如图7C所示。
根据图7C的结构，过表达NaflY552F的细胞，P-Rg刺激不能增加细胞向铺有 fibrinogen的板上的粘附，过表达LacZ基因的HL-60细胞和正常细胞一样。该结果说明， 过表达NaflY552F时，阻断了 P-选择素活化aM(32整合素的信号通路。
以上实验结果证明突变体NaflY552F能阻断&选择素活化0^(32整合素的信号通路， Nafl第552位酪氨酸的磷酸化在该通路中起关键作用。综合实施例l-5的结果，揭示了一条新的信号通路P-选凝素结合PSGL-1引起02 整合素的活化。PSGL-1向胞内传递信号依赖其胞内区和Nafl的组成性结合，P-选凝素 结合其配体PSGL-1后活化Src激酶，Src激酶磷酸化Nafl YPPM结构域上第552位的酪 氨酸，磷酸化后的YPPM结构域能结合PI3K的p85亚基，通过PI3K最终从内到外传递 信号使整合素ocm(32和aU32使处于活化状态。
由于，P-选择素介导的血小板与内皮细胞间，以及这些细胞与白细胞之间的细胞黏 附，是炎症和血栓形成病理生理过程中的基本现象和共同过程。通过各种途径和药物抑 制和调节P-选择素及其介导的细胞黏附与作用，已证明可成为炎症和血栓性疾病的有效 防治手段。同时，抗黏附治疗不失为一种防治手段，具有良好的临床应用价值和前景。 而且，(i2整合素的活化对于炎症及血栓性疾病中白细胞在血管内皮表面的粘附起着关键 的作用。因此，根据实施例l一5的结果，可将蛋白Nafl和PSGL-1作为靶标用于筛选 治疗炎症和/或血栓性疾病的药物以及用作炎症和/或血栓性疾病药物的药物耙标，筛选特 异性抗体以及含有蛋白Nafl和/或PSGL-1的特异性抗体的、用于治疗炎症和/或血栓性 疾病的药物，和以蛋白Nafl和/或PSGL-l为药物靶标的、用于治疗炎症和/或血栓性疾 病的药物。
针对Nafl和域PSGL-1设计肽段阻断此信号通路，很可能可以抑制P-选凝素引起的 P2整合素的活化。以下实验即对该设想进行了验证。
实施例6、 PSGL-1胞内区肽段的构建和表达
表达并纯化了 PSGL-1胞内区的6xHis融合多肽(PSGL-1 P)，带有HIV病毒Tat序 列的胞内区融合多肽(Tat-PSGL-1)和带有R345A，N346A,Y347A,P349A突变的胞内区 融合多肽(Tat-PSGL-1 Mut)，上述多肽的示意图见图8A。
将上述多肽标记FITC，然后和分离的小鼠中性粒白细胞孵育，用共聚交显微镜观察， 结果如图8B所示。
根据图8B的结果，细胞能将带有Tat序列的融合多肽吞进细胞。
再用上述多肽分别结合人和小鼠中性粒白细胞裂解液中的Nafl，结果如图8C， 8D， 8E所示。
根据图8C， 8D的结果，PSGL-1 P和Tat-PSGL-l能将Nafl结合下来，而突变体 Tat-PSGL-l Mut则不能。根据图8E的结果，和Tat-PSGL-l Mut相比，PSGL-1 P和 Tat-PSGL-l还能竞争白细胞裂解液中内源性的PSGL-1和Naf 1的结合。
上述实验结果显示，表达的融合多肽Tat-PSGL-l具有进入细胞并结合Nafl的功能。实施例7、 PSGL-1胞内区肽段能在体外阻断P-选择素活化(32整合素
将上述肽段(PSGL-1 P、 Tat-PSGL-l和Tat-PSGL-l Mut)和分离的白细胞预先孵育， 然后进行细胞粘附实验，结果如图9A所示。
根据图9A的结果，Tat-PSGL-l能明显抑制P-Rg诱导的人中性粒白细胞向fibrinogen 板上的粘附，而PSGL-1 P因不能进细胞而没有抑制作用，Tat-PSGL-l Mut虽然能进细 胞，但不能阻断内源PSGL-1和Nafl的结合而没有抑制作用。
在小鼠中性粒白细胞和小鼠fibrinogen的板上重复了上述实验，均获得了同样的结 果，如图9B所示。
做为对照，多肽和细胞的孵育并不影响小鼠中性粒白细胞表面PSGL-1和otM亚基的 表达以及鼠P-Rg和PSGL-l的结合，结果如图11A， B， C所示。
根据图11A， B， C的结果，P-Rg刺激能增强人中性粒白细胞向ICAM-l板的粘附， 而这种增强能被p2亚基的阻断抗体IB4完全阻断，ocm和(^的阻断抗体CBRM1/5和38 都只能部分阻断，当两种抗体共同作用时，才能完全阻断，而抗体亚型对照没有任何影 响。以上结果说明，P-Rg对(xm(32和aU32这两种整合素都能活化。
Tat-PSGL-l能完全抑制P-Rg诱导的人中性粒白细胞向ICAM-1板上的粘附，而对照 PSGL-1 P和Tat-PSGL-l Mut则没有影响，以上结果如图9C所示。
上述实验结果，显示PSGL-l信号通路对(XMp2和ocU32的活化都起作用。
实施例8、 PSGL-1胞内区肽段能在体内阻断P-选择素活化(32整合素
将PSGL-1胞内区融合多肽预先静脉注射入小鼠体内，30分钟后观察因手术引起的
白细胞在血管壁上的滚动和粘附，以(xm和aL的阻断抗体Ml/70和M17/4作为对照，结
果如图9D所示。
根据图9D的结果，和对照小鼠相比，融合多肽不影响白细胞的滚动，而Tat-PSGL-l 能明显减少血管壁上粘附的白细胞数，PSGL-1 P和突变体Tat-PSGL-l Mut则不影响粘 附的白细胞。ocm和ocl的阻断抗体M1/70和M17/4不影响白细胞滚动，对粘附有一定影 响，两者结合抑制效果较明显，小鼠P-selectin的阻断性单抗RB40.34对滚动和粘附都有 明显抑制作用，亚型对照抗体则没有作用。
根据上述实验结果，手术造成的白细胞的滚动和粘附是依赖于P-selectin的，而且除 可介导白细胞滚动的功能外，PSGL-l还可以介导信号通路，从而活化整合素，因而在体 内具有重要功能。^Mii、在小鼠急性腹膜炎模型中PSGL-1胞内区肽段能在体内阻断P-选择素活化
P2整合素
进行小鼠急性腹膜炎模型实验，结果如图9E所示。
根据图9E的结果，在小鼠急性腹膜炎模型中，相对于对照PSGL-1 P以及突变体 Tat-PSGL-l Mut ， Tat-PSGL-l能明显减少白细胞向腹腔的浸润，作为对照，M1/70和 M17/4共同注射和RB40.34也能明显减少白细胞的浸润，亚型对照抗体则没有作用。 上述实验结果说明，白细胞向腹腔的浸润依赖ocM， ocL和P-selectin。 根据上述实验结果，通过肽段Tat-PSGL-l特异性地抑制PSGL-1和Naf 1的结合，从 而阻断PSGL-1介导的整合素的活化，可以在体内抑制炎症反应。
实施例10、 P-选凝素恢复P-选凝素敲除小鼠中的深静脉血栓
分别结扎P-选凝素敲除小鼠和对照C57小鼠，以造深静脉血栓，2天后检测血栓长 度和重量，并根据血栓的质量长度比作图，结果如图13所示。
根据图13的结果，P-选凝素敲除小鼠中诱导出的深静脉血栓要比对照小鼠C57轻。
然后，将小鼠P-Rg和对照蛋白12CA5分别以静脉注射的方式注射进P-选凝素敲除 小鼠体内，然后结扎小鼠下腔静脉，以造深静脉血栓，2天后检测血栓长度和重量，并根 据血栓的质量长度比作图，结果如图13所示。
根据图13的结果，向P-选凝素敲除小鼠中静脉注射mP-Rg后，小鼠的深静脉血栓 得以恢复，而注射对照蛋白12CA5则没有恢复作用。
上述结果说明，P-selectin在深静脉血栓中起重要作用，有可能针对其信号通路抑制 深静脉血栓。
实施例U、阻断性多肽抑制小鼠深静脉血栓
将多肽Tat-PSGL-l和突变多肽Tat-PSGL-l Mut分别以静脉注射的方式注射进小鼠体 内，然后结扎小鼠下腔静脉，以造深静脉血栓，2天后检测血栓长度和重量，同时，以注 射生理盐水的小鼠作为对照，并根据血栓的质量长度比作图，结果如图14所示。
图14的结果表明，体内注射肽段Tat-PSGL-l能明显抑制小鼠的深静脉血栓，而多 肽Tat-PSGL-l Mut对小鼠的深静脉血栓没有抑制作用。综合实施例6—10的结果，阻断PSGL-1和Nafl结合后，在体内和体外都能阻断 P-selectin所诱导的整合素活化，同时，在体内也能减弱炎症反应，并能抑制深静脉血栓 的生成。这条信号通路具有重要的生理功能。该信号通路中的关键性蛋白，如PSGL-1 和Nafl，可作为筛选针对这条信号通路拮抗剂的靶标，从而研制获得炎症和/或血栓性疾 病的药物。
另夕卜，Nafl上第17个外显子对PSGL-1和Nafl的结合起关键作用，因此，对于本 领域的工作人员来说，针对该外显子设计阻断蛋白是显而易见的，例如，在Nafl的594-626 位的氨基酸的基础上加上一个来自HIV病毒转录反式作用子的蛋白转导序列(HIVTat)， 因此也是本发明所要求保护的。序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120> —种炎症和血栓药物的靶标，以及针对该耙标的药物
<130> P5081028
<160> 6
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 2801
<212> DNA
<213> Human
<400> 1
agtgagccga ggagccttca tagggacagc cgcccctggt gcacacaccc tcgtattctc 60
ctgcccttcc ccagccaggc gggcaccacg gcaggggctg agctaccctc atggaaggga 120
gaggaccgta ccggatctac gaccctgggg gcagcgtgcc ctcaggagag gcatccgcetg 180
cttttgagcg cctagtgaag gagaattccc ggctgaagga aaaaeitgcaa gggataaaga 240
tgttagggga gcttttggaa gagtccc卿tggaagcgac caggctccgg cagaaggcag 300
aggagctagt gaaggacaac gagctgctcc caccaccttc tccctccttg ggctccttcg 360
accccctggc tgagctcaca ggaaaggact caaatgtcac agcatctccc acagcccctg 420
catgccccag tgacaagcca gcaccagtcc agaagcctcc atccagtggc acctcctctg 480
aatttgaagt ggtcactcct gaggagcaga attcaccaga gagcagcagc catgccaatg 540
cgatggcgct gggccccctg ccccgtgagg acggcaacct gatgctgcac ctgcagcgcc 600
tggagaccac gctgagtgtg tgtgccgagg agccggacca cggccagctc ttcacccacc 660
tgggccgcat ggccctggag ttcaaccgac tggcatccaa ggtgcacaag aatgagcagc 720
gcacctccat tctgcagacc ctgtgtgagc agcttcggaa ggagaacgag gctctgaagg 780
ccaagttgga taagggcctg gaacagcggg atcaggctgc cgagaggctg cgggaggaaa 840atttggagct c犯g犯gttg ttgatgagca atggcaacaa agagggtgcg tctgggcggc 900
caggctcacc gaagatggaa gggacaggca agaaggcagt ggctggacag cagcaggcta 960
gtgtgacggc鄉taaggtc cc卿ggtgg tggccUggg cgcagccgag a卿aggtga 1020
agatgctgga gcagc已gcgc agtgagctgc tggaagtg幼caagcagtgg gaccagcatt 1080
tccggtccat gaagcagcag tatgagcaga agatcactga gctgcgtcag aagctggctg 1140
atttgcag犯gcaggtgact gacctggagg ccgagcggga gcagaagcag cgtgactttg 1200
accgcaagct cctcctggcc aagtccaaga ttgaaatgga ggagaccgac aaggagcagc 1260
tgacagcaga ggccaaggag ctgcgccaaa aggtcaagta cctgcaggat cagctgagcc 1320
csctcacccg acagcgtgag taccagga朋3ggsgatcca gcggctc犯c犯ggccctgg 1380
aggaagcact gagcatccaa accccgccat catctccacc aacagcattt gggagcccag 1440
33ggagcagg ggccctccta aggaaacagg agctggtcac gcagaatgag ttgctgaaac 1500
agcaggtg犯gatcttcgag gaggacttcc agagggagcg cagtgatcgt gagcgcatgei 1560
atgaggagaa ggaagagctg犯gaagcaag tggagaagct gcaggcccag gtcaccctgt 1620
caaatgccca gctaaaagca ttcaaagatg aggagaaggc aagagaagcc ctcagacagc 1680
agaagaggaa agcaaaggcc tcaggagagc gttaccatgt ggagccccac ccagaacatc 1740
tctgcggggc ctacccctac gcctacccgc ccatgccagc catggtgcca caccatggct 1800
tcgaggactg gtcccagatc cgctaccccc ctccccccat ggccatggag cacccgcccc 1860
cactccccaa ctcgcgcctc ttccatctgc cggaatacac ctggcgtcta ccctgtggag 1920
gggttcgaaa tcc犯atcag agctcccaag tgatggaccc tcccacagcc aggcctacag 1980
aaccagagtc tccaaaaaat gaccgtgagg ggcctcagtg agaccagatt gtgtcatttg 2040
gctccacctt catcttgcag agccagctga tctcagattg ccaag犯act ag朋gccact 2100
tgcacggtgt ggcc卿gcc tcagctggat g卿ggctga gatgggtggc cagcttgtat 2160accagtccct gaactgagct gtttacagga ctggggaggc tccacccaga aggctttcat 2220
ttgtactctg ctgggagtga ctgggaaaaa ctccttccct gctgctgagt ggagagaggc 2280
ctcatccggc tttgacccac catccgttgc agaagcctcc aggagcagca atcctaagag 2340
tgggaggcag ccaagacccc cttccttcaa aacctcccgg aagtggtttc aggccctcta 2400
gttgccatga ccaatttgtg tgtgtgttta atttttgctt caagctctgt agcaggacct 2460
gccccacgca cacccctacc cctctgtgag gagctgtggg aagtgtgggt ttgtctccag 2520
aacagaagag犯tgatggat attctggctc tggggccctc tccaccacca ctcacagtag 2580
ccttgctgaa gccatcacag atgggagaag gccatgccag ccacgtccgc cgaggggcgc 2640
cagcctgaag ctgccaggcc ctgaggttca gaccctggac cccatagctg gaggcctgtg 2700
gtgccagaag cccagattag ggtggctgtc catccctgga tagctatttg cacgaatcat 2760
ggacataa3t cc犯gttgsa g犯g犯犯aa a犯a犯a^朋a 2801
〈210〉 2 〈211〉 2550 〈212〉 DNA 〈213〉 H腿n
〈400〉 2
acacacagcc attgggggtt gctcggatcc gggactgccg cagggggtgc cacagcagtg 60
cctggcagcg tgggctggga ccttgtcact犯agcagaga agccacttct tctgggccca 120
cgaggcagct gtcccatgct ctgctgagca cggtggtgcc atgcctctgc aactcctcct 180
gttgctgatc ctactgggcc ctggcaacag cttgcagctg tgggacacct gggcagatga 240
agccgagaaa gccttgggtc ccctgcttgc ccgggaccgg agacaggcca ccgaatatga 300
gtacctagett tatgeitttcc tgccagaaac ggagcctcca gaaatgctga ggaacagcac 360
tgacaccact cctctgactg ggcctgg犯c ccctgagtct accactgtgg agcctgctgc 420
a鄉cgttct actggcctgg atgcaggagg ggcagtcaca gagctg織a cggagctggc ■caacatgggg aacctgtcca cggattcagc agctatggag atacagacca ctcaaccagc 540
agccacggag gcacagacca ctccactggc agccacagag gcacagacaa ctcgactgac 600
ggccacggag gcacagacca ctccactggc agccacagag gcacagacca ctccaccagc 660
agccacggaa gcacagscca ctc犯cccac aggcctggag gcacagaccs ctgcaccagc 720
agccatggag gcacsgacca ctgcaccagc sgccatggaa gcacagacca ctccaccagc 780
agccatggag gcacagacca ctcaaaccac agccatggag gcacagacca ctgcaccaga 840
agccacggag gcacageicca ctc犯cccac agccacggag gcacagacca ctccactggc 900
agccatggag gccctgtcca cagaacccag tgccacagag gccctgtcca tggaacctac %0
taccaa犯ga ggtctgttcs tacccttttc tgtgtcctct gttactcaca agggcattcc 1020
catggcagcc agcaatttgt ccgtcaacta cccagtgggg gccccagacc acatctctgt 1080
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cactgtggtg ctggcggtcc gcctctcccg caagggccac atgtaccccg tgcgtaatta 1200
ctcccccacc gagatggtct gcatctcatc cctgttgcct gatgggggtg aggggccctc 1260
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ggaggaccgt gagggggatg acctcaccct gcacagcttc ctcccttagc tcactctgcc 1380
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g犯ctctggc cacccaaaca ggacaagagc agcctggggc caagcagacg ggcaagtgga 1560
gccacctctt tcctccctcc gcggatgaag cccagccaca tttcagccga ggtccaaggc 1620
aggaggccat ttacttgaga cagattctct cctttttcct gtcccccatc ttctctgggt 1680
ccctctaaca tctcccatgg ctctccccgc ttctcctggt cactggagtc tcctccccat 1740
gtacccaagg aagatggagc tcccccatcc cacacgcact gcactgccat tgtcttttgg 1800ttgccatggt caccaaacag gaagtggaca ttctaaggga ggagtactga agagtgacgg 1860
acttctgagg ctgtttcctg ctgctcctct gacttggggc agcttgggtc ttcttgggca 1920
cctctctggg aaaacccagg gtgaggttca gcctgtgagg gctgggatgg gtttcgtggg 1980
cccaagggca gacctttctt tgggactgtg tggaccaagg agcttccatc tagtgacaag 2040
tgacccccag ctatcgcctc ttgccttccc ctgtggccac tttccagggt ggactctgtc 2100
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acgatagcgg aatccttcaa ggtttcaagg ctgtctcctt caggcagcct tcccggaatt 2220.
ctccatccct cagtgcagga tgggggctgg tcctcagctg tctgccctca gcccctggcc 2280
ccccaggaag cctctttcat gggctgttag gttgacttca gttttgcctc ttggacaaca 2340
gggggtcttg tacatccttg ggtgaccagg aaaagttcag gctatggggg gccaaaggga 2400
gggctgcccc ttccccacca gtgaccactt tattccactt cctccattac ccagttttgg 2460
cccacagagt ttggtccccc ccaaacctcg gaccaatatc cctctaaaca tcaatctatc 2520
CtCCtgtt肪8g3aa3犯aa 2550
<210> 3
〈211〉 69
〈212〉 PRT
〈213〉 Human
〈400〉 3
Arg Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro 15 10 15
Thr Glu Met Val Cys lie Ser Ser Leu Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly 20 25 30
Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lys Ala Lys Ser Pro Gly 35 40 45
Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu 50 55 60His Ser Phe Leu Pro 65
〈210〉 4
<211〉 119
〈212〉 PRT
〈213〉 Human
〈400〉 4
Met His His His His 1 5
Gly Met Lys Glu Thr 20
Ser Pro Asp Leu Gly 35
Gly Ser Arg Leu Ser 50
Ser Pro Thr Glu Met 65
Glu Gly Pro Ser Ala 85
Pro Gly Leu Thr Pro 100
Thr Leu His Ser Phe 115
〈210〉 5
<211> 102
〈212〉 PRT
〈213> Human
<400> 5
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Tyr Gly Arg Lys 15 10 15
His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser 10 15
Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gin His Met Asp 25 30
Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp lie 40 45
Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Arg Asn Tyr 55 60
Val Cys lie Ser Ser Leu Leu Pro Asp Gly Gly 70 75 80
Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lys Ala Lys Ser 90 95
Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu 105 110
Leu ProLys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp lie Gly 20 25 30
Ser Arg Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Arg Asn Tyr Ser 35 40 45
Pro Thr Glu Met Val Cys lie Ser Ser Leu Leu Pro Asp Gly Gly Glu
50
55 60
Gly Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lys Ala Lys Ser Pro
65
70 75 80
Gly Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu Thr 85 90 95
Leu His Ser Phe Leu Pro 100
〈210〉 〈211〉 <212> <213>
6
102 PRT Hum抑
〈400〉 6
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Tyr Gly Arg Lys 15 10 15
Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp lie Gly 20 25 30
Ser Arg Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Ala Ala Ala Ser 35 40 45
Ala Thr Glu Met Val Cys lie Ser Ser Leu Leu Pro A印Gly Gly Glu 50 55 60
Gly Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lys Ala Lys Ser Pro 65 70 75 80
Gly Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu Thr 85 90 95
Leu His Ser Phe Leu Pro 100
权利要求
1、蛋白Naf1的应用，其特征在于，作为靶标用于筛选治疗炎症和/或血栓性疾病的药物。
2、 蛋白Nafl的应用，其特征在于，用作炎症和/或血栓性疾病药物的药物耙标。
3、 蛋白PSGL-1的应用，其特征在于，作为耙标用于筛选治疗炎症和/或血栓性疾病 的药物。
4、 蛋白PSGL-1的应用，其特征在于，用作炎症和/或血栓性疾病药物的药物耙标。
5、 如权利要求1一4中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物阻断磷脂酰肌醇3 位激酶PI3K的p85亚基结合到PSGL-1的胞内区。
6、 如权利要求l一4中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物阻断Nafl上第552 位的酪氨酸的磷酸化。
7、 如权利要求l一4中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物阻断Nafl和PSGL-1 的胞内区结合。
8、 一种蛋白Nafl的特异性抗体。
9、 一种治疗炎症和/或血栓性疾病的药物，其特征在于，所述药物含有如权利要求8 所述的抗体。
10、 一种蛋白PSGL-1的特异性抗体。
11、 一种治疗炎症和/或血栓性疾病的药物，其特征在于，所述药物含有如权利要求 IO所述的抗体。
12、 一种治疗炎症和/或血栓性疾病的药物，其特征在于，所述药物以蛋白Nafl为 药物耙标。
13、 一种治疗炎症和/或血栓性疾病的药物，其特征在于，所述药物以蛋白PSGL-1 为药物耙标。
14、 一种能阻断Nafl和PSGL-l的胞内区结合的肽段，其特征在于，所述肽段具有 SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列。
15、 如权利要求14所述的肽段，其特征在于，所述肽段在体内进一步阻断P-选择素所诱导的整合素e2的活化。
16、 如权利要求14或15所述的肽段，其特征在于，所述肽段在体内抑制P-选择素 及其介导的细胞黏附与作用。
17、 如权利要求14一16中任一项所述的肽段用于制备治疗炎症和/或血栓性疾病的 药物的应用。
18、 如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述的肽段阻断Nafl和PSGL-1胞 内区的结合。
19、 如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述的肽段在体内进一步阻断P-选择 素所诱导的整合素P 2的活化。
20、 如权利要求17—19中任一项所述的应用，其特征在于，所述肽段抑制P-选择素 及其介导的细胞黏附与作用。
21、 一种源于Nafl第17个外显子的肽段，其特征在于，所述肽段包含SEQIDNO: 1上594-626位氨基酸序列。
22、 如权利要求21所述的肽段，其特征在于，所述肽段还可以包含转导序列。
23、 如权利要求22所述的肽段，其特征在于，所述转导序列为为HIVTat。
24、 如权利要求21-23中任一项所述的肽段，其特征在于，所述肽段阻断PSGL-1和 Nafl的结合。
全文摘要
本发明提供了蛋白Naf1和/或PSGL-1作为靶标用于筛选治疗炎症和/或血栓性疾病的药物以及用作炎症和/或血栓性疾病药物的药物靶标的用途，蛋白Naf1和/或PSGL-1的一种特异性抗体以及含有蛋白Naf1和/或PSGL-1的特异性抗体的药物，以及以蛋白Naf1和/或PSGL-1为药物靶标的、用于治疗炎症和/或血栓性疾病的药物，还提供了一种能阻断Naf1和PSGL-1的胞内区结合的肽段以及上述肽段用于炎症和/或血栓性疾病药物的应用。本发明提供的肽段能减弱白细胞的粘附，并能抑制体内的炎症反应，同时，也为免疫损伤、炎症、血栓形成及肿瘤转移等疾病的治疗提供新的方法。
文档编号G01N33/15GK101315385SQ200810098830
公开日2008年12月3日 申请日期2008年5月15日 优先权日2007年5月29日
发明者雷 张, 涛 徐, 徐维丽, 王尽淘, 王海波, 耿建国, 铭 陈 申请人:中国科学院上海生命科学研究院