专利名称：：高密度脂蛋白测定装置及分离方法
技术领域：
：本发明涉及分离器具、特别是分离液体中特定成分的分离器具，更详细地，涉及分离血液等体液中的高密度脂蛋白(以下，简称为HDL)部分中所含有的特定成分，特别是分离脂质成分的分离器具，以及涉及在其测定中使用的高密度脂蛋白测定装置和HDL脂蛋白分离方法。
背景技术：
：例如，在特开平3-99268号公报中(专利文献1)中指示出HDL脂蛋白分离方法。血液中的HDL胆固醇是冠状动脉硬化症的危险预防因子，因此，在很多机构中，作为成人病预防检查的一环对其进行测定。对用于评价涉及冠状动脉性心疾病的程度的危险性的参数来说，血液、血浆及血清中的全胆固醇是已知的最佳参数之一。但是，全胆固醇的浓度是用于各个危险性评价的唯一的被限定的值。一方面，低密度的脂蛋白(低密度脂蛋白(LowDensityLipoprotein)=LDL)中的胆固醇测定比另一方面的高密度的脂蛋白(高密度脂蛋白(HighDensityLipoprotein)=HDL)中的胆固醇测定更有意义。根据免疫学和临床学的研究，了解到在LDL胆固醇和冠状动脉性心疾病之间有正的相关性，在HDL胆固醇和冠状动脉性心疾病之间有负的相关性。这样，由于相关性密切类似，因此，HDL和全胆固醇的测定对于危险性的评价是充分的。该方法现在在诊断中被优选使用。对于HDL胆固醇，将HDL脂蛋白从其他脂蛋白中分离后，利用酶法等测定上清(上清液)中的HDL胆固醇。为了独立测定HDL胆固醇，必须分离存在的其他的脂蛋白类(LDL、VLDL、乳糜微粒)。分离方法包括基于不同的表面电荷(以纸或琼脂糖作为载体的电泳)或载脂蛋白的差异(使用特异性抗体的免疫化学方法)的方法。此外，还有使用超离心力的方法、通过2价金属离子和聚阴离子使其他的脂蛋白沉淀来除去的方法。由于超离心法使用超离心机，使得操作烦杂且需要很多时间，因此，现在的测定中使用的分离法的主流是沉淀法。作为组合2价的金属离子和聚阴离子的聚阴离子沉淀剂，可以使用肝素-Ca2+、肝素-Mn"、磷钨酸-Mg"、葡聚糖硫酸-Mg"。使用这些聚阴离子沉淀剂的方法大致相同，如下所示。即，向血清中加入上述沉淀剂，放置5~20分钟(根据使用沉淀剂的不同而不同)，充分生成沉淀后，以3000rpm的条件，离心分离1015分钟。离心分离后，取出上清(HLD部分)，在37。C下通过月旦固醇显色反应或酶电极法来定量。专利文献1:日本特开平3-99268号公报
发明内容但是，正如上述中所述的那样，使用沉淀剂的HDL胆固醇的测定方法，除了生成沉淀以外还需要离心分离操作，因此，虽然不如超离心法麻烦，但还是被指出操作烦杂且耗费时间的缺点。即，即使离心分离的净需要时间是IO分钟，如果加上样品的转移、分离管的准备、取得离心分离的平衡、旋转速度的上升和减速等所必须的时间，则至少需要20分钟。另外，也可能产生样品的拿错。与上述沉淀法原理完全不同，作为实用化的方法有电泳法。该方法通过电泳分别分离HDL、LDL、VLDL，因此，是对HDL部分的胆固醇进行染色通过光密度测定法来定量的方法，但电泳和染色需要时间，即使高速化，其测定速度与沉淀法也无大差别。鉴于上述问题，本发明的目的是提供一种分离方法，该方法不具备复杂化的附加装置，通过简单的结构，就能从生物学的液体中迅速分离非-HDL脂蛋白。本发明的特征在于，使生物学的液体流过分离非-HDL脂蛋白的载体，从生物学的液体中分离非-HDL脂蛋白。根据本发明可以提供一种分离方法，该方法通过简单的结构就能够从生物学的液体中迅速地分离与夂-HDL脂蛋白。图1是本发明的实施例3所涉及的图，是表示试样容器和过滤器的分离器具等的图。图2是本发明的实施例3所涉及的图，是表示具备工作电极、参比电极的试样容器等的图。图3是本发明的实施例3所涉及的图，是表示高密度脂蛋白测定装置的图。图4是本发明的实施例3所涉及的图，是表示具备加压泵的试样容器和过滤器的分离器具等的图。图5是本发明的实施例3所涉及的图，是表示具备具备注射泵的试样容器和过滤器的分离器具等的图。图6是本发明的实施例3所涉及的图，是表示可以使用全血试样的具备工作电极、参比电极的试样容器等。图7是本发明的实施例3所涉及的图，是表示可以使用全血试样的具备加压泵的试样容器、和过滤器的分离器具等的图。图8是本发明的实施例3所涉及的图，是表示可以使用全血试样的具备注射泵的试样容器、和过滤器的分离器具等的图。符号说明1试样容器，2支撑体，3分离用过滤器，4试样注入容器，5工作电极，6参比电极，7试剂层，40数据处理部，20测定部，30信号处理部，50电位差测定装置，60试样注入岡，70加压泵连接阀，80阀支撑体，90微型泵，100注射泵，110注射器形试样容器，120电极支撑体具体实施例方式从本发明的实施例的概要进行说明。本发明的HDL脂蛋白的分离法的特征在于，向血清中添加聚阴离子沉淀试剂，生成LDL脂蛋白、VLDL脂蛋白、乳糜微粒的沉淀物，通过过滤器除去生成的沉淀物。另外，采用该分离法的HDL胆固醇的定量测定法的特征在于，以由上述分离法分离的HDL脂蛋白作为对象，通过比色法或酶电极法来进行定量测定。如上所述，在本发明中，从通过沉淀剂生成沉淀的LDL脂蛋白、VLDL脂蛋白、乳糜《鼓粒中，分离出未生成沉淀的HDL脂蛋白，然后，利用过滤器过滤法来代替以往的离心分离法来除去生成的沉淀物，分离血清中的HDL脂蛋白。作为过滤器，优选亲水性纤维素混合酯，使用孔径为0.8)im以下的材料。通过采用过滤器过滤法，能够简化以往的离心分离法的烦杂操作，缩短以往较长的必要时间。本发明的HDL胆固醇的测定法的基本原理为，为了从LDL脂蛋白、VLDL脂蛋白、乳糜微粒中分离血清中的HDL脂蛋白，而使用聚阴离子沉淀试验，用0.8pm以下的亲水性过滤器过滤生成的沉淀物，对于得到的HDL脂蛋白部分通过比色法或酶电极法进行定量测定。肝素-Ca沉淀剂、磷钨酸-Mg沉淀剂、葡聚糖硫酸Mg-磷钨酸Mg沉淀剂、等电点分离-磷钨酸沉淀剂这4种沉淀剂，由于HDL胆固醇测定的精度、正确性都很优异，因此可以被广泛用作聚阴离子沉淀剂，在本发明中，可以使用这4种中的任一种沉淀剂。通过使沉淀剂的溶液、乳浊液或悬浊液渗入过滤器，接着，进行干燥，将沉淀剂应用于过滤器。在该方法中，可以应用pH緩冲剂或表面活性剂等添加剂。可以举出通常市售的过滤器制品等。作为过滤器的材料，可以举出纤维素、尼龙、聚^5风等，优选纤维素，特别优选醋酸纤维素和硝酸纤维素的混合酯。过滤器的优选规格参数为，孔径0.8|tim以下、膜厚50400prn、膜重量3~10mg/cm2、流量(差压0,07Mpa)水90150ml/分/cm2。过滤器中，除了分离试剂，根据需要，可以添加表面活性剂、緩冲剂等。在进行过滤器的分离过滤的层中，滴下试样溶液时，通过分离试剂，使不供于测定的脂蛋白成分生成沉淀，被捕捉于构成层内。测定的HDL成分不生成沉淀，向下层渗透。特别是表面活性剂，能够有效地用于调节将液体试样应用于本发明的元件时的渗透速度等。作为可以使用的表面活性剂，不论离子性(阴离子性或阳离子性)、非离子性都可以使用，但非离子性表面活性剂更有效。作为非离子性表面活性剂的例子，例如可以举出酯型的丙三醇脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、醚型的聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯烷基醚、酯醚型的聚乙二醇脂肪酸酯等。这些表面活性剂能够调节液体试样对受答层的渗透速度。上述表面活性剂可以使用被广泛选择的物质，但相对于涂布液的重量可以使用最多10重量％左右。通过使试样与含有沉淀剂的载体接触，沉淀非-HDL脂蛋白。在不到l分钟之后，最优选大约10秒之后，完成沉淀物的形成，可以将该液体从载体物质中取出。通过利用重力，可以连续地或间断地进行该操作。可以通过本发明分离非-HDL脂蛋白的生物学的液体，特别是全血、血清及血浆。血液的全部类型，甚至全血，如果最初使用关于血球的分离块，就能够容易地使用。非-HDL脂蛋白的分离可以在60秒以下进行。涉及非-HDL脂蛋白的分离的本发明的方法，特别好的情况中，能够在涉及试验片上的HDL胆固醇的定量测定的方法中使用。因此，为了进行试验反应、例如涉及胆固醇的试验反应，使按照上述方法分离非-HDL脂蛋白的液体与必要的或/和有用的试剂接触。它们例如可以以膜或涂层的方式存在于多孔性载体上。这样的试剂方式的具体例子，对于所属
技术领域：
的技术人员来说是公知常识。以下，举出各个实施例来更具体地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。实施例1作为过滤器，将以亲水性纤维素混合酯为材料的、直径5mm的膜盘过滤器固定在支撑体上。固定试样容器，使其与过滤器接触。当向过滤器上添加样品时，经过过滤器渗出测定液，积存于试样容器中。测定装置是爱科来的spotchemsp-4430、在测定试剂中组合spotchem的HDL-纤维素试剂盒(葡聚糖硫酸镁沉淀法)来进行HDL定量。测定中使用的HDL纤维素试剂盒，作为HDL的分离法使用葡聚糖硫酸镁沉淀法，混合样品和沉淀试剂之后，利用离心分离来分离HDL。在使用过滤器的实施例中，省去该离心分离过程，将通过过滤器处理的HDL分离液作为样品直接使用，从而进行HDL定量。将50jilHDL分离试剂(爱科来)添加于50(ilCholestestNCalibrator(第一化学)，使非HDL脂蛋白沉淀。将沉淀液添加于过滤器中，采用爱科来的spotchemHDL胆固醇试剂盒，对渗出的溶液进行定量。在比较例中，以将沉淀液进行离心分离(3000rpm，10分钟)的液体作为样品，进行HDL定量。采用一片使用各种素材的过滤器，处理非HDL脂蛋白沉淀液，组合爱科来的spotchemsp_4430与spotchemHDL胆固醇试剂盒(葡聚糖」琉酸镁沉淀法)，进行HDL定量，其结果示于表l中。确认出使用亲水性纤维素混合酯(硝酸纤维素和醋酸纤维素)的过滤器即GN-4与沉淀法的测定偏差小，显示出优异的非HDL脂蛋白分离效果。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>除了对样品使用HDL标准试剂(和光纯药)以外，用与实施例l相同的条件进行研究。结果示于表2中。与实施例l同样，将GN-4作为过滤器使用的情况中，确认出与沉淀法的测定偏差小，显示出优异的非HDL脂蛋白分离效果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例3参照图1至8，说明涉及本发明的高密度脂蛋白测定装置的实施例。图l所示的有底筒状的试样容器l中，将支撑体2装卸自由地安装在其上。支撑体2具有圓筒状，在内侧底部具有分离用过滤器3。分离用过滤器3是以硝酸纤维素和醋酸纤维素的混合物为主要材料，该材料具有孔径为0.8pm以下的微细孔。使该分离用过滤器3含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂，形成载体。分离用过滤器3成为载体的基础材料。该载体成为分离器具。试样注入容器4中加入测定的试样。从试样注入容器4向作为载体的过滤器3中滴下试样。作为生物学的液体的试样流过分离用过滤器3，分离非-HDL脂蛋白，HDL脂蛋白流过分离用过滤器3，流向试样容器l。这样，通过采用使分离用过滤器3含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂的载体，可以从生物学的液体中迅速地分离非-HDL脂蛋白。另外，分离器具由分离用过滤器3的载体制造，因此，不具备复杂化的附加装置，是简单的结构。因此，操作性良好，可以简便容易地使用。图2、图3表示高密度脂蛋白测定装置。高密度脂蛋白测定装置具有测定部20、信号处理部30、数据处理部40。测定部20具有试样容器1、电位差测定装置50。试样容器1在内底侧设置与被测定的试样接触的工作电极5和参比电极6。试剂层7设置在工作电极5的上侧。该试剂层7与一皮测定的试样反应，有助于测定。最初，采用试样注入容器4向测定单元内注入作为生物学的液体的试样。试样溶液中的被沉淀分离的测定对象物质与和测定对象物质反应的试剂进行反应，在工作电极5的表面产生电荷。其结果为，工作电极5上的界面电位变化。由测定部20的电位差测定装置50进行电位测定，以实时方式监测由试样注入容器4注入试样前后的变化，由信号处理部30和数据处理部40来进行记录。工作电极5上的界面电位变化依赖于作为测定对象的测定物质的浓度。为电位变化值可以得到未知浓度的试样的浓度。试样注入容器4可以使用加压式送液装置。另外，为了降低生物成分测定时的夹杂物对电极表面的吸附所引起的影响，可以使直链高分子聚合物物理吸附在电极上来使用。作为直链高分子聚合物，可以使用甲基纤维素、丙烯酰胺、葡聚糖、聚乙二醇等。；、'i、'、'、'、、、、、、',化学反应的电位变化，参比电极6给予作为基准的电位。通常，作为参比电极6，可以使用将饱和氯化钾用作内部溶液的银/氯化银电极或甘汞(calomel)电极，在测定的试样溶液的组成一定的情况中，作为模拟电极(疑似電極)，可以只使用银/氯化银电极。图4表示加压型分离元件。有底筒状的试样容器1中，将支撑体2装卸自由地安装在上面。支撑体2具有筒形状，在内侧底部具有分离用过滤器3。试样容器的上部，将试样注入阀和加压泵连接阀组入阀支撑体，以夹入固定于支撑体的过滤器的方式与试样容器连接。加压泵连接阀上连接微型泵。分离用过滤器3是以硝酸纤维素和醋酸纤维素的混合物为主要的材料，其材料具有孔径为0.8!xm以下的微细孔。使该分离用过滤器3含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂，形成载体。分离用过滤器3是载体的基础材料。该载体成为分离器具。试样注入容器中加入要测定的试样。由试样注入容器4向试样注入部注入试样。此时，使微型泵工作，通过加压使作为生物学的液体的试样流过分离用过滤器3，分离非-HDL脂蛋白，HDL脂蛋白通过分离用过滤器3流向试样容器1中。这样，通过采用使分离用过滤器3含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂的载体，可以从生物学的液体中迅速分离非-HDL脂蛋白。图5表示负压型分离元件。采用注射器形试样容器，装卸自由地安装支撑体2。支撑体2具有筒形状，内侧底部具有分离用过滤器3。试样容器的上部中，试样注入阀被组入阀支撑体，以压住固定于支撑体的过滤器的形式连接于试样容器。试样容器的下部连接注射泵。分离用过滤器3是以硝酸纤维素和醋酸纤维素的混合物为主要的材料，其材料具有孔径为0.8(im以下的微细孔。使该分离用过滤器3含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂，形成载体。分离用过滤器3成为载体的基础材料。该载体成为分离器具。试样注入容器中加入要测定的试样。从试样注入容器4向试样注入部中注入试样。此时，使注射泵工作，通过负压使作为生物学的液体的试样流过分离用过滤器3，分离非-HDL脂蛋白，HDL脂蛋白通过分离用过滤器3流向试样六3谷焱。这样，通过采用使分离用过滤器3含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂的载体，可以从生物学的液体中迅速分离非-HDL脂蛋白。图6表示全血用一体型分析元件。在电极支撑体上，设置与分离用过滤器和与该过滤器接触的工作电极5以及参比电极6。试剂层7设置在工作电极5的上侧。由于使用全血试样而设置连接分离用过滤器的血球分离过滤器。试剂层7与被测定的试样反应，有助于测定。分离用过滤器3是以硝酸纤维素和醋酸纤维素的混合物为主要的试样，其材料具有孔径为0.8|mi以下的^i:细孔。血球分离过滤器可以举出通常市售的过滤器制品等。作为过滤器的材料，可以举出纤维素、尼龙、聚砜等。使分离用的分离用过滤器3含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂，形成载体。分离用过滤器3成为载体的基础材料。该载体成为分离器具。作为生物学的液体的全血试样被滴入血球分离过滤器时，血球被分离，血浆流过分离用的分离用过滤器3，分离非-HDL脂蛋白，HDL脂蛋白通过分离用分离用过滤器3。试样溶液中的被沉淀分离的测定对象物质与和测定对象物质反应的试剂进行反应，在工作电极5的表面生成电荷。其结果为，工作电极5上的界面电位变化。这样，通过采用使分离用过滤器3含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂的载体，可以从生物学的液体中迅速分离非-HDL脂蛋白。图7表示加压型全血一体型测定元件。在电极支撑体上设置分离用过滤器和与该过滤器接触的工作电极5以及参比电极6。试剂层7被设置在工作电极5的上侧。由于使用全血试样而设置连接于分离用过滤器的血球分离过滤器。在试样容器的上部，试样注入阀和加压泵连接阀被组入阀支撑体，以夹入固定于支撑体的过滤器的方式与试样容器连接。加压泵连接阀中连接微型阀。试剂层7与被测定的试样反应，有助于测定。试样注入容器中加入要测定的试样。由试样注入容器4向试样注入部注入试样。此时，使微型泵工作，通过加压使作为生物学的液体的试样流过分离用分离用过滤器3，分离非-HDL脂蛋白，HDL脂蛋白通过分离用分离用过滤器3。试样溶液中的被沉淀分离的测定对象物质与和测定对象物质反应的试剂进行反应，在工作电极5的表面生成电荷。其结果为，工作电极5上的界面电极变化。分离用分离用过滤器3是以硝酸纤维素和醋酸纤维素的混合物为主要的材料，其材料具有孔径为0.8pm以下的^:细孔。血球分离过滤器可以举出通常市售的过滤器制品等。作为过滤器的材料，可以举出纤维素、尼龙、聚砜等。使该分离用分离用过滤器3含有针对非-HDL脂蛋白的沉淀剂，形成载体。分离用分离用过滤器3成为载体的基础材料。该载体成为分离器具。这样，通过采用使分离用分离用过滤器3含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂的载体，可以从生物学的液体中迅速分离非-HDL脂蛋白。图8表示负压型全血用一体型分析元件。在电极支撑体上设置过滤器和与过滤器接触的工作电极5和参比电极6。试剂层7被设置在工作电极5的上侧。由于使用全血试样而设置连接于分离用过滤器的血球分离过滤器。在酶试剂层的下部连接微型泵。分离用过滤器3是以硝酸纤维素和醋酸纤维素的混合物为主要的材料，其材料具有孔径为0.8|im以下的微细孔。试样注入容器中加入测定的全血试样。由试样注入容器4向全血过滤器注入试样。此时，使微型泵工作，通过负压使作为生物学的液体的试样流过分离用过滤器3，分离非-HDL脂蛋白，HDL脂蛋白通过分离用过滤器3。试样溶液中的被沉淀分离的测定对象物质与和测定对象物质反应的试剂进行反应，在工作电极5的表面上产生电荷。其结果为，工作电极5上的界面电位变化。血球分离过滤器可以举出通常市售的过滤器制品。作为过滤器的材料，可以举出纤维素、尼龙、聚砜等。使该分离用过滤器3含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂，形成载体。分离用过滤器3成为载体的基础材料。该载体成为分离器具。这样，通过采用使分离用过滤器3含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂的载体，可以从生物学的液体中迅速分离非-HDL脂蛋白。权利要求1.一种分离方法，其特征在于，使生物学的液体流过分离非-HDL脂蛋白的载体，从生物学的液体中分离非-HDL脂蛋白。2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述载体含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂。3.—种分离器具，其特征在于，具有含有从生物学的液体中分离非-HDL脂蛋白的沉淀剂的载体。4.一种分离方法，其特征在于，使以硝酸纤维素和醋酸纤维素的混合物为材料的载体含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂，使生物学的液体流过含有沉淀剂的所述载体，从生物学的液体中分离非-HDL脂蛋白。5.—种分离方法，其特征在于，通过混合含有非-HDL脂蛋白的生物学的液体和针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂，进行非-HDL脂蛋白的沉淀工序，然后，使在所述沉淀工序中被沉淀的沉淀液流过以硝酸纤维素和醋酸纤维素的混合物为材料的载体，从生物学的液体中分离非-HDL脂蛋白。6.—种分离方法，其特征在于，使载体含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂，所述载体是以硝酸纤维素和醋酸纤维素的混合物为材料、孔径为0.8nm以下的载体，使生物学的液体流过所述载体，从生物学的液体分离非-HDL脂蛋白。7.—种分离方法，其特征在于，通过混合含有非-HDL脂蛋白的生物学的液体和针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂，进行非-HDL脂蛋白的沉淀工序，然后，使在所述沉淀工序中沉淀的沉淀液流过载体，从生物学的液体中分离非-HDL脂蛋白，所述载体是以硝酸纤维素和醋酸纤维素的混合物为材料、孔径为0.8(am以下的载体。8.—种分离器具，其特征在于，在以硝酸纤维素和醋酸纤维素的混合物为材料、孔径为0.8)im以下过滤器中，具有含有针对于非-HDL脂蛋白的沉淀剂的载体。9.一种高密度脂蛋白测定装置，其具备导入含有测定对象物质的测定溶液的容器，设置在所述容器内、与所述测定溶液接触的工作电极，设置在所述容器内、与所述测定溶液接触的参比电极，测定所述工作电才及的界面电位的电位计，其特征在于，在所述工作电极上设置与测定对象物质反应的试剂层。全文摘要本发明提供一种高密度脂蛋白测定装置及分离方法，该方法是从生物学的液体中分离非-HDL脂蛋白的方法，该方法可以回避以往技术的缺点，更迅速地且不需要复杂化的附加装置就可进行，可以更迅速、更简单地进行HDL胆固醇的测定。从通过沉淀剂生成沉淀的LDL脂蛋白、VLDL脂蛋白、乳糜微粒中，分离未生成沉淀的HDL脂蛋白，然后，通过利用过滤器过滤法代替以往的离心分离法，除去生成的沉淀物，来分离血清中的HDL脂蛋白。作为过滤器优选为亲水性纤维素混合酯，采用孔径为0.8μm以下的过滤器。通过采用过滤器过滤法，可以简化以往的离心分离法的烦杂操作、缩短原来较长的所需时间。文档编号G01N1/34GK101319975SQ20081009862公开日2008年12月10日申请日期2008年6月3日优先权日2007年6月4日发明者三宅雅文,山下浩太郎申请人:株式会社日立高新技术