专利名称：猪精囊腺生物反应器小鼠暂态表达检测方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及利用猪精囊腺生物反应器构件，在小鼠体 内进行暂态表达，从而进行猪精囊腺生物反应器表达特性分析的方法。
背景技术：
动物生物反应器是指将外源目的基因导入到动物基因组中，该外源基因可以传 递给后代，并能够表达相应目标蛋白，所获得的个体表达系统就是动物生物反应器。 目前转基因动物生物反应器已经成为重要的生产重组蛋白的方式。用于表达的生物 反应器包括乳腺组织、动物血液、泌尿系统、输卵管组织、精囊腺组织等。动物生 物反应器的归宿动物是家畜(禽)，如奶牛、绵羊、猪和鸡等。建立动物生物反应 器的表达模型对制作转基因大动物具有重要意义，原因在于其一，检测所构建的 表达载体是否能有效表达；其二，表达水平如何；其三，表达的组织特异性如何。
目前表达模型主要包括细胞表达模型，转基因动物表达模型等。其中细胞模型 需要培养相应的细胞，然后将表达构件转染细胞，检测构件的表达情况。然而细胞 表达存在培养比较困难，无法进行组织表达特性分析等缺点。目前，转基因动物表 达模型主要是转基因小鼠，已有的乳腺、血液、泌尿等表达系统都以转基因小鼠为 表达模型。然而转基因小鼠制备仍存在费时费力，成功率低等缺点。在一定程度上 限制了动物生物反应器的研究进展。
发明内容
本发明目的在于建立一种简单、非手术、经济、实用的猪精囊腺生物反应器小 鼠体内暂态表达模型，表达载体经尾静脉注射后，经过血液循环至精囊腺等组织表 达，从而方便进行猪精囊腺生物反应器转基因构件表达特性研究。
本发明技术方案包括猪精囊腺生物反应器表达载体构建、重组载体的注射方法、 基因转染剂的选择、注射剂量、表达检测，具体包括以下步骤-
1、猪精浆蛋白基因调控区克隆根据Genbank已发表的猪精浆蛋白II基因序 列(AJ853849)，设计引物，以猪基因组为模板，扩增猪精浆蛋白II基因5，和3，端侧翼区，长度为4087bp和3094bp，序列分别如SEQ ID NO.l和SEQ ID N0.2所示。
2、 猪精囊腺生物反应器表达载体构建将猪精浆蛋白II基因5'和3'端侧翼 区亚克隆入改造过的pcDNA3.0载体，然后从商业化质粒pEGFP-Nl中绿荧光蛋白基 因表达盒切出，包含多聚腺苷酸化信号DNA，插入至猪精浆蛋白II基因5'和3'端 侧翼区中间，构建成猪精囊腺生物反应器表达载体PSPII-EGFP。
3、 暂态表达将PSPI1-EGFP重组质粒与基因转染剂PEI混合，将成年公鼠麻 醉后，经尾静脉注射入体内；
4、 表达检测将小鼠杀死后取附性腺组织制作冰冻切片，在荧光显微镜下观察 报告基因表达，并提取各组织总RNA和总蛋白，进行RNA和蛋白水平表达检测。
在上述步骤1中，所说的引物具体是
5'侧翼区上游引物为
5' —AG rCGC04 TGA GTT GAG GGG TAT TCA CCA AAC——3'
5'侧翼区下游引物为
5' —AT GGC JCGCGr CTC AGC AGC CTG GCC CTA GC_ 3'，
3'侧翼区上游引物为
5' CT GGL4CC TGC TGT AAT CAT TTT GAA TAA AG 3，，
3'侧翼区下游引物为
5 ， AT CrC04G GTG AAC TGT TTA CCA TGA ATT GT 3 ，。
在上述步骤2中，所说的对pcDNA3.0的改造，包括用限制酶PvuII消化 pcDNA3.0载体，切除其中的neo基因及其表达调控序列。
在上述步骤3中，优选将PSPII-EGFP重组质粒与基因转染剂PEI按1微克2 微升混合，PEI的使用浓度为10毫克/毫升；注射剂量为了2微克质粒每克体重。本发明与现有的技术相比，具有快速、经济、实用等优点，而且可对转基因构 件的表达水平、表达组织特异性进行检测。为猪精囊腺生物反应器的快速研制提供 重要实验依据。
本发明中所使用的pcDNA3.0质粒来自Invitrogen公司，pEGFP-Nl质粒来自BD Biosciences Clontech公司。
图1为构建的猪精囊腺生物反应器表达载体PSPII-EGFP
具体实施例方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实 施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其 后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例一
1、制备和克隆猪精浆蛋白II基因调控区根据Genbank已发表的猪精浆蛋白 II基因序列(AJ853849)，设计引物，以长白猪基因组为模板，用高保真DNA聚合 酶扩增PSP-II基因5'和3'侧翼区，长度分别为4087bp和3094bp，序列分别如 SEQ ID NO.l和SEQ ID N0.2所示；切胶回收纯化目标DNA片段，然后按常规方法 克隆入TA克隆载体pMD18-T (日本宝生物公司)，筛选阳性克隆，并对阳性克隆进 行酶切和测序鉴定，得到含猪精浆蛋白II基因5'和3'端侧翼区的 pMD18-T-PSPII5和pMD18-T-PSPII3重组质粒。
用于克隆的引物序列为
5'侧翼区上游引物为
5' —AG rCGCGJ TGA GTT GAG GGG TAT TCACCA AAC 一3，，在引物中引 进了NruI酶切位点(下划线处)，5'侧翼区下游引物为
5， —AT GGZ4CdGCGrCTC AGC AGC CTG GCC CTA GC— 3'在引物中 引进了KpnI和MluI酶切位点(下划线处)。
3'侧翼区上游引物为-
5 ， CT GGZ4CC TGC TGT AAT CAT TTT GAA TAA AG 3 ，，在引物中引进了 Kpn I
酶切位点(下划线处)，
3'侧翼区下游引物为
5 ， AT CrC^4G GTG A AC TGT TTA CCA TGA ATT GT3，，在引物中引进了Xho1
酶切位点(下划线处)。
2、 猪精囊腺生物反应器重组载体构建将pMD18-T-PSPII3和pMD18-T-PSPI15 依次亚克隆入改造的过pcDNA3.0，得到含4087bp的猪精浆蛋白1I基因5'端侧翼 区和含3094bp的猪精浆蛋白II基因3'端侧翼区的重组质粒pcPSPII。将pcPSPII 重组质粒用MM进行酶切，pEGFP-Nl用HindIII和Notl进行酶切，电泳后切胶回 收纯化目的片段，进行补平，连接，转化，筛选阳性克隆，进行酶切和测序鉴定， 构建成含荧光蛋白报告基因的猪精囊腺生物反应器重组载体，命名为PSPII-EGFP , 如图1所示。
3、 重组表达载体在小鼠体内的暂态表达将构建好的猪精囊腺特异表达质粒 PSPII-EGFP提取纯化好后，用基因转染剂25kDa聚乙烯亚胺(PEI)包裹，质粒和 PEI按1微克质粒混合2微克PEI， PEI的使用浓度为10毫克/毫升，混合后于37°C 温育10分钟，小鼠麻醉后进行尾静脉注射，注射剂量为2微克质粒每克体重。
4、 表达检测经过48h后，取小鼠的附性腺组织制作做冰冻切片于荧光显微镜 下观察绿色荧光，在小鼠的精囊腺可以观察到明显的荧光表达，其它组织无荧光信 号。同时取样提取总RNA和总蛋白进行表达组织特异性分析。RT-PCR和Western Blotting结果都显示在小鼠的精囊腺组织有报告基因的表达，而其它组织没有表达， 表明该表达载体是组织特异的。
综上所述，本发明所建立的猪精囊腺生物反应器小鼠暂态表达检测体系能有效 分析猪精囊腺生物反应器表达载体的调控元件能否驱动报告基因在小鼠体内表达， 并进行组织表达特异分析。与传统的转基因小鼠表达模型相比，具有节省时间、试 验成本低、实用、操作简单等优势。SEQUENCE LISTING 〈U0〉扬州大学
〈120〉猪精囊腺生物反应器小鼠暂态表达检测方法 <160>2
<210>1 <211>4087 <212> DNA <213>家猪(SusScrofa)
<400>1
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acctagagaa aacaattcat ggtaaacagt tcac 309权利要求
1、一种检测猪精囊腺生物反应器表达特性的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)猪精浆蛋白基因调控区克隆根据猪精浆蛋白II基因序列设计引物，以猪基因组模板，扩增猪精浆蛋白II基因5’和3’端侧翼区；(2)猪精囊腺生物反应器表达载体构建将猪精浆蛋白II基因5’和3’端侧翼区亚克隆入改造过的pcDNA3.0载体，然后从商业化质粒pEGFP-N1中绿荧光蛋白基因表达盒切出，包含多聚腺苷酸化信号DNA，插入至猪精浆蛋白II基因5’和3’端侧翼区中间，构建成猪精囊腺生物反应器表达载体PSPII-EGFP；(3)暂态表达将PSPII-EGFP重组质粒与基因转染剂PEI混合，将成年公鼠麻醉后，经尾静脉注射入体内；(4)表达检测将公鼠杀死后取附性腺组织制作冰冻切片，在荧光显微镜下观察报告基因表达，并提取各组织总RNA和总蛋白，进行RNA和蛋白水平表达检测。
2、 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤(1)中所说引物是5'侧翼区上游引物为5， 一AGZ22C^iTGAGTTGAGGGGTATTCACCAAAC —3', 5'侧翼区下游引物为5' —AT GGZ4CC ^CGCGr CTC AGC AGC CTG GCC CTA GC— 3， 3'侧翼区上游引物为5， CT GGBCC TGC TGT AAT CAT TTT GAA TAA AG 3，，3'侧翼区下游引物为5 ， AT C7TO4G GTG AAC TGT TTA CCA TGA ATT GT 3,。
3、 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所说的pcDNA3.0的 改造，包括用限制酶PvuII消化pcDNA3.0载体，切除其中的neo基因及其表达调控序列。
4、 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)具体是将PSPII-EGFP 重组质粒与基因转染剂PEI按1微克2微升混合，PEI的使用浓度为10毫克/毫 升；将成年公鼠麻醉后，经尾静脉注射入体内，注射剂量为2微克质粒每克体重。
5、 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于采用尾静脉注射方法。
全文摘要
本发明公开了一种猪精囊腺生物反应器表达特性研究的检测体系。技术方案利用构建的猪精囊腺生物反应器表达元件，在小鼠体内进行暂态表达，进行猪精囊腺生物反应器转基因构件的表达水平、组织特异性、表达产物活性研究，为真正的转基因猪精囊腺生物反应器研究提供实验依据。与同类技术相比，该发明具有经济、快速、实用的特点。
文档编号G01N21/64GK101285102SQ20081009890
公开日2008年10月15日 申请日期2008年5月16日 优先权日2008年5月16日
发明者晗 吴, 孙丽亚, 宋成义, 王宵燕, 飞 谢, 芹 赵, 陈国宏, 波 高 申请人:扬州大学