专利名称：：功夫菊酯残留的间接竞争酶联免疫吸附分析试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种功夫菊酯残留的间接竟争酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒，主要适用于大批量水样品中功夫菊酯残留的快速测定。
背景技术：
：功夫菊酯是一种合成菊酯类农药，广泛的应用于农作物与畜舍的害虫杀灭与预防。在我国，功夫菊酯主要用于棉花、茶叶、果树和蔬菜种植中。然而，功夫菊酯是一种高毒物质，对于大鼠和小鼠的经口半数致死量(LC5o)分别为79mg/Kg和56mg/Kg，而对于鱼类(LC50=0.078-2.3|ig/L)和水生的无脊稚动物(LC50=0.0023-3.3|ig/L)的毒性更高。而且，功夫菊酯在环境中的残留时间也比较长，它在土壤，植物和脂肪组织中的半衰期分别为30、40和23天。并且有研究显示功夫菊酯可以在鱼类的体内累积，从而有可能影响人类的健康。常用的功夫菊酯的分析方法主要有高压液相色谱法，气相色谱连接电子捕获检测器法和液质联用法。应用这些理化分析技术对环境、生物、食品等样品中痕量功夫菊酯残留进行分析，不仅仪器化程度要求较高，并且需要经过繁复的分离、提取、净化、衍生等前处理过程，分析速度慢、成本高，前处理过程需要使用大量的有机溶剂，又造成了新的环境污染。随着待检样品、特别是要求现场快速检测样品量的迅速增加，传统的农药残留分析手段难以适应要求，因此，迫切需要开发和应用高效率农药残留快速分析技术。
发明内容(一)要解决的技术问题为了解决目前农药残留仪器分析方法成本高和操作复杂以及快速检测技术中特异性差、灵敏度低和检测结果不稳定等缺点，本发明提供了一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单，并能用于大批量样品快速检测的功夫菊酯残留的间接竟争酶联免疫吸附分析试剂盒。(二)技术方案本发明试剂盒包括包被功夫菊酯抗原的酶标板、浓缩洗涤液、功夫菊酯标准品、功夫菊酯特异性抗体、酶标记物、底物显色液和反应终止液。其中，所述包被抗原是3-[(±)氰基[(±)-(顺式)-3-[(Z型)-3-氯-4,4，4-三氟-1-乙基-2,2-二甲基]-环丙基羰基氧基]苯氧基]苯丙酸与载体蛋白的偶联复合物，所述载体蛋白优选为卵清蛋白。其中所述功夫菊酯特异性抗体是由3-[(±)氰基[(±)-(顺式)-3-[(Z型)_3_氯_4，4，4-三氟-l-乙基-2，2-二甲基]-环丙基羰基氧基]苯氧基]苯丙酸与载体蛋白偶联作为免疫原制备获得，可以是通过杂交瘤方法制备得到的单克隆抗体，或者是直接免疫动物得到的多克隆抗体。所述，载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白等常用载体蛋白，优选为牛血清白蛋白；所述多克隆抗体可以是鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，优选为兔源多克隆抗体。其中，包被抗原的酶标板的制备过程中，所用包被液可以是0.05MpH9.6碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含1%明胶的上述包被液。其中，酶标记物为酶标二抗，标记酶可以是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。其中，浓缩洗涤液的配方为每20mL蒸馏水中加入氯化钠7~9g、磷酸二氢钾0.1~0.3g、磷酸氢二钠24g、氯化钾36g、吐温-200.5~3mL。浓缩洗涤液的浓度是正常使用时的50倍。当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液由A液和B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为12mol/L的硫酸或盐酸缓冲液。具体地说，A液配方可为每1000mL水中加入过氧化脲lg，10.3g柠檬酸，35.8gNa2HPCV12H20,吐温-20100pL，pH5;B液配方可为每1000mL蒸馏水中加入四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mLDMSO溶解)，10.3g梓檬酸，pH2.4-2.8。当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为2mol/L的氢氧化钠。本发明试剂盒的分析原理是当酶标板预包被抗原时，加入待测功夫菊酯样品和多克隆抗体，固相包被抗原和待测功夫菊酯相互竟争与抗体反应，由于每个孔中的固相抗原和加入的抗体含量均一致，所以当待测的功夫菊酯浓度高时，则被结合在固相抗原上的抗体少，加入的酶标二抗与被固定抗体结合量少，最后加入底物液和显色液，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低，表明抑制率高；反之，当待测功夫菊酯浓度低时，则所测的OD值高，抑制率低。根据用已知的功夫菊酯浓度检测所作的标准曲线，可以推算出待测功夫菊酯的浓度。(三)有益效果本发明的优点是能准确灵敏地检测不同来源的水样中功夫菊酯残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。本发明对解决大批量样品的功夫菊酯残留现场监控技术具有重要的现实意义。图l功夫菊酯的标准抑制曲线。具体实施例方式下面实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例l试剂盒操作及结果计算待测样品经前处理后，用含甲醇50。/。的PBS定容备用。拆开真空包装袋并取出酶标板，在室温下平衡5分钟备用。配制Ong/mL,5ng/mL，10ng/mL，100ng/mL,1000ng/mL，10000ng/mL的功夫菊酯标准液，加入50pL标样或处理好的样品到各孔中，标样和样品做24个重复，加入50pL稀释的抗体，37。C孵育30分钟；倒出孔中的液体，用稀释好的PBST洗26次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入按1:1000稀释好的酶标羊抗兔二抗100pL，37'C孵育30分钟；倒出孔中的液体，用PBST洗板2-6次，拍干；取A液和B液等体积混匀，每孔加100pL,在暗处显色10-15分钟，每孔加入50pL的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的OD值。将含0标准液孔的OD值减去含最大浓度标准液孔的OD值定为Bo，其余孔经同样方法校正后的OD值定为B;以B/Bo值为纵坐标，相应标准品浓度的log值为横坐标，绘制功夫菊酯标准抑制曲线(附图1)。其中，曲线回归方程为Y=-0.448X+1.201,R2=0.993，,抑制中浓度IC50=37^ig/L,最低检测限IC10=4.7吗/L。实施例2半抗原3-[(±)氰基[(±)-(cis)-3-[(Z)-3-氯-4，4，4-三氟-l-乙基-2，2-二甲基环丙基羰基氧沐氧基]苯丙酸的合成4-羟基苯丙酸苯甲酯的合成250mL三口瓶中加入14.4g对羟基苯丙酸,27mL节醇，15mL甲苯，滴入4滴85。/。的H3P04，回流，分水，反应需10h。蒸馏除去过量甲苯，减压蒸去苄醇，残余物溶于乙醚中，分别用饱和NaHC03溶液、水洗涤三次。无水MgS04干燥，蒸去低沸物，减压蒸馏。收集234-236°C(4mmHg)馏分，得无色粘液4-羟基苯丙酸苯甲酯16.1g,收率72.5%。1-澳-3-(二甲氧基甲基)苯的合成18.5g间溴苯甲醛，12.2g甲酸三甲酯，15mL甲醇于250mL三口瓶中，滴入2滴浓H2S04，常温搅拌3h。混合物用乙醚稀释，分别用饱和Na2C03溶液、水洗涤三次。无水MgS04干燥，蒸去低沸物，减压蒸馏。收集102-104。C(6mmHg)馏分，得无色液体l-溴-3-(二甲氧基甲基)苯13.5g,收率57.9%。4-(3-甲醛苯氧基)苯丙酸苯甲酯的合成100mL三口瓶中，加入5.0g4-羟基苯丙酸苯甲酯，30mL无水DFM，冰浴到5'C以下，分批加入NaH(50%)1.0g，加完后撤去冰浴，加入2.7gl-溴-3-(二甲氧基甲基)苯，1.8gCu2Cl2,0.9g铜粉，4.8mL吡啶，回流反应8h,停止反应，冷却，用150mL乙酸乙酯稀释，用10%HC1洗涤三次，加入10%HC110mL振荡2h，水洗三次，分出有机层，干燥，脱溶，柱层析，得4-(3-甲醛苯氧基)苯丙酸苯甲酯1.27g，收率30.2%。3-[3-[氰基(羟基)甲基苯氧基]苯丙酸苯甲酯的合成50mL三口瓶中，加入1.5gKCN，4mL水，搅拌溶解，冰洛到5。C以下。加入4-(3-甲醛苯氧基)苯丙酸苯甲酯1.27g，THF(四氢呋喃)16mL,缓慢滴加40。/。H2SO44mL。滴完后，5°C以下反应30min。停止反应，用乙醚萃取三次，合并有机层，干燥，脱溶，得3-[3-[氰基(羟基)甲基]苯氧基]苯丙酸苯甲酯1.05g，收率76.6%。3-[(±)氟基[(±)國(cis)画3画[(Z)-3國氯画4，4，4-三氟國l-乙基-2，2-二甲基]环丙基羰基氧沐氧基l苯丙酸苯甲酯的合成50mL三口瓶中，加入2.38g3-[3-[氰基(羟基)甲基]苯氧基]苯丙酸苯甲酯，15mLCH2C12,1.34g功夫菊酸((±)隱(^)誦3國[(2)國3-氯-4,4,4-三氟-l-乙基-2,2-二甲基]环丙基甲酸)，冰洛下滴加溶有1.26gDCC的15mLCH2Cl2,滴加完毕后停止发应。脱溶，柱层析得3-[(±)氰基[(±)-(cis)-3-[(Z)-3-氯-4，4，4-三氟-l-乙基-2,2-二甲基]环丙基羰基氧]苯氧基]苯丙酸苯甲酯(Cwb-5)2.54g，收率75.1%。3-[(±)氟基[(±)-(cis)國3國(Z)-3画氯画4，4，4-三氟-l-乙基-2，2隱二甲基]环丙基羰基氧1苯氧基苯丙酸的合成50mL三口瓶中，加入2.38g3-[(±)氰基[(±)-(cis)-3-[(Z)-3画氯_4,4，4-三氟-1-乙基-2，2-二甲基]环丙基羰基氧]苯氧基]苯丙酸苯甲酯，CH2Cl210mL,Me3SiZ0.4mL，N2保护下，35。C反应2h。大板层析分离得3-[(±)氰基[(±)画(cis)-3-[(Z)國3-氯-4,4,4-三氟-l-乙基-2,2-二甲基]环丙基羰基氧]苯氧基]苯丙酸0.93g，收率76.2%。实施例3功夫菊酯多克隆抗体制备以活性酯法将半抗原与牛血清白蛋白偶联，称2mg偶联物溶于lmL生理盐水中，和lmL完全弗氏佐剂混合，充分乳化后注射新西兰大耳白兔大腿，以后每隔两周加强免疫一次，换用不完全弗氏佐剂与免疫原混合，免疫部位为颈背部皮下，从第三次免疫开始，每次免疫后一周从兔耳静脉釆血检测血清效价。总共免疫5次，最后一次免疫后一周从兔颈动脉采全血，用35%的饱和硫酸铵盐析法粗提兔抗血清，最后用DE-52阴离子交换层析法进一步纯化，获得较纯的功夫菊酯多克隆抗体。DE-52阴离子交换纯化抗体(1)DE-52预处理以lmg粗IgG需5g湿重纤维素计算，称适量DE-52加0.5mol/LNaOH浸泡30min,蒸馏水反复洗至中性；接着用0.5mol/LHCl浸泡30min，蒸馏水反复洗至中性；再用0.5mol/LNaOH浸泡30min，蒸馏水反复洗至中性，最后用0.01mol/L、pH7.4的PBS充分平衡过夜。(2)装柱装柱前用真空泵抽去DE-52溶液中的气泡，装柱过程中不能产生气泡，上样前柱床用0.01mol/L、pH7.4的PBS平衡。(3)上样用46mL的PBS将适量的粗IgG稀释，然后沿柱臂缓慢加在柱床上表面，待样品进入柱床后开始洗脱。(4)洗脱以0.01mol/L、pH7.4的PBS作洗脱液，流速0.5mL/min，收集第一和第二吸收峰。(5)收集液冷冻干燥，4'C保存。实施例4酶标板的制备用包被缓冲液(0.05MpH9.6碳酸钠缓冲液)将功夫菊酯抗原稀释成l吗/mL，每孔加入100iiL,37。C温育2h并4'C过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200pL封闭液，37。C温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。实施例5功夫菊酯残留分析酶联免疫吸附检测试剂盒的组建本例中，试剂盒包含如下部分(1)包被了功夫菊酯抗原的酶标板(2)海绵支架(3)功夫菊酯标准品(4)功夫菊酯多克隆抗体(5)辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(6)浓缩洗涤液配方为氯化钠8g、磷酸二氢钾0,2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、吐温-202mL、蒸馏水20mL。(7)显色液A液配方过氧化脲lg,10.3g柠檬酸，35.8gNa2HP04'12H20,吐温-20100pL，蒸馏水1000mL，pH5。(8)显色液B液配方四甲基联苯胺(TMB)700mg(40rnLDMSO溶解)，10.3g杼檬酸，蒸馏水1000mL,pH2.5。实施例6试剂盒特异性实验选择常用II型菊酯类农药氰戊菊酯(fenvelerate)、甲氰菊酯(fenpropathrin)、溴氰菊酉旨(deltmethrin)、氟胺氰菊酯(fluvalinate)和氯氰菊酯(cypermethrin)为待测物，测得各种物质的抑制中浓度(IC5C)，再用下式计算抗体对这些物质的交叉反应性；交叉反应率愈小，则抗体对功夫菊酯的特异性愈强，反之则抗体的特异性差。交叉反应(CR%)=105()(功夫菊酯)/1(:5()(供试物^100°/0。实验测定结果见表l,采用间接ELISA法，多克隆抗体对常用11型菊酯类农药的交叉反应均小于3%，说明该试剂盒的特异性好,可保证对样品中功夫菊酯残留测定结果的可靠性。表l交叉反应Tab1CrossReactivitiesofIndirectELISAKit<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>ni:所用被测物浓度为10mg/L时，抑制率小于10%实施例7回收试验供试的自来水与井水水样采自中国农业大学西校区，河水水样采自北京巿小清河。添加功夫菊酯的来源不同的水样进行不同的前处理后进行酶联免疫测定分析，结果见表2。表2水样中功夫菊酯的添加回收率Table2Recoveryofcyhalothrinfromthespikedwatersamplesbypretreatment样品添加量理论测定值实际测定值回收率AnalyteSpikedTheoreticalMeasured(ppb)Recovery(mean±(n=4)(ppm)(ppb)(mean±S.E.)S.E.)%自来水0.054.75±0.395±6Tapwater0.22019.6±1.698±80.55048.5±2.097±4井水0.055±0.4100±8Wellwater0.22019.6±2.298±110.55048.5±1.597±3河水0.255.7±0.25114±5Riverwater12021.6±1.0108±52.55055.5±3.5111±71权利要求1.一种检测功夫菊酯残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，包括包被功夫菊酯抗原的酶标板、浓缩洗涤液、功夫菊酯标准品、功夫菊酯特异性抗体、酶标记物、底物显色液和反应终止液。2.根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于制备功夫菊酯特异性抗体的免疫原为3-[(士)氰基[(士)-(顺式)-3-[(Z型)-3-氯-4，4，4-三氟-l-乙基-2，2-二甲基]-环丙基羰基氧基]苯氧基]苯丙酸与载体蛋白的偶联复合物。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述功夫菊酯抗原为3-[(±)氰基[(±)-(顺式)-3-[(2型)-3-氯-4，4，4-三氟-1-乙基-2，2-二甲基]-环丙基羰基氧基]苯氧基]苯丙酸与载体蛋白的偶联复合物。4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记物为酶标记二抗。5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述的浓缩洗涤液的配方为每20mL蒸馏水中加入有氯化钠79g、磷酸二氢钾0.1~0.3g、磷酸氢二钠24g、氯化钾36g、吐温-200.53mL。6.根据权利要求l或2所述的试剂盒，其特征在于，当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液包括A液和B液，所述A液为过氧化氢或过氧化脲、所述B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺、终止液为1~2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为2mol/L的氢氧化钠。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述A液配方为每lOOOmL水中加入过氧化脲lg，10.3g柠檬酸，35.8gNa2HP(V12H20，吐温-20100pL,pH5;所述B液配方为每1000mL蒸馏水中加入四甲基联苯胺700mg,10.3g杼檬酸，pH2.4-2.6。8.权利要求17任一项所述试剂盒在检测功夫菊酯残留中的应用。全文摘要本发明提供了一种适用于功夫菊酯残留检测的酶联免疫吸附分析试剂盒，包括包被功夫菊酯抗原的酶标板、浓缩洗涤液、功夫菊酯标准品、功夫菊酯特异性抗体、酶标记物、底物显色液和反应终止液。本发明的优点是能准确灵敏地检测水中功夫菊酯残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。文档编号G01N33/543GK101526526SQ20081010154公开日2009年9月9日申请日期2008年3月7日优先权日2008年3月7日发明者季李,艇许,高宏斌申请人:中国农业大学