无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)浓度测定方法

文档序号:6009149阅读:183来源:国知局
专利名称:无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)浓度测定方法
技术领域
本发明涉及一种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒,同时本发明还涉及测定 无机磷(磷酸根)浓度的方法,属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术
人体内磷的87%都存在于骨骼中,血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平衡,血 中钙、磷浓度之间有一定关系,正常人血钙升高则血磷降低,反之亦然。血浆中钙]、 [磷]浓度的乘积保持在一定范围;大约每100毫升血浆钙磷浓度的乘积为35—— 40。当二者乘积大于40时,钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织,>70时,可发生转 移性钙化。当乘积<35时,则将妨碍骨组织的钙化,甚至使骨盐再溶解,影响成 骨作用,引起佝偻病或软骨病。血浆[Ca]、 [P加勺恒定,主要受维生素D,甲状旁 腺激素及降钙素的调节。
由于人体的磷目前还不能直接测定,所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐阴 离子(H2P04", HP04"。常用的方法有磷钼酸还原法,非还原法,染料结合法, 酶法,同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分析法等。决定性方 法是同位素稀释质谱法,WHO推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是比色 法。
磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法,后者需在试剂中加入非离子 型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多,性能比较稳定的 还原剂有硫酸亚铁,硫酸亚铁铵,硫酸肼,米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇 基苯基醚(TritonX-100)最理想。
磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚化合物,方法简便,便于自动化。但黄疸,溶血,脂浊血清在340nm有光吸收,必须做标 本空白,否则结果偏高。
酶法测定无机磷是发展趋势,其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性范 围内是稳定的,可用于常规样品的自动化分析。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术,监测还原型烟酰胺辅酶(还原 型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化,得以测定无机磷(磷酸根)浓度的力、法, 同时,本发明还将给出用以实现该方法的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒,采 用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行无机磷(磷 酸根)浓度测定,向且测定速度快、准确度高,因而可以得到切实的推广应用。 本发明无机磷(磷酸根)浓度测定方法原理如下
磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶二氧化碳+
磷酸烯醇式丙酮酸+水 腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶/^~腺苷三磷酸+
丙酮酸
氨+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶丙氨酸+水+辅酶 这种方法应用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase; EC 4丄1.31)酶(偶)联丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase; EC 2.7.1.40 )、丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase; EC1.4丄1)酶促反应比色法。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶解无机 磷(磷酸根)反应产生磷酸烯醇式丙酮酸,再通过(偶)联合丙酮酸激酶、丙氨 酸脱氢酶的作用,最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在 340nm处没有吸收峰),从而得以测定还原型辅酶在340nrn处吸光度下降的程度, 通过测量340nm处吸光度下降的程度,可以测算无机磷(磷酸根)的浓度大小。 实验表明,从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑,无论是单剂、双剂还是三剂,如下成分关系的本发明无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒 较为理想
缓冲液 稳定剂 还原型辅酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 丙酮酸激酶
草酰乙酸 腺苷二磷酸
氯化铵 氯化钾
100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000U/L 12 mmol/L 10 mmol/L 9 mmol/L 3 mmol/L
本发明的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒可以是单剂,包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、 丙氨酸脱氢酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾。
试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,
直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾。
试剂2
缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶。
还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、草酰乙
6酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒 可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化
钾。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。 还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、草酰乙
酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。 试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直
接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂,本发明测定无机磷(磷酸根)浓度的方法,其还 原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为单试剂,包括 三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L
丙酮酸激酶 8000 U/L
7丙氨酸脱氢酶 10000 U/L
草酰乙酸 12mmol/L 腺苷二磷酸 10 mmol/L
氯化铵 9 mmol/L
氯化钾 3 mmol/L
试剂全部溶解配好后,分装入瓶,进行冷冻干燥,制成干粉试剂;使用前,加 入纯净水,复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37°C,反应时间10分钟,起始吸光度1.8 ±0.7,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测无机磷(磷酸根)样品与试 剂的体积比例为1/25,反应方向为负反应(下降反应),延迟时间大约O分钟左右, 检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下, 检测主波长340nm吸光度下降的程度,从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。 实施例二
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为双试剂,包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100謹ol/L
稳定剂50 mmol/L
还原型辅酶0.25 mmol/L
草酰乙酸12 mmol/L
腺苷二磷酸10 mmol/L
氯化铵9 mmol/L
氯化钾3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmd/L稳定剂
500 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
6000 U/L
丙酮酸激酶
8000 U/L
丙氨酸脱氢酶
10000 U/L
试剂全部溶解配好后,分装入瓶,制成液体双试剂,可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C,反应时间IO分钟,起始吸光度1.8
±0.7,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测无机磷(磷酸根)样品与试
剂l、试剂2的体积比例为2/20/5,反应方向为负反应(下降反应),延迟时间大
约O分钟左右,检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下,
检测主波长340nm吸光度下降的程度,从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。
实施例三
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为三试剂,包括 试剂1
二 (羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
草酰乙酸 12mmol/L 腺苷二磷酸 1Ommol/L 氯化铵 9 mmol/L
氯化钾 3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
100mmol/L
稳定剂
500 mmol/L
丙酮酸激酶
8000 U/L丙氨酸脱氢酶 10000U/L 试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L
试剂全部溶解配好后,分装入瓶,制成液体三试剂,可以直接使用。 测定无机磷(磷酸根)浓度时,在全自动生化分析仪上设定温度37t:,反应 时间10分钟,起始吸光度1.8±0.7,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被 测无机磷(磷酸根)样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5,反应 方向为负反应(下降反应),延迟时间大约0分钟左右,检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下, 检测主波长340nm吸光度下降的程度,从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。 申请人:经过实验验证,釆用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本 发明的目的,鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同,不另一一例举。
总之,实验证明采用木发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得 出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.001;吸光度时间反 应曲线应呈下降曲线直至终点;试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达16mmol/L; 试剂测试的不准确度,其相对偏差不超过±5%;试剂测试的精密度(重复性)的 变异系数(CV) 《2%;试剂的灵敏度可达0.012 士0.006 AA/mmol/L;试剂在 2—8。C下保存,活性可以稳定一年;一一本发明灵敏度高、精确度好,线形范围 宽广,稳定期长,足以便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷(磷酸根)浓度测定方法,其方法原理如下磷酸根+草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶/K+ 腺苷三磷酸+丙酮酸氨+丙酮酸+还原型辅酶 丙氨酸脱氢酶 丙氨酸+水+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度下降的程度,测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小测定结果。
2. —种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒,主要成分包括缓冲液 稳定剂 还原型辅酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 丙酮酸激酶20-l一草酰乙酸 腺苷二磷酸氯化铵 氯化钾一500 mmol/L -4000 mmol/L 0.1""0.35mmol/L 1000——80000 U/L 1000——80000 U/L1000-80000 U/L1- 50mmol/L1- 50mmol/L1- 50mmol/L1~~~ 50mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围;在此范围内效果较好,在此范围外, 试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使用。
3. 根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒,其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、丙 氨酸脱氢酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒,其特征在于.-由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、丙 氨酸脱氢酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾组成双剂试剂;试剂l,由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾组 成;试剂2,由缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、丙 氨酸脱氢酶组成。还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、丙氨 酸脱氢酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾在试剂1或试剂2中的位 置可以不限。
5. 根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒,其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、丙 氨酸脱氢酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾组成多剂试剂;试剂l, 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾组 成;试剂2,由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶组成;试剂3, 由缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶组成。还原型辅酶、磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、 氯化钾在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒,其特征在于还包 括稳定剂1^4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇 (Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒,同时本发明还涉及测定无机磷(磷酸根)浓度的方法原理、试剂的组成及成分,属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化铵、氯化钾、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶及稳定剂;通过将样品与试剂按一定的体积比混合,使之发生一系列的酶促反应,再将反应物置于紫外/可见光分析仪下,检测主波长340nm处吸光度下降的程度,从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101620153SQ20081012422
公开日2010年1月6日 申请日期2008年6月30日 优先权日2008年6月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司
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