专利名称：锰离子诊断/测定试剂盒及锰离子的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种锰离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锰离子浓 度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
锰作为一种微量元素在人体中是不可或缺的必需成分，同时也是对人体有毒 的物质。在自然状态下，以两价、三价和四价的形式存在，氧化程度越低，毒性 越高。通常锰有八种不同的氧化状态。锰的生物学意义是作为人体中辅助因子有
多种多样的功能。然而，在许多酶激活反应中，Mi严和MgS+可互相替代。
常用石墨炉原子吸收分光光度测定法、原子发射ICP-OES。中子激发分析 (NAA)是最好的方法，但仅能在一些条件好的实验室才能测定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用间接的酶循环扩增法(Indirect Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶 (偶)联法(CoupleReaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶) 在340nm波长处吸光度的变化，得以测定锰离子浓度的方法，同时，本发明还 将给出用以实现该方法的锰离子诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/ 可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行锰离子浓度测定，而且测定速度快、 准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明锰离子浓度测定方法原理如下
草酸+氧草酸氧化酶/Mn^二氧化碳+过氧化氢二氧化碳+乙酸+亚铁细胞色素bl 丙酮酸脱氢酶丙酮酸+
高铁细胞色素bl +水 丙酮酸+辅酶八+辅酶丙酮酸脱氢酶二氧化碳+乙酰辅酶A十
还原型辅酶
这种方法应用需要锰离子激化活性的草酸氧化酶(oxalate oxidase; EC 1.2.3.4) 酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.2.2)、第二个丙酮酸脱氢 酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51)酶促反应速率比色法。草酸氧化酶的 激活程度与锰离子的浓度成正比。草酸氧化酶作为作用酶，功能为将草酸酶解产 生二氧化碳。第一个丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.2.2)也是作用酶，功能为将二氧化 碳酶解产生丙酮酸。第二个丙酮酸脱氢酶(ECL2丄51)作为循环酶又同时作为 显色酶；作为循环酶丙酮酸脱氢酶(EC1.2丄51)的酶促作用使丙酮酸再次变 回二氧化碳，使二氧化碳不断地被重复循环利用，并不断地循环产生丙酮酸。丙 酮酸脱氢酶EC 1.2丄51)作为显色酶将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原 成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处 吸光度上升的速度，通过测量340mn处吸光度上升的速度，可以测算出锰离子 的浓度。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明锰离子诊断/测定试剂盒较为理 想
缓冲液 100 mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
草酸氧化酶 10000 U/L丙酮酸脱氢酶 12000 U/L
丙酮酸脱氢酶 12000 U/L
草酸 15mmol/L 乙酸 12mmol/L 亚铁细胞色素bl 5 mmol/L
辅酶A 3 mmol/L
本发明的锰离子诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、草酸氧化酶、二个不同的丙酮酸脱氢酶、草酸、 乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂-试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、草酸、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶、二个不同的丙酮酸脱氢酶。 辅酶、草酸氧化酶、二个不同的丙酮酸脱氢酶、草酸、乙酸、亚铁细胞色素 bl、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在 使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂-试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、草酸、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A。 试剂2缓冲液、稳定剂、二个不同的丙酮酸脱氢酶<
试剂3
缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶。
辅酶、草酸氧化酶、二个不同的丙酮酸脱氢酶、草酸、乙酸、亚铁细胞色素 bl、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状 态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定锰离子浓度的方法，其辅酶可以是 NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的锰离子诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸—盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂
草酸氧化酶
丙酮酸脱氢酶
丙酮酸脱氢酶
乙酸
亚铁细胞色素M 辅酶A
500 mmol/L 3 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000 U/L 15 mmol/L 12 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定:温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1， 测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锰离子样品与试剂的体积比例为 1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2 分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出锰离子的浓度大小。 实施例二
本实施例的锰离子诊断/测定试剂为双试剂，包括-试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂
乙酸
亚铁细胞色素bl
辅酶A
10Ommol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 15 mmol/L 12 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
草酸氧化酶
丙酮酸脱氢酶
丙酮酸脱氢酶
10000U/L 12000 U/L 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定:温度37°C ，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1 ， 测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锰离子样品与试剂1、试剂2的体 积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右， 检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出锰离子的浓度大小。 实施例三
本实施例的锰离子诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 辅酶
乙j
亚铁细胞色素M 辅酶A
50 mmol/L 3 mmol/L 15 mmol/L 12 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
丙酮酸脱氢酶 丙酮酸脱氢酶
500 mmol/L 12000 U/L 12000 U/L
试剂三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
草酸氧化酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定锰离子浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10 分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锰离子 样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5,反应方向为正反应(上升 反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出锰离子的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本 发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得 出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.002;吸光度时间反 应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(RX).99)线形范围可达5mmol/L; 试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过士5 %;试剂测试的精密度(重复性) 的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.24 ± 0.12AA/mmol/L;试剂 在2—8i:下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形 范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
权利要求
1.一种间接的酶循环扩增法、酶比色法及酶联法的锰离子的浓度测定方法，其方法原理如下草酸+氧 草酸氧化酶/Mn2+ 二氧化碳+过氧化氢二氧化碳+乙酸+亚铁细胞色素b1 丙酮酸脱氢酶 丙酮酸+高铁细胞色素b1+水丙酮酸+辅酶A+辅酶 丙酮酸脱氢酶 二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出锰离子的浓度大小测定结果。
2. —种锰离子诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20—500 mmol/L稳定剂1——4000 mmol/L辅酶卜6 mmol/L草酸氧化酶1000——-訓00 U/L丙酮酸脱氢酶1000——-画00 U/L丙酮酸脱氢酶1000———80000 U/L草酸卜50 mmol/L乙酸1-50 mmol/L亚铁细胞色素bl1-50 mmol/L辅酶A1—50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、草酸氧化酶、二个不同的丙酮酸脱氢酶、草酸、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、草酸氧化酶、二个不同的丙酮酸脱氢酶、草酸、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、草酸、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶、二个不同的丙酮酸脱氢酶组成。辅酶、草酸氧化酶、二个不同的丙酮酸脱氢酶、草酸、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、草酸氧化酶、二个不同的丙酮酸脱氢酶、草酸、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、草酸、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、二个不同的丙酮酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶组成。辅酶、草酸氧化酶、二个不同的丙酮酸脱氢酶、草酸、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1_4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用间接的酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的锰离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锰离子浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、草酸、乙酸、亚铁细胞色素b1、辅酶A、草酸氧化酶、二个不同的丙酮酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出锰离子的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101625312SQ200810123588
公开日2010年1月13日 申请日期2008年7月9日 优先权日2008年7月9日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司