d-生物素及其杂质含量的HPLC测定方法

专利名称：：d-生物素及其杂质含量的HPLC测定方法
技术领域：
：本发明涉及物质含量的测定，具体地说是一种d-生物素及其各个杂质含量的HPLC测定方法。
背景技术：
：d-生物素(d-Biotin)又称维生素H，辅酶R，它是一种以游离或与蛋白质结合的形式广泛分布于动植物组织中，d-生物素已广泛应用于医药、家禽、家畜的饲料添加剂方面。因d-生物素的合成路线长，在其合成过程中会引入比较多的杂质(A-H)，有关d-生物素杂质的分析方法的研究也取得了较快的进展。目前比较权威的分析方法是欧洲药典，其在美国药典的滴定法含量测定的基础上提出d-生物素杂质的TLC控制方法，用TLC法检测d-生物素中杂质，规定允许有且只有一个杂质斑点颜色大小大于0.25%的自身对照溶液斑点，但不得大于0.5%的自身对照斑点，TLC法的检测限为0.25X，此种检测方法为半定量检测，其灵敏度低。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服上述现有方法存在的缺陷，提供一种利用HPLC法测定d-生物素及其杂质含量的定量方法。为此，本发明采用如下的技术方案d-生物素及其杂质含量的HPLC测定方法，其色谱条件为采用反相C"柱，质量浓度为0.05%的三氟乙酸水溶液-乙腈的流动相，0.5-1.5ml/min的流速，210-220nm的检测波长，流动相中三氟乙酸水溶液与乙腈的体积比为60-80:40-20;用流动相溶解含杂质的d-生物素并稀释，进样测定，通过高效液相色谱仪检测d-生物素及其各个杂质的含量。下面为各个杂质的结构式oIMPURITIES1HN^^,NH本方法除用于测定d-生物素及其杂质的含量外，还同时适合于d-生物素各类制剂的含量测定。上述的HPLC测定方法，所述的高效液相色谱仪上装有紫外分光光度计，所述的流速优选1.0ml/min，检测的波长优选210nm。本发明的测定方法专属性强，结果准确，大大提高了灵敏度，适应药品注册国际技术要求(ICH)关于药品中杂质大于0.1%含量的定性和定量需要，为建立HPLC测定生物素杂质的方法奠定了基础，有助于提高生物素的质量控制，对保证其质量和用药安全均有重要的意义。图1为本发明d-生物素及其杂质的高效液相色谱图。具体实施例方式1仪器与试药高效液相色谱仪(Agilent1100)，日本岛津UV2201型紫外分光光度计，浙江大学N2010系列色谱数据工作站。d-生物素3批样品(20080901，20080902，20070903)均由浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供；水为重蒸馏水，杂质AH均自制；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱MG-ds柱(250mmx4.6mm，5pm);流动相质量浓度为0.05%三氟乙酸水溶液-乙腈(75:25);流速1.0ml/min;检测波长210nm;进样量10|il。2.2溶液配制供试品溶液精密称取d-生物素适量，用流动相溶解并稀释，制成含d-生物素1.0mg/ml的供试品溶液。对照液精密量取供试品溶液lml，置100ml量瓶中，加流动相定容待用。杂质溶液分别精密称取各个杂质AH适量，用流动相溶解并稀释成各组分0.1mg/ml的溶液。混合溶液分别精密称取d-生物素及各个杂质AH适量，用流动相溶解并稀释，制成含各组分0.1mg/ml的混合溶液。2.3检测波长的选择分别称取d-生物素及各个杂质AH适量，用流动相配制成合适浓度的溶液，在紫外200400nm波长范围内扫描，结果显示，化合物均无特征紫外吸收，因此，选择检测波长为210nm。2.4系统适用性试验取混合溶液进样测定，结果如图显示d-生物素l与其各杂质AH均能完全分离。按d-生物素的峰计，理论板数达5500，d-生物素与其各杂质达到基线分离。2.5各杂质定位取各杂质溶液进样，记录各杂质保留时间，再取供试品溶液与各杂质溶液分别混合，进样测定，检测到单个杂质含量增大，即为此杂质的出峰位置。2.6检测限在"2.1"项下的色谱条件下，用流动相溶解并逐步稀释，进行分析，在信噪比S/7V为3时，计算得d-生物素的最小检测限为0.5ng(0.01%)。2.7稳定性试验取供试品溶液，分别放置O、6、12、18和24h后进样测定，结果表明，d-生物素峰面积及其与各杂质峰面积总和百分比均无明显变化，RSD分别为0.2%和0.7%，说明供试品溶液在24h内稳定。2.8杂质测定精密量取"2.2"供试品溶液和对照液进样测定，记录色谱图至d-生物素保留时间的10倍，以自身对照法计算得三批样品的杂质总和分别为0.19。％、0.26%、0.25%，其中各单个杂质均不超过0.1%，结果见表l。表1样品杂质含量测定结果(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3结论3.1试验所得色谱图中对d-生物素及各杂质峰进行紫外扫描，均无特征紫外吸收，故选择测定波长为210nm，经试验其检测限可达0.01%，可以适应杂质检测。质量浓度为0.05。/。三氟乙酸水溶液能有效增强d-生物素在柱中的保留，可有效改善峰形拖尾。在本色谱条件下，d-生物素峰保留时间合适，并可分离出杂质A、B、C、D、F峰，均在d-生物素前出峰。杂质G、H紧挨d-生物素峰后。唯一遗憾的是杂质E出峰时间约在d-生物素峰保留时间的10倍处，尝用梯度洗脱试验，但因为检测波长为210nm，基线不稳定，故无法以梯度试验(见图l，图中的l峰即d-生物素峰)。3.2本方法发现浙江医药股份有限公司新昌制药厂生产的生物素因其工艺的特殊性，不含杂质B、C、D，本方法除用于检查杂质外，还同时适合于本品及其制剂的含量测定。权利要求1、d-生物素及其杂质含量的HPLC测定方法，其色谱条件为采用反相C18柱，质量浓度为0.05％的三氟乙酸水溶液-乙腈的流动相，0.5-1.5ml/min的流速，210-220nm的检测波长，流动相中三氟乙酸水溶液与乙腈的体积比为60-80∶40-20；用流动相溶解含杂质的d-生物素并稀释，进样测定，通过高效液相色谱仪检测d-生物素及其各个杂质的含量。2、根据权利要求1所述的HPLC测定方法，其特征在于所述的高效液相色谱仪上装有紫外分光光度计。3、根据权利要求1或2所述的HPLC测定方法，其特征在于所述的流速选用1.0ml/min，检测波长选用210nm。全文摘要本发明公开了一种d-生物素及其各个杂质含量的HPLC测定方法。目前比较权威的分析方法是欧洲药典，其在美国药典的滴定法含量测定的基础上提出d-生物素杂质的TLC控制方法，此种检测方法为半定量检测，其灵敏度低。本发明的色谱条件为采用反相C₁₈柱，质量浓度为0.05％的三氟乙酸水溶液-乙腈的流动相，0.5-1.5ml/min的流速，210-220nm的检测波长，流动相中三氟乙酸水溶液与乙腈的体积比为60-80∶40-20；用流动相溶解含杂质的d-生物素并稀释，进样测定，通过高效液相色谱仪检测d-生物素及其各个杂质的含量。本发明的测定方法专属性强，结果准确，大大提高了灵敏度。文档编号G01N30/02GK101504393SQ200810162138公开日2009年8月12日申请日期2008年11月14日优先权日2008年11月14日发明者陈建辉申请人:浙江医药股份有限公司新昌制药厂