专利名称：用于酶联免疫吸附测定的酶标板的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物技术领域，具体地说是一种酶标板。
背景技术：
酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法 是一种将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化作用相结合，由此建立的一 种免疫4企测技术，并在临床及生物技术领域得到了广泛应用。
ELISA的起始步骤是将抗体附着于微孔板的反应孔表面，称为包被，包被 的效率即最终结合于微孔板表面的抗体密度及其稳定性决定了随后结合抗原 的数量，亦即决定了 ELISA的敏感性。传统技术的酶标板其固相的抗体分子 因其呈团串状，不均一分布和易解吸等不利因素使其应用受到限制，因此一
部分生产者利用了 1个链霉亲和素分子可与4个生物素分子结合的原理，釆 用链霉亲和素的预包被方法制备酶标板，即包被层为采用链霉亲和素、生物 素化特异性抗体依次涂布在反应孔上形成的包被层，此种酶标板一方面可以 通过充分暴露抗体的可变区从而提高与待测抗原的亲和性，另 一方面还可以 通过其放大原理降低特异性抗体的使用量，提高酶标板的灵敏度，但是现有 技术采用链霉亲和素的预包被制备的酶标板成本高，因为链霉亲和素同样价 格昂贵。
实用新型内容
为解决现有技术存在的问题，本实用新型提供一种特异性、敏感性好， 且成本低的用于酶联免疫吸附测定的酶标板。
本实用新型是这样实现的一种用于酶联免疫吸附测定的酶标板，包括固相载体和包被层，所述固 相载体为设置有若干个微孔的微孔板，所述固相载体的反应孔表面附着由抗链 霉亲和素抗体、链霉亲和素、生物素化特异性抗体依次涂布在反应孔上形成的 包被层。
作为本实用新型的一种优选方案，所述包被层中抗链霉亲和素抗体与链 霉亲和素之间可以有一层封闭液，所述封闭液可为牛血清白蛋白。
作为本实用新型的进一步优选方案，所述固相载体可为96孔聚苯乙烯微孔板。
作为本实用新型的再一种优选方案，所述固相载体可为48孔聚苯乙烯微孔板。
本实用新型的制备过程是在固相载体的微孔上先预包被抗链霉亲和素 抗体，在4。C条件下放置12 15小时，然后再加入^t连霉亲和素溶液，以上两个 步骤完成ELISA板的预包被过程，制成的半成品在4。C条件下保存，最后根 据待测抗原，选择生物素化的特异性抗体进行包:^皮，此步骤大约30分钟即可 完成，即制得ELISA酶标一反。
本实用新型包被层为采用成本低且制备简单的抗链霉亲和素抗体先于链 霉亲和素预包被而形成的包被层，链霉亲和素及其抗体均具有较好的热稳定 性和抗变性特性，所以容易保持其天然构象，将其预先包被至固相，则特异 性抗体(单克隆或多克隆)即可通过"抗链霉亲和素抗体+4连霉亲和素+生物素化 特异性抗体，，的结合模式而间接吸附于载体表面，这种方法不仅改善了固相 抗体分子的功能化保留程度，而且还能够捕获较多待测蛋白分子。此种包被 层最大方式的保留了特异性抗体的亲和性，还保留了链霉亲和素预包被方法 降低特异性抗体用量的优势，更有意义的还在于减少了链霉亲和素的用量， 明显降低了总生产成本。另一方面，本实用新型利用链霉亲和素与生物素分 子的亲和力远大于一般抗原抗体亲和力的特性(数百万倍)，用此种预包被方 法法制备的半成品只再需30分钟即可完成成品的包被，特别适用于大规模生产，且试验的特异性、敏感性均由此得以改善，经实验证实，采用本实用新型酶标板进行检测具有更高的灵敏度，其最低检测限为lpg/ml，回收率为卯 ±13%,重复性亦佳。
此处所说明的附图用来提供对本实用新型的进一步理解，构成本申请的 一部分，并不构成对本实用新型的不当限定，在附图中图1为本实用新型结构示意图；图2为本实用新型剖一见图；图3为本实用新型酶标板所测人IL-6标准曲线图； 图4为为现有技术酶标板所测人IL-6标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本实用新型，在此本实用新 型的示意性实施例以及说明用来解释本实用新型，但并不作为对本实用新型 的限定。如图1、 2所示，本实施例提供的用于检测人白介素6 (IL-6)的ELISA 的酶标板,包括固相载体1和包被层3,固相载体1为96孔聚苯乙烯微孔板， 96孔聚苯乙烯微孔板的反应孔2表面附着由抗链霉亲和素抗体、链霉亲和素、 生物素化特异性抗体依次涂布在反应孔上形成的包被层3,包被层3中抗链霉 亲和素抗体与链霉亲和素之间有一层牛血清白蛋白封闭液。本实用新型酶标板的制备过程是.(1)将96孔聚苯乙烯微孔板1 ( PS )置于紫外光下幅照2小时，使PS 板活化；(2 )预包被采用PH=7.8的Tris盐緩冲液(TBS )配置浓度为0.2 ug/ml的抗链霉亲和素抗体工作液，将抗链霉亲和素抗体工作液力。入PS板酶标孔中，每个孔中加入100ul，在fC条件下放置12~15小时；(3 )洗板以PH=7.4 TBS洗涤步骤(2 )制得的包被板3次；(4) 封闭以2Q/。BSA (牛血清白蛋白)溶液作为封闭液，加入PS板酶 标孔内，每孔200u旧SA溶液，室温力丈置2小时；(5) 洗板同步骤(3),拍干；(6 )将工作浓度为0.4 ug/ml的链霉亲和素溶液加入到步骤(5 )得到的 包被板微孔中，100ul/孔，在37。C下放置2小时，半成品完成，在4。C条件下 保存备用；(7) 洗板同步骤(3)，拍干；(8) 加入工作浓度为0.1 ug/ml的生物素化人IL-6单克隆抗体，100u1/ 孔，室温放置30分钟，完成整个酶标板包被过程；(9) 包装。分别釆用现有技术的ELISA酶标^l和本实用新型酶标+反定量4全测已知浓 度(134 pg/ml) IL-6标本，其中现有技术的ELISA酶标板其包被层为链霉亲 和素、生物素化特异性抗体依次涂布在反应孔上形成的包^C层，测量步骤如 下(1) 加样分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，空白孔加样品稀释液 lOOul,标准孔和待测样品孔分别加标准品(IL-6)和定值样品lOOul,覆膜， 37。C放置120分钟，标准品浓度分别为500 pg/ml， 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62.5pg/ml， 31.2 pg/ml, 15.6 pg/ml, 7.8 pg/ml;(2) 弃去液体，甩干，每孔加检测抗体A工作液lOOul,覆膜，37。C放 置60分钟；(3) 弃去孔内液体，洗板3次，甩干，温育60分钟；(4 )每孔加检测抗体B工作液lOOul,覆膜，37。C放置60分钟；(5)弃去孔内液体，洗板5次，甩干；(6 )每孔加TMB底物溶液90ul， 37。C避光显色30分钟；(7 )依序每孔加终止溶液50ul，用酶联仪在450nm波长测量各孔的光密 度(OD值)。测量结果如图3、 4所示，对检测结果进行比较(如表l)，其中，批内精 密度定值标本在同一酶标板上重复检测20次；批间精密度同一定值标本 分20次进4力险测。表1.不同EL ISA酶标板检测结果比较酶标板类艰定值样品 别'J定值(mean)标准差(SD)变异系数(cv %)批内批间批内批间本实用新，.141. 58. 39. 15. 86. 4现有技术 ELISA酶标板142. 310. 611. 67.48.2注现有技术ELISA酶标板采用链霉亲和素预包被制得的酶标板从表1数据可以看出应用本实用新型酶标板检测IL-6标本，其准确性在 94-106%,准确性良好，且精确度也优于现有技术的ELISA酶标》反。与现有技术的采用链霉亲和素预包被制得的酶标板相比，现有技术酶标 板所需特异性抗体与链霉亲和素的量分别为2ug/ml和10 ug/ml,而本实用新 型所需特异性抗体与链霉亲和素的量分别为0.1 ug/ml与0.4 ug/ml,所用特异 性抗体量仅为现有技术ELISA酶标板的1/10 1/20，因此可节约成本大约10-20倍。
权利要求1、一种用于酶联免疫吸附测定的酶标板，包括固相载体和包被层，所述固相载体为设置有若干个微孔的微孔板，其特征在于所述固相载体的反应孔表面附着由抗链霉亲和素抗体、链霉亲和素、生物素化特异性抗体依次涂布在反应孔上形成的包被层。
2、 如权利要求1所述的用于酶联免疫吸附测定的酶标板，其特征在于 所述包被层中抗链霉亲和素抗体与链霉亲和素之间有一层封闭液，所述封闭液 为牛血清白蛋白。
3、 如权利要求1或2所述的用于酶联免疫吸附测定的酶标板，其特征在 于所述固相载体为96孔聚苯乙烯微孔板。
4、 如权利要求1或2所述的用于酶联免疫吸附测定的酶标才反，其特征在 于所述固相载体为48孔聚苯乙烯微孔板。
专利摘要本实用新型公开了一种用于酶联免疫吸附测定的酶标板，包括固相载体和包被层，所述固相载体为设置有若干个微孔的微孔板，所述固相载体的反应孔表面附着由抗链霉亲和素抗体、链霉亲和素、生物素化特异性抗体依次涂布在反应孔上形成的包被层。本实用新型具有的有益效果是快速，特异性、敏感性好，且成本低。
文档编号G01N33/544GK201289484SQ200820202969
公开日2009年8月12日 申请日期2008年11月6日 优先权日2008年11月6日
发明者何峰容 申请人:武汉中美科技有限公司