单光子光谱仪的制作方法

专利名称：单光子光谱仪的制作方法
技术领域：
本发明涉及传感器系统和，尤其是涉及单光子传感器系统以及检测由多种荧光标 记物标记的生物样品发射的多色荧光的方法以及分析多种荧光标记物标记的生物样品的 方法。所述传感器系统和检测方法包括一光谱分离单元、一检测单元和用于采集的数据的 信号处理算法。
背景技术：
已有多种基于记录单光子的荧光检测技术。这些技术通常指的是单光子检测 (SPD)技术。由于它们的复杂性和价格昂贵，在生物医学应用中单光子检测技术主要用于时 间分辨荧光光谱学或检测单个荧光分子。如图1的方框图所示，至今传统的单光子检测器由若干组件组成，所述若干组件 包括一单光子传感器或光电倍增管(PMT)检测器、一脉冲放大器、一脉冲形成器、一计数器 和一计算机。至今为止一阻碍单光子检测器性能的因素是可用的光子计数装置的相对窄的 线性动态范围。检测器的动态范围是由所述检测器为响应一单光子所需要的响应时间(τ
来决定。所述τ 的量取决于所述设备的所有组件的响应时间，并且通常被认为是各 个组件响应时间的总和。如图2的图所示，事实上现有的单光子传感器的最短响应时间为 大约Ins。然而，至今为止，具有一给定的τ 的传统的单光子PMT检测器被限于动态范 围为每秒IO6-IO7光子计数(photocounts)。在生物学应用，以及尤其是在DNA检测中，至今DNA序列分析系统还不能处理和检 测超高速DNA序列分析。实际上，传统的DNA序列测定仪被限于以每秒10-30帧(frames) 记录测序过程。而且，传统的DNA仪器的动态范围局限于16bit。至今用于连续稀释的 BigDyeDNA测序标准样品的传统装置由于至少一因素10少于所需要的而变得相对不灵敏。因此，需要传感器，所述传感器包括具有光子计数器的单光子检测器，所述单光子 检测器具有每秒大于IO7光子计数的线性范围，例如达到每秒IO8光子计数，每秒大于10-30 帧的DNA测序处理能力以及一更为灵敏的BigDye DNA测序标准(standard)。基于多通道 单光子检测器(例如基于一 32通道PMT传感器)的光谱仪将能够非常精确的高速检测多 色发射光。尤其是，所述检测器将证明高度精确的快速识别结合的荧光部分，以及高品质检 测DNA序列分析。

发明内容
一基于32通道PMT传感器的纤维化的单光子灵敏的光谱仪是高灵敏度的，其具有宽的检测动态范围。所述光谱仪可精确高速检测、鉴定和分析用多种荧光标记物标记的生 物样品，所述荧光标记物为例如由多种荧光染料发出的多色荧光信号或发射光的组合物。 所述光谱仪的光纤输入(fiberized optical input)可容易的有效的连接到任何基于纤维 采集分析的荧光的测量系统。所述光谱仪提供高度精确的DNA序列分析。一 32通道PMT 单光子检测器具有一高于20bits的检测动态范围和一大约每秒3300帧的帧速率。所述检 测器的像素的动态范围可达到每秒IO7光子计数并能增强10倍。采用有效增加多通道检测器的动态范围的信号处理方法来检测和识别结合的多 种荧光部分。在一实施例中描述了一荧光检测传感器，所述荧光检测传感器能检测由微量 多种荧光染料的混合物发出的单光子发射光，并能非常准确测定在染料混合物中各个染料 的含量。包括一 32通道PMT、一脉冲放大器、比较器和计数器的所述传感器或单光子检测器 可能具有的τ _时间等于或小于1ns，例如0. Ins或0.01ns。采用信号处理算法能精确分 离由各个荧光染料发出的荧光信号。尤其是，所述实施方式在此公开了 将多色光传输到光谱分离器的光导纤维；至少一多通道光传感器，每个光传感器通道具有适于接收来自所述光谱分离器的 不同的光谱，并在响应所述接收的光谱的单光子时产生电流脉冲的光敏像素；一多通道放大器，每个放大器通道适于接收与来自所述多通道光传感器的所述传 感器通道的一个对应通道的光谱对应的所述电流脉冲，并适于放大所述电流脉冲；以及一多通道光子计数器，每个光子计数器通道适于接收来自所述多通道放大器的所 述放大器通道的一个对应通道的所述放大的电流脉冲，所述多通道光子计数器具有适于在 一预设的时间区间累计每个计数器通道内的所述放大的电流脉冲的积分仪。还有公开一种鉴别DNA序列的方法，包括以下步骤用荧光染料对所选的DNA片段进行标记；将所述DNA片段输入到一光导纤维分离毛细管；用一预设波长的激光照射在所述光导纤维分离毛细管内所述标记的DNA片段以 产生所述DNA片段的荧光光谱；用来自所述DNA片段的荧光光谱照射光导纤维，所述光纤传送所述荧光光谱到一 光谱分离器，将所述光谱分离器的输出入射在至少一多通道光传感器上，每个光传感器通 道具有适于接收来自所述光谱分离器的不同光谱并适于在响应所述不同光谱的每个不同 波长的单光子时产生电流脉冲的光敏像素。还有公开一种检测颜色编码的微粒的方法，包括以下步骤用荧光染料标记微粒；在一缓冲液中悬浮所述标记的微粒；以一预设速度将具有所述标记的微粒的缓冲液传送通过一光导纤维毛细管；用激光照射在所述光纤毛细管中的标记的微粒以从其中产生荧光光谱；用来自所述标记的微粒的荧光光谱照射光导纤维，所述光导纤维传送所述荧光光 谱到一光谱分离器，将所述光谱分离器的输出入射在至少一多通道光传感器上，每个光传 感器通道具有适于接收来自所述光谱分离器的不同光谱并适于在响应所述不同光谱的每 个不同波长的单光子时产生电流脉冲的光敏像素。


为进一步理解本发明，可参考下列附图，其中图1是传统单光子传感器的方框图；图2是一显示从一购买的32通道PMT的一个通道直接测量到的脉冲的图片；图3是一具有单光子敏感性的传感器的方框图；图4是光谱分离组件的示意图；图4A是图4的光谱分离组件的透视图；图5是一具有两个32通道PMT检测器的双光谱分离组件的透视图；图6表示在用一 400MHz 26dB放大器放大后从一 SiPM 二极管测量到的脉冲；图6A是一 3级、2GHz、60dB脉冲放大器的电路图；图7显示一来自PMT的典型的Ins电压脉冲；图8是一 32通道单光子检测器的方框示意图；图9描述来自一 32通道PMT的一通道的放大脉冲的脉冲形状和在一 PECL比较器 后的脉冲形状；图10是一 2级脉冲放大器的电路图；图11是一显示一单光子检测器的通道串扰的图片；图12是一高速光子计数器的方框图；图13是一显示光与一单光子检测器的一个通道的光子计数特征的比较的曲线 图；图14中上面的组表示一具有32通道PMT传感器的光谱仪的通道分辨率，下面的 组表示所述光谱仪的波长分辨率；图15是一单光子检测器的光学系统的方框图；图16是一显示光与为三个波长测量的图15的所述单光子检测器的一个通道的光 子计数特征的比较的曲线图；图17表示在光子检测组件输出的光子计数分布的直方图；图18包括一单道(Iane)DNA测序仪的照片和示意图；图19包括上面的组中表示用于处理DNA序列分析数据的系统矩阵C的曲线图和 一下面的组中表示用于处理DNA序列分析数据的色彩解卷积矩阵；图20是DNA测序轨迹(traces)和碱基测定(base calling)质量分数(quality scores)的曲线图；图21包括显示色码识别和计算机模拟色彩解码的精确度的曲线图；图22是一小珠(bead)检测系统的示意图；图23是一显示随机染色小珠的识别的图片；图24是一 32通道快速大动态范围单光子光谱仪的方框图；图25是一 32通道脉冲放大器的电路原理图。优选实施的详细说明参照图3，其显示了一具有单光子敏感性的传感器10的方框图，所述传感器10是 用于测量由微量的多种荧光染料的混合物发出的发射光。如图4所示，一光输入纤维11采集多色荧光，然后所述多色荧光被传送通过一光谱分离组件12。在通过所述组件12后，分 解的荧光信号照射一 32通道光子传感器13的光敏像素，所述32通道光子传感器13可以 是，仅作为示例，由日本公司Hamamatsu制造的所述32通道PMT阵列(array) H7260-20。每 个所述分离的波长通过所述PMT的一个通道检测，并且所述PMT的每个通道可检测范围在 大约IOnm内的波长。所述接收的光子产生非常短的电流脉冲，所述电流脉冲经过放大和光 子计数。例如，如图7所示，当所述PMT以一单光子计数模式工作时，每个通道在响应一入 射光子流时产生一股短的(大约Ins)电流脉冲。所述脉冲振幅范围在0.4-0. 6mA之间，且 对应的峰值电压范围在8-12mV之间。用一设定的电压阈值小于所述脉冲振幅的比较器计 数所述脉冲。得到的光子计数被传递到一计算机14以进行记录和处理数据。在一实施例中，所述光谱分离组件12执行分离和测量波长范围在480nm到630nm 之间的多色荧光。参照图4和4A，通过一光导纤维输入16连接到一准直器17将所述多 色荧光传送到所述光谱分离组件，所述准直器17可以是例如由Thorlabs Inc, NJ制造的 所述F810SMA-543准直器。所述准直器17产生直径大约是IOmm的平行多色束。所述准 直的或平行的光束通过一激光拒波滤波器18并由一衍射光栅19将其分离成它的构成的 波长组分，所述衍射光栅19可以是一衍射光栅例如由Thorlabs Inc, NJ制造的衍射光栅 GR13-1850。在一实施例中，所述衍射光栅19可以被调谐进行光谱分离和测量波长范围在 490nm到630nm之间的荧光。将分离的单色束组分聚焦到所述32通道PMT 13的像素上。所述聚焦可通过一球 形聚焦镜21和一柱面透镜22来完成，所述球形聚焦镜21可以是由Thorlabs Inc,NJ制造 的球形聚焦镜CM254-075-G01，所述柱面透镜22可以是也是由Thorlabs Inc制造的柱面透 镜 LJ1095L2。在一实施例中，所述光谱分离组件可检测与IOnm不同的波长。每个分离波长主要 是由所述PMT的一个通道进行检测。每个PMT通道检测范围在大约IOnm内的波长。所述光谱仪的光谱分离组件可提供高达Inm的光谱分辨率。可通过具有由0. 2mm 间距分开的0. 8mmX 7mm检测带的32通道PMT获得大约IOnm的光谱分辨率。已有发现可 通过采用接收光的纤维阵列(arrays ofphotoreceiving fibers)来提高所述传感器的总 的光谱分辨率，每个阵列被连接来照射一单光子传感器。已发现所述具有一用于每个光子 传感器的纤维束的光谱仪的光谱分辨率为大约5nm。实际上，在一些应用中，当需要高的光 谱分辨率时，所述接收的光导纤维可作为带通滤波器使用。如以下更详细的说明所述，如果 荧光染料具有一宽的光谱，一些阵列的光导纤维束可被用来采集所述染料的光谱并引导其 覆盖所述光谱仪的一些通道。根据图5，一实施例的一光谱仪可适用于更宽范围的波长。可采用一二色片分束 器扩大所述波长的范围，所述二色片分束器可以是例如由Edmund Optics, Inc, NJ制造的 分束器NT47-424。所述分束器也可以是由Semrock Inc.，NY制造的分束器FF650_Di01。 在准直所述入射的发射光或光后，所述分束器23将所述准直的光分成两部分。较短波长 (例如Edmund分束器的530-585nm波长或Semrock分束器的500_640nm波长)被偏转到 一通道24。同时，较长波长(例如Edmund分束器的601-800nm波长或Semrock分束器的 660-825nm波长)被引导入一第二通道26。因此所述较长的和较短的波长在所述光谱仪中 被空间分离将近90度。根据检测器设备的类型，一二色片分束器的使用允许在波长范围为500nm-800nm和300-500nm内，所述光谱仪具有更宽范围的光谱分离和更高的光谱分辨率。 已发现可购买得到的检测器组件H7620-20和H7620-04可分别地用于所述波长范围。在相关领域的普通技术人员将理解一传感器或光谱仪可包括两种不同类型的多 通道单光子检测器。例如，在不脱离本发明的范围下，对于较长波长可采用一 PMT，而对于 较短波长可采用一硅光电倍增管(SiPM) 二极管检测器。所述SiPM 二极管是CMOS技术，相 对便宜的，并包括在一普通硅衬底上并联连接在一起的各个像素的矩阵。为响应单光子，一 SiPM产生单电压脉冲。所述技术是SiPM阵列可被用于与所述驱动(driving)和读出的电 路在所述相同芯片上集成。SiPMs是高增益的，增益高达IO5-IO7,并在相对低电压(例如 20-70V)上工作。它们的响应时间范围是l_20ns。参照图6，可观察到在用400MHz、26dB脉 冲放大器放大后，可从一 SiPM 二极管得到大约2ns单光子脉冲。已发现与一 SiPM 二极管 连接的1级、2级或3级2GHz、60dB SiPM脉冲放大器可用作为用于在单光子计数领域的单 光子的检测器。图6A表示一 3级2GHz、60dB脉冲放大器的电路图。SiPM阵列也可用作为 一用于单光子光谱仪的单光子传感器。也有发现SiPMs适用于检测DNA序列分析。相关领域的普通技术人员应理解的是，半透明镜可用于代替二色分光镜。由于将 通过两个单光子检测器检测由所述光谱仪接收的全部光子束，采用半透明镜可扩大检测动 态范围。同样地，所述光子束可被分成若干束，每个所述束由专用的单光子检测器检测。所 述方法也可用于扩大所述光子检测系统的动态范围。参照图8，在一实施例中，一检测器包括一 32通道脉冲放大器27和一 32通道光子 计数器31，所述32通道脉冲放大器27可以是基于表面安装设备技术，而所述32通道光子 计数器31可以是基于现场可编程门阵列(field programmed gate array)。所述检测器 的放大器部分包括32个相同的脉冲放大通道28，其中每个通道在一实施例中具有35-40dB 增益和IGHz带宽。所述检测器还可具有32个快速比较器29，每个比较器具有的上升和下 降时间为大约2ns。该排列限制最小脉冲宽度为将近4. 5ns并将PMT负脉冲从10_50mV提 高到能可靠地触发所述比较器的水平。图9显示，在上面的轨迹中所述来自一 32通道PMT 的一个通道的放大的脉冲的脉冲形状和在下面的轨迹中在一 PECL比较器后所述脉冲的形 状。参照图10，其显示一脉冲放大器的电路的一实施例，一 2级放大器包括2BGA427放 大器32和33，即分别是U57和TO8。每个放大级提供2GHz范围内的20db放大倍数。所述 放大信号被输入到一具有τ _为Ins的ADCCMP553LVPECL比较器34。一放大的负信号脉 冲从所述比较器产生一 PECL水平输出脉冲，所述PECL水平输出脉冲被输入到所述计数器 31(图 8)。可采用一电位器36 (即电位器R9)调节所述参比电压从0到3. 3伏。在一实施例 中，所述参比电压可被设定从1.2V(所述放大器的中点)一直到所述放大脉冲振幅。可选 择接近于所述脉冲最低值并尽可能停留在噪声水平以上的阈值电压。可以理解的是，1级 放大器也可为触发所述比较器34提供充分的增益。在所述实施例中，可以不采用电容器 37(即电容器C35)。得到的电路提供20dB放大倍数，并改变一次所述脉冲的极性。如图9 所示，在高的轨迹中显示的是在被输入到所述比较器34前的放大的脉冲的脉冲形状，以及 在低的轨迹中显示的是来自所述比较器34的脉冲输出的脉冲形状。在单光子检测器中可能发生两种主要类型的串扰。一种是在所述32通道PMT内的电子串扰。图11的图形表示在所述PMT的相邻的通道之间的典型的串扰。所述串扰由 所述PMT内的电子光学的一定特征所产生。在一 32通道PMT内的通道串扰包括一光学的 和一电子的分量(component)。由于不完全的光线聚焦照射相邻的通道而产生光学串扰，而 所述电子串扰是由在所述PMT通道之间的内部电流产生。当各个通道被光导纤维照射时， 可在已知的32通道PMT的通道中观察到3%级的较小的通道串扰。另一种类型的串扰是在所述放大器内的所述放大通道和在所述计数器内的所述 通道之间的电子串扰。一般来说，至今仍未观察到在所述放大器的通道和所述32通道光 子计数器的通道之间的电子串扰。然而，即使在传感器内的非常小的通道串扰也可引起在 例如染料混合物的分析中的错读，尤其是在不同染料组分的组合物的数量级(orders of magnitude)不同的时候。为了使所述光学串扰最小化，可通过在单PMT通道上聚焦一来自 现有的532nm NdYAG激光器的光束来照射所述单PMT通道。可以看出，所述完整通道串扰 仅限于几个百分点，并且其与在主要的通道内测量到的信号是线性相关的。再参照图8，在放大后，所述放大器27的每个通道的输出被输入到所述32通道高 速光子计数器31中。计数器31累计到达所述通道输入端的脉冲。由所述计数器31内的同 步生成器提供积分时间区间(未显示)。在一实施例中，所述最小积分时间是大约0.3ms。参照图12，图中的方框图显示所述高速计数器31的一实施例的详图(图8)。在 该实施例中，所述高速计数器包括一对相同的计数电路38和38A。每个计数电路包括一三 字节PECL计数器39和39A、分别三个PECL到TTL 3态缓冲器41A-C和41D-F，以及分别三 个与门(ANDgates)42A-C和42D-F。每个计数电路输入到一同步电路，所述同步电路包括一 固定值同步字节单元44、一同步块两字节计数器46、三个3态缓冲器47A-C和3与门(AND gates)48A-C。所述高速计数器也包括一控制电路49，所述控制电路49包括一晶体振荡器51、一 14级二进制纹波计数器52以及多个开关53，每个开关53对应于所述计数器52的一个级。 所述控制电路49还包括一字节计数器54、所述字节计数器的输出被输入到一块计数器56。 所述字节计数器54和块计数器56各自连接到所述与门42A-F和48A-C。所述字节计数器 54的输出也被输入到一对额外的与门57A和57B，每个所述与门57A和57B连接到四个TTL 到PECL转换器58A-D中的一个。一非门(NOT gate) 59连接到所述块计数器56和所述与 门42A-F和48A-C。所述控制电路包括一连接到每个所述四个TTL到PECL转换器58A-D的 触发器。一 LPT输出控制电路62包括一时间延迟器63、或门(OR gates)64和一触发器。来自所述高速放大器27的脉冲被同时提供到所述3字节PECL计数器39和39A 的输入端。这些计数器中的一个一直处于计数状态，而另一个则暂停使用(on hold)。累积 的数据被一个字节接一个字节地通过对应字节数的PECL到TTL 3态缓冲器传送到LPT端所述三字节PECL计数器39和39A的态由被对应的TTL到PECL转换器58A-D转 换的控制电路信号决定。例如，来自所述TTL到PECL转换器58B的输出信号设置和保持所 述三字节PECL计数器39在暂停使用状态以及，同时，设置所述三字节PECL计数器39A进 入计数状态。来自所述TTL到PECL转换器58C的输出信号设置和保持所述三字节PECL计 数器39A进入暂停状态以及设置所述三字节PECL计数器39进入计数状态。在所述对应的 三字节PECL计数器的数据被转换到所述LPT端口 67后，转换器58A和58C的输出信号重新设置对应的三字节PECL计数器。在每个102传输字节后，开始所述同步电路43的三个同步字节。如图11所示，所 述第一字节具有固定值00010001，以及第二和第三字节代表所述同步块两字节计数器46 的随后的当前状态。所述计数器46的同步字节输出通过对应的3态缓冲器47A-C被传送 到系统输出67。控制电路49的晶体振荡器51产生2MHz同步脉冲，并传输到14级二进制纹波计 数器52。所述计数器52具有14个输出引脚(output pins)，通常由参考数字68表示。每 个引脚输出同步脉冲，所述同步脉冲的起始频率由一从2到16386的系数划分。采用所述 开关53选择一从1-14的适当的引脚，从而设置全部电路的同步频率。在该实施例中，所述 开关可设置所述数据传输到所述LPT端口 67的传输速度为从122到1，000，000字节每秒。所述同步脉冲被传送到所述字节计数器54。在接收每个同步脉冲后，所述字节计 数器54继续对三个输出的每一个产生一信号，如图11中的“字节”数字1、2和3所示。每 个所述信号传输一对应的数据字节，且每个数据字节被传输到计数电路38和38A。每个数 据信号也通过一对应的与门48A-C被传输到同步电路43。字节计数器54的第4输出的高位(high)重新设定所述计数器，并传输到所述块 计数器56，所述块计数器计数所述传输的3字节代码的数量。经计数所述第34个3字节 代码，结果等于102数据字节，所述块计数器56对所述第35个3字节代码产生信号。该信 号被传输到所述与门48A-C，所述与门48A-C能将同步电路数据传输到所述LPT输出端67。 同时，对所述第35个3字节代码的信号阻止(blocks)所述计数电路38和38A的输出。如 图11所示，响应所述第36个3字节代码的所述块计数器56的输出信号重新设置所述计数 器，并阻止所述同步块两字节计数器46以计数105字节顺序(byte sequences)的数量。在 达到65536的数值后，所述同步块两字节计数器46复位。所述触发器61由字节计数器54的每个第一字节脉冲触发。由所述触发器61产 生的信号交替地使三字节PECL计数器39和39A进入计数或暂停使用状态。所述信号也启 用或禁用所述计数器输出，并且允许或阻止通过与门57A和58B来传送所述复位脉冲到所 述计数器。图13的曲线图显示典型的光与图12所示所述类型计数器的一个通道的光子计 数特征的比较关系。再参照图7，一实施例的一脉冲放大器的输入和输出都有描述典型的电压脉冲。所 述放大的脉冲的宽度大约是5ns，大约是所述输入脉冲宽度的5倍宽。所述检测器的动态范 围(光子计数最大值与暗噪音的比值)为_20bit。由于采用数据记录软件，所述计数器可 分辨脉冲持续时间小于2ns以及脉冲振幅为-1. 5V的脉冲。由于本实施例的32通道单光子检测器具有灵敏度和线性，因此可记录高达每秒 5X IO7计数的光子计数速率。实际上，所述检测器的线性使得线性光子计数具有非常宽的 范围，例如高达和超过每秒2X107光子计数。也已观察到高达2X IO8的光子计数。这些计 数范围将超过任何已知的可购买的单光子检测器的检测动态范围。通过将本实施例所述检 测器的光子检测效率与现有的单光子检测器(例如SPCM-AQR-12-FC型)的光子检测效率 比较，结果表明，在490nm时本实施例所述32通道PMT检测器的光子检测效率约占上述现 有的SPCM的光子检测效率的20%，并且在610nm时降到5%。参照图8和图12，所述计数器31采集的数据被传送到一采用标准IEEE 1248并行
11端口接口 67的计算机。通过采用二进制格式以105字节的帧传送所述数据。数据帧包括 用于所述32检测通道的获得的计数数值(每通道3字节)。每个帧以6字节首部起始，所 述6字节首部包括以下字段1字节计数器类型、2字节帧数和一以毫秒测量的2字节计数 周期持续时间(2-byte counting period length)。所述帧数包括当前帧的数目。对于每 个下列的帧，数目增加量为1，因此形成伴随溢出(overflow)的上升的序列。所述帧数可作 为同步标记，并通过数据处理软件被应用来在连续数据流中查找数据帧。帧数也用于验证 数据完整性和用于查找干扰在传输线内引入的错误。一专用的软件包实现由所述计数器传 送的数据的记录和在线可视化。在处理的荧光光谱中，信号处理的主要任务是检测各个荧光染料在由染料混合物 产生的荧光信号中的分布，所述染料混合物由具有不同的和已知的荧光光谱的η染料组 成。在所述光谱仪对所述检测到的荧光产生线性响应的条件下，可通过分解在所述光谱仪 的N个独立通道内测量到的荧光来发现各个染料在所述混合物中的分布。通过举例，如果所述分析的荧光染料的数目η < Ν(例如在DNA序列分析时 = 4)，那么采用一已知系统矩阵技术H(Nxn) = (hi; h2...，hn)，其中比=(hn...hNi)T， (l^i^n)是代表在所述分析的染料混合物中的荧光染料的光谱的N组分向量，通过在对 各个荧光染料hi的光谱响应前校准所述系统是可能得到一系统矩阵H。假设r = Ov . . rN) T是所述染料混合物的测量得到的荧光光谱，以及S = (S1, S2, ... , sn)T是代表各个荧光染 料的浓度的组分重量的向量，那么在噪声ω = {ω”.. ωΝ)τ存在下，所述测量得到的光谱r 为 方程式(1)的最优解s取决于所述噪声组分Oi的分布性质。可提出一简化的假 设，即ω i是独立的，并假设正常随机值的分布相同，由Kay在1993年得到一熟知的计算的 有效的最小方差无偏的解决方案，(Fundamentals of Statistical Signal Processing. Estimation Theory at p. 97)，其估计的§如下 在光子计数中，各个速率观察结果A具有带有相等的均值和方差的泊松分布。对 于更高的光子计数速率(超过每观察周期50计数)，通过重叠‘真实’ (true)平均速率厂和 高斯噪声Qi使得观察到的速率十分接近，同时取决于平均速率的方差如下 通过g获得更精确的解决方案，即所述分量ω i独立不恒等地分布正常随机变量。 至今已由Kay于1993年在Id导出方程式(1)的如下通解 其中C是分量(Oi的协方差矩阵。由于(Oi的独立性，所述矩阵C对角线的
其中σ /是变量ω”实际上，所述平均速率厂未知，而观察的速率ri用于计算所 述方差η = η .对每个测量法估计方差ο Λ关于ο /和A的函数对每个用于获得A的预处理 方法是特定的。例如，如果通过在采样周期期间计数光子而直接获得那么σ,2 = /V。如果从 所述计数观察结果减去背景bi;那么σ,2 二/7 +A1 。如果通过对在k采样期间的计数观察结果 取平均值得到那么σ,2 = /ν·/λ。方程式(3)的估计值更精确，但比方程式(2)的估计值需 要更多计算资源。上述信号处理技术允许在所述串扰除去的阶段(stage)减去背景。这可通过创建 代表所述背景的其它光谱(矩阵H的列)而获得。方程式(2)和(3)的估计值以及新的矩 阵H将从其它光谱分量中分离所述背景。参照图15，图中的方框图显示了用于表征所述单光子检测器的测量装置 (measurementsetup)。在该装置中，光源69的光通过一组中性滤光器71并连接到所述末 端连接一 GRIN透镜72的纤维上，所述光源69可以是一单色器或一 532nm激光器。GRIM透 镜的光被聚焦到所述32通道PMT的32光阴极的其中一个光阴极上。在图16中描述了采 用图15所示具有一单色器作为所述光源69的装置的单光子检测器所测量得到的光子计数 和光特性。可以看出，对所有三种检测的波长，所述检测器的输出保持线性达到每秒108光 子计数，而检测器的动态范围超过每秒2 X 108光子计数。与波长630nm相比较，波长488nm & 530nm的绝对计数率的显著差异有图解说明。所述PMT的量子效率在长于600nm的波长 时出现下降。本实施例的光子计数系统的噪声由光子计数的暂时分布来确定。一正确操作的光 子计数器采用泊松分布，对泊松分布估计的光子计数率的方差(例如在积分期间计数的光 子的数目)等于其平均值。这为所述光子检测器的信噪比设定了较低的界限。图17表示 在四个不同的照射水平所述光子计数在所述光子检测组件的输出的分布的直方图。对每个 照射水平，在25ms区间期间采集所述光子计数，然后采用数据记录软件记录大约30min。图 17显示对所有四个照射水平在平均值和方差之间有良好的匹配。这表明所述检测的噪声仅 是由所述检测器检测的光子流的随机性质引起，并且所述检测器本身不产生任何额外的噪 声。在一实施例中，单光子光谱仪可用于需要一灵敏检测和识别由一些已知应该染料 组成的混合物的应用中。尤其是，这里所描述的光谱仪可用作为光电传感器用于检测DNA 序列分析，其是在一单个熔融的石英毛细管中进行电泳并通过采用由现有的Ar-离子和 Nd-YAG激光激发荧光来实现的。可采用分别针对Ar-离子和Nd-YAG激光器的50D 522nm 和 538nm 激光流线式过滤器(522AELP，538AELP，Omega Optical Inc, VT, USA)来消除激光 波长。参照图18，图中显示为一单道DNA序列测定仪的一实施例的照片和原理图。DNA 样品在如照片所示的单个毛细管分离组件中经过电泳分离。所述组件包括一具有一内置 电压表和安培表的小型高压电源73(高达15kV)、一聚合物置换系统74、一温度控制系统 76(25-70°C 士0. Ol0C )、一用于DNA样品和电泳缓冲液的导管转换传送带77以及一精确的光学系统78。参照图18的原理图，当所述荧光标记的DNA片段经过所述光学系统78时，它 们被一纤维化的激光器(例如但不限于一由Uniphase，CA制造的Ar-离子激光器(488和 514nm,20mff)或一由 CrystaLaser，NV 制造的 Nd: YAG 激光器(532nm, 25mff, GCL-025-S))照 射。所述激光诱导的荧光由一具有200mkm芯直径的纤维81采集，并被传送到所述光谱分 离组件(图3)。在一实施例中，由Omega Optical Inc, VT制造的50D 522nm和538nm激 光流线式过滤器(522AELP和538AELP)可分别用于消除Ar-离子和Nd-YAG激光器的激光 波长。用从Applied Biosystems (Foster City, CA)获得的 BigDye 终止子 vl. 1 序列分 析标准标记的DNA样品在25 μ 1甲酰胺中变性，并在注射前立即用HPLC级别的水稀释1到 5倍。DNA在40cm (分离长度35cm)未涂层的毛细管中以150V/cm的速率进行分离，所述未 涂层的毛细管具有一 50 μ m内径和一 365 μ m外径，并充满50°C的P0P-7分离培养基。在该 实施例中采用电泳缓冲液。至少有两种有效方法用于估计由用于标记A、C、G和T终止子的四种染料产生的荧 光强度。一种所述方法是分解根据上述方程式(3)测量得到的光谱。至于所述完全的测量 得到的光谱的分解，所述描述各个染料的光谱分量Ci在实验上通过检测由每种染料分别发 出的荧光以及通过归一化光子计数率的测量得到的向量而获得。检测每个时帧所述混合物 中的各个染料s[n]的浓度。得到的染料浓度的顺序形成四个序列分析轨迹，并进一步用于 碱基测定(basecalling)。另一个方法是采用虚拟滤波器。如果所述组分光谱能很好地分离，可采用虚拟滤 波器的方法。包含具有空间上能很好分离的波长的光谱的入射光照射具有一选择的可接受 角度的纤维束的输入端。由于接受角度有限，特定的纤维采集仅来自特定波长的信号并传 送信号到所述光检测器的特定通道。在一实施例中，虚拟滤波器可由选择的三种PMT通道 构成，因此由所述三种PMT通道中的一个通道捕获每种染料的荧光的三种不同波长中的每 一种波长，从而最大地促进在指定的通道中测量，并使得在其他通道中响应最小化。该系统 提供用于检测不必要的多色荧光的带通滤波器。在另一实施例中，由一群若干(例如三根) 纤维或纤维束同时捕获一具有特定波长的特定染料的空间宽谱。所述安排允许所述系统的 动态范围有显著增加，而所述系统的信噪比没有下降。在一实施例中，可得到具有窄的发射光谱的光谱的线性高动态范围。可通过一个 所述PMT通道捕获每种染料的荧光的若干波长的每一种波长，因此最大地促进在指定的通 道中检测，并使得在其他通道中响应最小化。所述纤维将所述特定波长传送到IXN光检测 器中对应的检测器。所述信号被从所述对应的检测器传送到一 MXN光检测器以采集空间 分离光谱。可采用投射光学来将Nth波长投射到所述MXN光检测器的第Nth柱。因此，由M 单光子光检测器同时采集特定波长的信号。所述安排也为所述系统取得高线性动态范围和 高信噪比。在用于所述实施例的数据处理方法中，所述四个序列分析轨迹进行标准处理，所 述标准处理包括噪声过滤或平滑、减去基线、除去串扰、泳动率变动校正、峰高和间距均等 化。在对每个峰的7-15点重新取样后，所述轨迹以.SCF格式保存，并由标准碱基测定PHRED 软件处理。被返回的处理的结果是碱基测定的序列以及它们的位置和质量评分。如上所述，至少有两种方法用于处理DNA序列分析数据。参照图19，图中显示一系
14统矩阵曲线图82和分别用于Ar-离子和Nd-YAG激光器的彩色解卷积矩阵83和84，一简化 数据处理方法将采用从所述PMT的通道18 (546nm)、通道15 (568nm)、通道11 (589nm)和通 道5(610nm)获得的信号。通道18、15、11和5分别对应于G、A、T和C。在图19的下面的 组中以电子数据表格式说明用于Ar-离子和Nd-YAG激光器的衍生的色彩解卷积矩阵83和 84。相反地，用于检测系统矩阵H的光谱分量h可在实验上通过测量得到的由每种染料分 别发出的荧光以及通过归一化如图19的上面的组的曲线图82所示的光子计数率的测量得 到的向量而获得。上述处理序列分析数据的方法得到相似的序列分析轨迹和碱基测定质量。然而， 对于由小信噪比表征的测量方法，由于其采用关于由每种染料发出的荧光的完整信息而不 是采用仅在所述光谱仪的四种选择的通道中获得的荧光的信息，因此完整测量光谱的分解 得到更好的结果。采用从所述染料获得的完整的荧光光谱的另一个优点是所述检测动态范 围的显著增加。实际上，在这里所述的32通道光传感器中，所述通道具有高达每秒2 X IO7 光子计数的线性响应，并且如果所述检测的荧光染料具有宽的光谱，对于该染料的所述检 测的线性范围将与所述传感器的同时照射的通道的数目成比例。图20显示用采用Ar-离子和Nd-YAG激光器的这里描述的光谱仪的一个实施例获 得两个DNA序列分析轨迹和碱基测定质量评分。用所述两个激光器记录的序列分析轨迹非 常相似，而所述质量评分几乎相同。得到的Q20序列阅读长度为大约650个碱基对，所述阅 读长度与由在现有的DNA测序仪(例如Applied Biosystems Inc制造的ABI-3730型)中 相同毛细管长度得到的阅读长度非常一致。在一实施例中，所述单光子光谱仪可识别和精确地译解色码。参照图21，上面的组 显示检测和解码包含三种具有强烈重叠光谱的QDs的混合物。图21的中间的组显示当QD2 的混合物含量从0%变化到15%时，可得到预混合的和解码的浓度的几乎完美的匹配。图 21的下面的组的曲线显示由对每种QDs的混合物进行几千次测量(每次测量大约10，000 光子)而得到的解码统计结果以及由单光子光谱进行的测量的计算机模拟而得到的解码 结果。在一实施例中，所述单光子光谱仪可检测色编码的微粒。参照图22，图中显示一小 珠阅读器系统，在所述小珠阅读器系统中各个小珠悬浮在一保持在一小珠抽出系统86中 的缓冲液中。通过以高速将所述小珠压出通过一毛细管87来检测所述小珠。一激发光束 88激发所述小珠内的荧光。通过一光纤维化的检测器89检测所述荧光，并且所述荧光被 传送通过一合适的光谱仪或光学反射系统91到达一单光子检测器92。由一计算机记录所 述检测的信号(未显示)并适当地处理所述记录的数据。在一实施例中，所述抽出系统86 是一可编程的微量泵，且所述毛细管是一 25 μ m ID毛细管。所述毛细管被插入到一光学头 (optical head)(未显示)以确保由激发光束88均勻照亮所述毛细管。所述光束88由一 合适的纤维化激光源(未显示)产生。当所述小珠经过所述激光束时，它们发出荧光，所 述荧光由纤维化的小型物镜(micro-objective) 89收集。收集的荧光被传送到所述光谱仪 91，在那里由单光子检测器92检测，在本实施例中所述单光子检测器92是一高速多通道检 测器。参照图23，可采用图22的小珠阅读器来检测随机染色的小珠。在一实施例中，检 测用量子点(quantum dots)染色的聚苯乙烯珠。得到的对100个所述小珠解码的结果在图23中显示，其中所述χ轴表示由小珠阅读器检测的顺序(order)中的小珠数量，所述y 轴表示归一化到1的小珠代码。前述小珠检测系统的主要特征是小珠的数量，所述小珠的数量可在每单位时间 检测，并以要求的精度解码。一般来说，解码精度由在小珠检测时间期间采集的光子数量 决定。应理解的是对于购买得到的多组量子点，如果从所述小珠采集得到的光子总数大于 104，可得到高达99%的解码精度。检测所述小珠的速率取决于所述光子检测器的动态范 围。参照图24的方框图，在一实施例中，用一光子检测器检测得到高达每秒IO4的小珠的 检测率，所述光子检测器包括一光谱分离组件93、一 32通道PMT94、一 32通道FPGA96、一高 速USB微控制器97和一计算机98。所述系统具有一每通道每秒IO8光子计数的线性范围 和一每秒32MB的数据传送率。图25显示在图24中方框图显示的所述系统的32通道脉冲 放大器的一个通道的电路原理图。尽管上面描述具有一定程度的特异性或精确度的各种实施例，或参考各个实施例 的一个或多个，本领域技术人员在不脱离这里要求保护的本发明的精神或范围，可对公开 的实施例作出各种改变。其目的是在上述说明书中包含的并在附图中显示的所有的主题， 将被解释作为仅对特定实施例进行举例说明，但不限制本发明。在不脱离本发明的基础上 作出的细节或结构上的改变如以下的权利要求书所界定。
权利要求
一种单光子传感器，包括至少一多通道光传感器，每个光传感器通道具有适于接收不同光谱并适于在响应所述接收的光谱的单光子时产生电流脉冲的光敏像素；一多通道放大器，每个放大器通道适于从所述多通道光传感器的所述传感器通道中的对应的一个通道接收所述响应光谱的电流脉冲并适于放大所述电流脉冲；以及一多通道光子计数器，每个计数器通道适于从所述多通道放大器的所述放大器通道中对应的一个通道接收所述放大的电流脉冲，所述多通道光子计数器具有一适于在预设的时间间隔累计在每个计数器通道内所述放大的电流脉冲的积分仪。
2.根据权利要求1所述的单光子传感器，所述单光子传感器包括将多色光传输到一光 谱分离器上的光导纤维。
3.根据权利要求2所述的单光子传感器，其中，所述至少一个多通道光传感器包括一 具有多通道的线性光电倍增管阵列，每一个所述通道接收来自所述光谱分离器的不同光谱。
4.根据权利要求3所述的单光子传感器，其中，所述线性光电倍增管阵列选自下列组 包括具有多于4个通道的线性光电倍增管阵列、具有多于8个通道的线性光电倍增管阵列、 具有多于16个通道的线性光电倍增管阵列和具有多于32个通道的线性光电倍增管阵列。
5.根据权利要求4所述的单光子传感器，其中，所述线性光电倍增管阵列包括32个通道。
6.根据权利要求5所述的单光子传感器，其中，所述多通道放大器包括32个脉冲放大 通道，每个所述脉冲放大通道适于接收来自所述线性光电倍增管阵列的32个通道中的对 应的一个通道的所述电流脉冲。
7.根据权利要求1所述的单光子传感器，其中，由所述至少一个多通道光传感器的每 个通道产生的每个所述电流脉冲具有一小于2纳秒的持续时间τ响’
8.根据权利要求1所述的单光子传感器，其中，由所述至少一个多通道光传感器的每 个通道产生的每个所述电流脉冲具有一小于1纳秒的持续时间τ响’
9.根据权利要求1所述的单光子传感器，其中，由所述至少一个多通道光传感器的每 个通道产生的每个所述电流脉冲具有一小于0.1纳秒的持续时间τ响’
10.根据权利要求1所述的单光子传感器，其中，由所述至少一个多通道光传感器的每 个通道产生的每个所述电流脉冲具有一小于0.01纳秒的持续时间τ响’
11.根据权利要求1所述的单光子传感器，其中，所述多通道光子计数器的线性光子计 数范围为每秒至少IO7光子计数。
12.根据权利要求1所述的单光子传感器，其中，所述多通道光子计数器的线性光子计 数范围为每秒至少IO8光子计数。
13.根据权利要求1所述的单光子传感器，其中，所述多通道光子计数器的线性光子计 数范围R是R ≥ 1/τ响应 ，其中τ 是所述单光子计数器为响应一单光子所需要的时间。
14.根据权利要求1所述的单光子传感器，其中，所述多通道光传感器包括一硅光电倍 增管，所述多通道光传感器的每个通道包括各个像素的矩阵，所述通道在一普通硅衬底上 并联连接在一起。
15.根据权利要求2所述的单光子传感器，所述单光子传感器包括一对所述多通道光传感器以及一适于接收入射的多色光以及适于产生所述多色光的两个分离光束的分光器， 每个所述光束入射在一对所述光谱分离器中的一光谱分离器上。
16.根据权利要求15所述的单光子传感器，其中，每个所述一对多通道光子传感器的 每个传感器通道具有光敏像素，所述光敏像素适于接收来自所述一对光谱分离器的每一个 的不同光谱以及适于响应其而产生电流脉冲。
17.根据权利要求15所述的单光子传感器，其中，所述分束器包括一二色镜。
18.根据权利要求15所述的单光子传感器，其中，所述分束器包括一半透明镜。
19.根据权利要求1所述的单光子传感器，其中，所述多色光包括由一由多种荧光染料 构成的混合物产生的荧光光谱。
20.一种单光子传感器，包括光导纤维，所述光导纤维适于接收入射多色光的单个波长 以及适于将所述光的单个波长传送到限定多通道光传感器的一个或多个通道的光敏像素。
21.根据权利要求20所述的单光子传感器，其中，所述入射多色光包括由一由多种荧 光染料构成的混合物产生的荧光光谱。
22.根据权利要求21所述的单光子传感器，其中，所述光导纤维包括限定一接收对应 所述入射荧光光谱的单个波长的光的预设的角度的输入端。
23.根据权利要求20所述的单光子传感器，其中，每个所述光导纤维适于接收所述入 射荧光光谱的单个波长，所述入射荧光光谱的单个波长与由其它所述光导纤维接收的入射 荧光光谱的波长不同，并且每个所述光导纤维适于将入射荧光光谱的单个波长传送到所述 多通道光传感器的一对应通道上。
24.根据权利要求22所述的单光子传感器，其中，预设的多个所述光导纤维适于接收 所述入射荧光光谱的单个波长，并适于将所述入射荧光光谱的单个波长传送到所述多通道 光传感器的一对应的多通道上。
25.一种鉴别DNA序列的方法，包括以下步骤用荧光染料标记所选的DNA片段；将所述DNA片段输入到一光导纤维分离毛细管；用一预设波长的激光照射在所述光导纤维分离毛细管内的所述标记的DNA片段以产 生来自所述DNA片段的荧光光谱；用来自所述DNA片段的荧光光谱照射光导纤维，所述光导纤维传送所述荧光光谱到一 光谱分离器，将所述光谱分离器的输出入射在至少一多通道光传感器上，每个具有光敏像 素的光传感器通道适于接收来自所述光谱分离器的不同光谱并适于在响应所述不同光谱 的每个不同波长的单个光子时产生电流脉冲。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述激光由选自下列组包括Ar-离子和Nd YAG激光器的激光器产生，所述激光器的波长在488nm到532nm的范围内。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述预设波长是488nm、514nm和532nm中的一个。
28.根据权利要求25所述的方法，其中，所述光导纤维分离毛细管具有一大约为200微 米的芯直径。
29.根据权利要求25所述的方法，所述方法包括在所述光导纤维分离毛细管中电泳分 离所述DNA片段的步骤。
30.根据权利要求25所述的方法，其中，所述至少一个多通道光传感器包括一32通道 的线性光电倍增管阵列。
31.一种检测颜色编码的微粒的方法，包括以下步骤 用荧光染料标记微粒；在一缓冲液中悬浮所述标记的微粒；以一预设速度将具有所述标记的微粒的缓冲液传送通过一光导纤维毛细管； 用激光照射在所述光导纤维毛细管中的所述标记的微粒以从其中产生荧光光谱； 用来自所述标记的微粒的荧光光谱照射光导纤维，所述光导纤维传送所述荧光光谱到 一光谱分离器，将所述光谱分离器的输出入射在至少一多通道光传感器上，每个具有光敏 像素的光传感器通道适于接收来自所述光谱分离器的不同光谱并适于在响应所述不同光 谱的每个不同波长的单个光子时产生电流脉冲。
32.根据权利要求31所述的方法，所述方法包括用权利要求1所述的单光子计数器计 数所述不同光谱的每个不同波长的所述光子的步骤。
全文摘要
一种基于32通道PMT传感器的纤维化单光子敏感光谱仪是高度敏感的，其具有宽的检测动态范围。所述光谱仪能精确地和高速地检测、鉴定和分析用多种荧光标记物标记的生物样品，所述荧光标记物为例如由多种荧光染料发出的多色荧光信号或发射光的组合物。所述光谱仪的光纤维输入允许方便的有效连接到任何基于纤维采集所述分析的荧光的检测系统。所述光谱仪提供高度精确的DNA序列分析。一32通道PMT单光子检测器具有一大于20bits的检测动态范围，以及一每秒大约3300帧的帧速率。所述检测器的像素的动态范围达到每秒108光子计数。
文档编号G01J3/28GK101889192SQ200880114477
公开日2010年11月17日 申请日期2008年10月24日 优先权日2007年10月25日
发明者乔治亚·古德科夫, 伊万·托夫卡奇, 伯利斯·左博维斯奇, 安德烈·特苏普力克, 德米特罗·古德考夫, 德米特里·盖弗瑞洛夫, 维拉·左芬科勒 申请人:纽约州立大学研究基金会