用于纯化核酸的装置、系统和方法

专利名称：用于纯化核酸的装置、系统和方法
技术领域：
本发明涉及化学物质的纯化，更具体而言，涉及用于进行化学纯化和分析的装置、 方法和系统。再具体而言，本发明所提供的装置、方法和系统在核酸的纯化和分析方面具有 特别有用的应用，尤其是用于进行所述纯化和分析的微流体装置。本发明可用于分析化学、 法医化学、微流体和微型装置、医药和公共健康领域中。
背景技术：
创造高度小型化化学装置的半导体制造技术的发展(Beach，Strittmatter等 2007)已为分析化学带来了革命，所述革命特别是通过提供以极高的精密度和准确度鉴定 复杂混合物中以低浓度存在的化学物质的工具而得以实现。该革命对于化学处理、医药、法 医科学和国防等领域已经产生了重要影响，在这些领域中，所述装置能够提供快速、便携并 且经济的生物检测器。这种装置的实例包括用于收集和鉴定微粒的装置(Wick 2007)、用于 检测分子污染物的系统(Knollenbergjodier等2007)和用于检测蛋白质的装置(Terry， Scudder等2004 ；Deshmukh 2006)。其它装置利用自动化系统中的聚合酶链反应(PCR)，使 用流体技术分离和/或扩增核酸。这种装置的实例为由Qiagen (德国希尔敦)、Roche (瑞 士巴塞尔)^Applied Biosystems (加利福尼亚州福斯特城)、Idaho Technologies (犹他州 盐湖城)和C印heid(加利福尼亚州桑尼维尔)市售的装置。但是，与任何分析方法一样，处理之前制备样品对于能否获得良好效果至关重要。 过多复杂因素的存在和可掩盖所关注的分析物的物质的浓集使得有效的检测几乎不可能 实现。当试图分析细胞溶解产物(其为极其复杂的异质混合物)的核酸含量时，这一问题 尤其令人关注(Colpan2001)。涉及便携式分析装置时，制备任务变得更为困难，因为这些装 置预期用于无法获得常用实验室支持设备如离心机和分离柱等的场合。在这些情况下，一 些用于过滤如血样或尿样等原始样品的手段对于提供有意义的结果至关重要。当前的基于 流体技术的装置(特别是上述Qiagen装置)使用需要支架的软而柔顺的玻璃过滤器。该 过滤器具有通常为约1 3微米的小孔径，以便能够从样品中有效地捕获核酸。由于这种 小孔径，该过滤器因而也较薄，通常小于2毫米厚，由此可减小样品受迫穿过小孔径时的流 体流动阻力。在Qiagen程序中，通常将样品与如胍等离液剂混合，并且利用离心力使该混 合物穿过玻璃过滤器，其中流体只沿一个方向流动。核酸粘在玻璃过滤器上；使用乙醇或异 丙醇将其洗下，然后使用10毫摩尔(lOmM)pH为约8(pH 8.0)的三羟甲基氨基甲烷(Tris) 缓冲液或水将其释放。然而，由于流体流动所产生的阻力和较大流速所产生的堵塞的可能 性，小孔径限制了可处理的样品的量。因此，如Qiagen装置等装置可能容易损坏或者容易 变得无效。此外，这些特性限制了样品输入量、可检验的样品类型、大体积样品、浓集系数和 简单的流体整合。较大的玻璃过滤器已被用于提供样品的预处理过滤。例如，美国专利第4，912，034 号(Kalra、Pawlak等1990)描述了一种检测液体样品中的靶分析物的免疫测定法，其中包 括由玻璃纤维制成的可选的预滤器组件。然而，该装置不是微流体装置并且未明示或暗示可使用玻璃料过滤器板(glass frit)作为微小规模的PCR反应之前的过滤器。美国专利第4，923，978号(McCormack 1990)描述了玻璃纤维过滤器的从水性DNA样品中除去不合 需要的蛋白质和蛋白质-DNA复合物的在先应用，但以贬低的方式提到这种过滤器具有较 低的粘合能力(参见第2列)。的确，美国专利第4，923，978号要求保护的是用于进行这种 过滤的截然不同的材料。美国专利第6，274，371号(Colpan 2001)描述了将硅胶、氧化铝 和硅藻土作为优选过滤剂，以用于在核酸分析之前从细胞溶解产物中除去不合需要的污染 物。美国专利第6，800，752号(Tittgen 2004)描述了使用色谱材料分离包含核酸的混合 物，其中，所述材料包含载体和离子交换剂功能，其中所述载体包括位于支持物上的纤维材 料，如塑料过滤器板(plastic frit)。然而，鉴于以上原因，对于提供可克服当前这代装置的缺陷、能够有效地分离和鉴 定核酸的流体装置仍存在需求。本发明满足这些需求和其它一些需求。

发明内容
本发明的第一方面提供了一种从含有核酸和外来杂质的混合物中分离所述核酸 的方法。用于本发明的适当的核酸包括微生物DNA和人基因组DNA。在一个实施方式中，本 发明的方法包括在可有效地将核酸与外来杂质分离的条件下，使所述混合物穿过玻璃料过 滤器板。在一个更特定的实施方式中，玻璃料过滤器板为烧结的玻璃料过滤器板。在一些 实施方式中，玻璃料过滤器板具有约2微米 约220微米的孔径；在一些更特定的实施方式 中，玻璃料过滤器板具有约150微米 约200微米的孔径；在另一些更特定的实施方式中， 玻璃料过滤器板具有约2微米 约100微米的孔径；更特定的是，玻璃料过滤器板具有约 40微米 约75微米的孔径；而另一些更特定的实施方式包括玻璃料过滤器板具有约2微 米 约20微米的孔径的那些情况。在另一个实施方式中，本发明的方法包括使所述混合物 穿过玻璃料过滤器板，由此产生第一过滤混合物，然后在可有效地从第一过滤混合物中分 离核酸的条件下，使第一过滤混合物穿过第二玻璃料过滤器板。本发明的第二方面提供了一种用于从含有核酸和外来杂质的混合物中过滤分离 所述核酸的装置。在一些实施方式中，所述装置包含具有入口和出口的空腔；和设置于空腔 中的孔径为约2微米 约220微米的至少一个玻璃料过滤器板，所述玻璃料过滤器板布置 在入口和出口之间的位置。在一些更特定的实施方式中，玻璃料过滤器板为烧结的玻璃料 过滤器板。在另一些实施方式中，玻璃料过滤器板为烧结的玻璃料过滤器板。在一些实施 方式中，玻璃料过滤器板具有约2微米 约220微米的孔径；在一些更特定的实施方式中， 玻璃料过滤器板具有约150微米 约200微米的孔径；在另一些更特定的实施方式中，玻璃 料过滤器板具有约2微米 约100微米的孔径；更特定的是，玻璃料过滤器板具有约40微 米 约75微米的孔径；而另一些更特定的实施方式包括玻璃料过滤器板具有约2微米 约 20微米的孔径的那些情况。本发明的第三方面提供了一种用于从含有核酸和外来杂质的混合物中鉴定一种 或多种所述核酸的流体装置。在一些实施方式中，本发明的这种流体装置包含入口、出口 和与入口和出口都相通的位于入口和出口之间的至少一个流体反应腔。所述装置还包含 布置在下述位置(一个或多个)的至少一个玻璃料过滤器板，所述位置邻近入口和反应腔 (一个或多个)并与入口和反应腔(一个或多个)流体连通。玻璃料过滤器板具有约2微米 约220微米的孔径。混合物通过入口进入装置并穿过玻璃料过滤器板，从而作为过滤 产物离开该处，然后进入流体反应腔中。在玻璃料过滤器板和反应腔(一个或多个)之间 布置有至少一个与它们流体连通的流体试剂分配器。在一个更特定的实施方式中，玻璃料 过滤器板为烧结的玻璃料过滤器板。在一些实施方式中，玻璃料过滤器板具有约2微米 约220微米的孔径；在一些更特定的实施方式中，玻璃料过滤器板具有约150微米 约200 微米的孔径；在另一些更特定的实施方式中，玻璃料过滤器板具有约2微米 约100微米的 孔径；更特定的是，玻璃料过滤器板具有约40微米 约75微米的孔径；而另一些更特定的 实施方式包括玻璃料过滤器板具有约2微米 约20微米的孔径的那些情况。在另一个实施方式中，流体装置包含邻近玻璃料过滤器板(一个或多个)的加热器。参照附图阅读下文中的说明时，这些和其它方面以及优点都将变得显而易见。


图1是本发明的用于纯化核酸的玻璃料过滤器板装置(“过滤器模块”)的示意 图。图2A和图2B是本发明的过滤器的图。图2A是本发明的用于纯化核酸的玻璃料 过滤器板装置(“过滤器模块”)的分解图。图2B是同一装置的截面图。图3是本发明的用于纯化核酸的玻璃料过滤器板装置(“空腔”)的示意图。图4是本发明的微阵列装置的示意图。图5是本发明的用于纯化和鉴定核酸的方法的流程图。图6是说明如图2A和2B所示的本发明的装置的改进的性能特点的图，所述改进 的性能特点通过测量作为PCR周期的函数的样品材料(IOOyL以IX IO5个细胞/mL的浓度 存在于全血中的炭疽杆菌细胞)的荧光来证明。实线(A)显示的是根据本发明处理的样品 的结果；虚线⑶显示的是使用来自Qiagen的市售的装置处理的样品；虚线(C)和⑶为 未处理的样品和阴性对照物。图7是说明如图3所示的本发明的装置的改进的性能特点的图，所述改进的性能 特点通过测量作为PCR周期的函数的样品材料(500yL以1\104个细胞/!^的浓度存在 于痰中的炭疽杆菌细胞)的荧光而得到证明。实线(A)显示的是根据本发明处理的样品的 结果；虚线(B)显示的是未处理的样品；虚线(C)为阴性对照物。
具体实施例方式本发明提供用于从核酸与诸如蛋白质、小分子、细胞膜片段等其它物质组合的混 合物中至少部分纯化核酸的方法和装置。此处所用的“核酸”是指天然存在的或人工合成的单个核酸和核酸的聚合链，包括 DNA和RNA(包括其类似物)，或者其变体，特别是已知天然存在的具有任何长度的那些变 体。本发明的核酸长度的实例包括但不限于适于PCR产物(例如约50个碱基对(bp))和人 基因组DNA(例如从约数千个碱基对(Kb)至数十亿个碱基对(Gb)的数量级)的长度。因 此，应该理解术语“核酸”涵盖了天然或人工的单个核酸和核苷酸、核苷的序列段(stretch) 及其小片段的组合(例如表达序列标签或基因片段)，以及较长的链，如基因组物质所示 例，包括单个基因，甚至整个染色体。在更特定的实施方式中，核酸来自如细菌或病毒等病原体。所述病原体包括对人类和动物有害的病原体。就对人类有害的病原体而言，在一些 实施方式中，所述病原体为用作生物武器的病原体，包括已经武器化的天然存在的病原体。 在一些实施方式中，核酸包括微生物DNA。在本发明的一个实施方式中，微生物DNA来自炭 疽杆菌。在另一些实施方式中，核酸来自人类或动物。在一些实施方式中，核酸包括人基因 组 DNA。本发明的第一方面提供了从含有核酸和外来杂质的混合物中分离所述核酸的方法。在一些实施方式中，本发明的方法包括使混合物穿过具有入口和出口的空腔；其中，所 述入口和出口相同，并且空腔中设置有至少一个多孔的过滤器，并处在可有效地将核酸与 外来杂质充分分离的条件下。此处所用的“外来杂质”是指样品中不同于核酸的所有物质。 所述外来杂质的实例包括但不限于蛋白质、淀粉、脂质、金属离子和较大的细胞结构，如膜 片段。此处所用的短语“充分分离”是指下述分离，在一些实施方式中所述分离可提供相对 于外来杂质其纯度至少为30%的核酸，在更特定的实施方式中可提供相对于外来杂质其纯 度至少为50%的核酸，在更特定的实施方式中可提供相对于外来杂质其纯度至少为70% 的核酸，在更特定的实施方式中可提供相对于外来杂质其纯度至少为95%的核酸，在更特 定的实施方式中可提供相对于外来杂质其纯度至少为99%的核酸。在此处所描述的本发明的各实施方式中，玻璃料过滤器板通过使用本领域普通技 术人员所知的标准方法由标准材料制成，或者如下所述商购获得。在一些实施方式中，玻璃 料过滤器板具有基本上为约1毫米 约20毫米的厚度，更特定的是为约2毫米 约5毫米， 进而更特定的是为约2毫米 约3毫米。适用于本发明的示例性玻璃料过滤器板孔径(包 括此处所述的各实施方式)为约2微米 约200微米。在更特定的实施方式中，孔径为约 150微米 约200微米。在另一些更特定的实施方式中，孔径为约2微米 约100微米，更 特定的是为约40微米 约75微米。另一些实施方式包括孔径为约2微米 约20微米的 那些实施方式。对于涉及微生物DNA的应用，玻璃料过滤器板孔径以约10微米 约15微 米为宜。较大的玻璃料过滤器板孔径可用于人基因组应用。适当的玻璃料过滤器板由烧结 的玻璃构成，通常用在化学玻璃器皿中，并可由Robu(德国)商购获得。本领域普通技术人 员知道这种玻璃料过滤器板的选择和制造。在另一些实施方式中，所述玻璃料过滤器板由多孔过滤器代替，或与其联用。此处 所用的“多孔过滤器”是指允许至少一种液体中所含物质选择性通过的任何材料。更具体而 言，“多孔过滤器”是指能够从含有核酸的液体中充分除去所述核酸的那些材料。适当的多 孔过滤器的实例包括但不限于被构造为可捕获核酸的滤纸(例如可由Whatman获得的FTA 纸)、玻璃纤维、玻璃珠、可由Invitrogen获得的具有Charge SwitchTechnology涂层的珠、 氧化铝过滤器和多孔式整体聚合物。所述材料和产品为本领域普通技术人员所熟悉。在一 些实施方式中，多孔过滤器为玻璃料过滤器板。在另一些实施方式中，玻璃料过滤器板为烧 结的玻璃料过滤器板。其它适合提供玻璃料过滤器板或烧结的玻璃料过滤器板的过滤功能 的材料为聚硅氧烷和XTRABIND(Xtrana，Inc.，科罗拉多州布鲁姆菲尔德)。执行本发明的 过滤功能的所述材料的构造对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。在一个实施方式中，上述玻璃料过滤器板被包装在玻璃料过滤器板支持体或流体 模块中。所述支持体或模块的一个示例性实施方式的截面图如图1中的1000所示。其中， 如上所述的玻璃料过滤器板(1004)被放置在外壳(1008)中。外壳包含入口(1012)，包含所关注的核酸的流体混合物通过所述入口(1012)进入外壳，并与此处所述的玻璃料过滤 器板相互作用，产生穿过外壳出口(1016)的第一过滤混合物。离开过滤器保持体或模块之 后，第一过滤混合物可以进入如下所述的与所述出口流体接触的其它腔室中或者进入收集 器中。一些实施方式中包含如1020所示的可选的加热器。本领域普通技术人员知道这种 装置的设计和制造。本发明的此方面的第二实施方式如图2A和2B所示。本领域普通技术人员知道这种装置的设计和制造。图2A显示了玻璃料过滤器板保持体(2000)的一个实施方式的分解 图，所述玻璃料过滤器板保持体包含上壳体(2002)和下壳体(2004)。下壳体包含在图2B 中更详细描述的凹槽(2006)，在所述凹槽(2006)中设置有一个或多个上述玻璃料过滤器 板(2008)。利用垫圈(2010、2012)将玻璃料过滤器板装入这两个壳体中。下壳体(2004) 还包含入口(未示出)和出口(2014)，含有拟分离的核酸的物质通过所述入口被引至玻璃 料过滤器板，废料和经纯化的核酸由所述出口排出过滤器模块。图2B显示了玻璃料过滤器 板外壳(2000)的截面图。在该图中，除了刚刚描述过的元件之外，还显示了入口(2018)以 及引导物质流通过玻璃料过滤器板和出口的通道。本发明的另一方面提供了从含有核酸和外来杂质的混合物中分离所述核酸的装 置。本发明的这种过滤器的一个实施方式如图3中的3000所示。在该图中，空腔(3004) 具有包含核酸的混合物所穿过的第一开口(3008)和第二开口(3012)以及排出至少部分溶 解的混合物的出口。在入口和出口之间存在上述玻璃料过滤器板(3018)，所述玻璃料过滤 器板沿轴向延伸通过空腔的至少一部分内部体积，延伸程度如3016处所示。在一些实施方 式中，使用超过一个的这种玻璃料过滤器板。在另一些实施方式中，玻璃料过滤器板中至少 有一个由烧结的玻璃制成。本领域普通技术人员知道这种装置的设计和制造。在一些更特定的实施方式中，空腔的一端具有截头圆锥体形状，该腔室的尺寸被 设计为可安装在吸移器具的末端如吸移管尖端，使得物质首先被吸收通过第二开口、穿过 玻璃料过滤器板、过滤，然后保留在玻璃料过滤器板上方的腔室部分中。在一些实施方式 中，保留在玻璃料过滤器板上方的腔室部分中的样品穿过玻璃料过滤器板返回并穿过第二 开口 (3012)。在另一个实施方式中，将上述吸移管尖端与被构造为可加热玻璃料过滤器板的加 热装置联用，以促进核酸从混合物中的分离。在更特定的实施方式中，加热器的尺寸被设计 为可安装在吸移管尖端内。本领域普通技术人员知道这种装置的设计和制造。在另一些实施方式中，吸移管尖端与电子吸移器或自动吸移工作站偶联来控制穿 过玻璃料过滤器板的流速。在一些实施方式中，电子吸移器为手持式装置。本领域普通技 术人员知道这种装置的设计、制造和操作。在本发明的一些实施方式中，组合使用两个以上的多孔过滤器。在更特定的实施 方式中，各层具有不同的孔径。不希望受限于任何特别的作用理论，较大的多孔过滤器孔径 捕获较大的颗粒，因此可以起到预滤器的作用。例如，可以将40微米 60微米的多孔过滤 器与10微米 15微米的多孔过滤器串联使用，来滤除样品(例如血液)中的人基因组DNA， 从而分离微生物DNA。使用40微米 60微米的多孔过滤器除去大量人类DNA可使低拷贝 微生物DNA更好地粘合在10微米 15微米的多孔过滤器上并进行更稳定的分析，因为人 基因组DNA不再以大至足以产生显著干扰(例如，通过全基因组扩增)的浓度存在。多孔过滤器可以如上所述位于吸移管尖端，厚度和直径各自为约5毫米(mm)。在一些实施方式 中，将两个以上多孔过滤器结合在一起，以形成基本上为整体式的结构。本领域普通技术人 员知道这种装置的设计、制造和操作。在使用吸移管尖端设置过滤器的更特定的实施方式中，将具有较大孔径的玻璃料过滤器板(一个或多个)设置得较靠近吸移管尖端入口。同样，不希望受限于任何特别的作 用理论，但是本领域普通技术人员将会理解的是，将较大孔径的过滤器布置得较靠近吸移 管尖端入口可以提供粘合在玻璃料过滤器板之内的核酸的更均勻的分布。通过比较，本领 域普通技术人员会预料到，若非如此，核酸将倾向于在最靠近吸移管尖端开口的区域粘合 至玻璃料过滤器板上，因为在核酸刚一进入玻璃料过滤器板时，核酸更可能发生初步接触。本发明的又一个方面提供了用于分析核酸的微流体装置。所述微流体装置的一个 实施方式如图4的4000所示。设置有如此处所述的玻璃料过滤器板保持体(4002)。上游 有与洗脱缓冲液源(4004)流体连通的玻璃料过滤器板保持体、盐酸胍(Gu)贮存器(4006) 和Gu混合塔(4008)，来自所述Gu贮存器和Gu混合塔的液流受阀(4010)控制。Gu混合塔 还与乙醇-空气源(4012)流体连通。本领域普通技术人员将会发现，本发明也可以使用Gu 以外的离液剂。另外还有与样品收集塔(4016)流体连通的珠磨式组织研磨器(4014)和电 触头(4020)，所述样品收集塔(4016)又与入口止回阀(4018)流体连通。这些元件的输出 受阀4022控制。继续参考图4，玻璃料过滤器板保持体(4002)的下游有废料槽(4024)，向其流动 的液流受阀(4026)控制。来自玻璃料过滤器板保持体的下游液流也受第二个阀(4028)控 制，所述第二个阀(4028)控制沿第一支路流向洗脱塔(4030)和止回阀(4032)的液流；和 沿流路的第二支路流向另一个阀(4034)的液流。阀4034的再下游有一个以上的PCR试 剂贮存器(4036)和通向PCR腔室(4040)的阀(4038)。PCR腔室的下游是阀(4042)，所述 阀(4042)与阀4046 —起控制从PCR腔室流向微阵列腔室(4050)的液流，所述微阵列腔室 (4050)还与混合及冲洗缓冲液贮存器(4048)和废料容器(4052)流体连通。本领域普通技 术人员知道这种装置的设计和制造。参考图4所描述的装置的运行如图5的流程图所示。获得例如含有所关注的细胞 的痰样品等原始样品(5002)之后，利用珠磨式组织研磨器4014使细胞溶解(5004)，并使 混合物穿过玻璃料过滤器板4002以纯化核酸(5006)，从而通过PCR腔室4040扩增(5008) 和通过微阵列腔室4050检测(5010)。不受限于任何特别的理论或作用，本发明通过提供下述刚性、自支持的玻璃料过 滤器板结构而满足上述需要，所述玻璃料过滤器板结构较厚因而可提供高粘合能力，含有 较大的孔隙因而可提供低流体阻力、较高的流速和对临床和环境样品中的颗粒的高耐受 性，并且既不由松散的材料(例如硅胶、硅藻土、玻璃球)构成也不由易坏、脆弱的材料(例 如纤维过滤器、膜过滤器、硅微结构)构成，因而可提供在恶劣条件下的操作和包装以及简 化的制造。实施例提供以下实施例旨在说明本发明的某些方面并帮助本领域技术人员实施本发明。 绝不能认为这些实施例以任何方式限制本发明的范围。I.使用本发明的装置的方案
参考图2A和2B，实施本发明的纯化和检测的方案提供如下。1.将玻璃料过滤器板插入保持体中(下述四种不同孔隙之一细、中、粗和特粗)。 固定外壳。2.将 500 μ L 样品(IO4 拷贝 /mL)与 500 μ L 6Μ 的胍(ρΗ 6. 5)混合。3.使用ImL注射器使混合物(ImL)以100 μ L/分钟的流速穿过玻璃料过滤器板。使用5mL注射器，手动使空气穿过玻璃料过滤器板，以清洗样品。 4.使用ImL注射器，以ImL/分钟的速度注入ImL 70%的乙醇(EtOH)，以洗涤粘合 的核酸。使用5mL注射器，手动使空气穿过玻璃料过滤器板，以清洗EtOH。5.使用ImL注射器，以100 μ L/分钟的速度小心地将洗脱缓冲液(lOmMTris，ρΗ 8. 0)注入玻璃料过滤器板保持体中，直至在出口管中首先看到缓冲液为止。6.将加热器(heat block)放在玻璃料过滤器板保持体下方，并在70°C加热3分 钟。7. 3分钟后，继续使洗脱缓冲液穿过玻璃料过滤器板保持体。收集组分(50 μ L IOOyL)用于PCR分析。8.使用ImL 10 %的漂白剂(漂白剂稀释时间不超过1周)、5mL 10 %的 Tris-HCKpH 8.0)和5mL水冲洗玻璃料过滤器板保持体。将玻璃料过滤器板放回原处。II.实施本发明的第二方案参考图3，实施本发明的纯化和检测的方案提供如下。1.向A瓶中的500 μ L6M的胍中加入500 μ L样品。并进行涡旋混合。2.将内置有玻璃料过滤器板的1. 2mL的吸移管尖端连接于电子吸移器(Gilson Concept)上。3.将电子吸移器设置为速度1 (最低速)。吸入A瓶中的ImL样品混合物。推注 样品混合物，使其完全穿过玻璃料过滤器板。样品混合物的推注使其立即位于玻璃料过滤 器板的上方。4.将样品放回A瓶中。样品混合物的推注使其被完全排回瓶中。5.重复步骤3和4四次。6.将电子吸移器设置为速度5 (最高速)。吸放B瓶中的ImL 70%的乙醇，以洗涤 玻璃料过滤器板上的粘合的核酸。重复四次。7.通过使尖端位于乙醇溶液的上方来除去痕量的乙醇。吸放空气五次以干燥玻璃 料过滤器板。8.将容纳有100 μ L IOmM Tris-HCl (ρΗ 8. 0)的C瓶放入设置为70°C的加热器中。 加热5分钟。9.将电子吸移器设置为速度1。吸入洗脱缓冲液并将其放回C瓶中，重复五次，以 从玻璃料过滤器板中除去核酸。III.本发明的优良结果的证明采用所述方案的两个实验的结果如图6和图7中所示，其中，使用本发明的物质和 方法处理了全血和痰中的炭疽杆菌(Ba)样品。图6中，使用本发明的方法和装置(图2A和图2B)处理的样品(曲线A)优于使用 由Qiagen商购获得的装置处理的样品(曲线B)。曲线C和曲线D分别为未处理的输入样品和阴性对照物。实验中，输入 οομ L在全血中为105/mL的炭疽杆菌细胞，使其通过此处 所述的中(孔径为10 μ m 15 μ m)玻璃料过滤器板或者进入Qiagen装置中，收集约50 μ L 的洗脱液并使用PCR进行分析。如图所示，在PCR扩增约25个周期之后，使用本发明的物 质和方法处理的样品清楚且显著地优于使用现有技术的装置处理的样品所获得的结果。图7说明了使用所述方法和装置(图3)的另一实验的结果，其中，使用本发明的物质和方法处理痰中的炭疽杆菌样品。使用本发明的方法和装置处理的样品(曲线Α)优 于未处理的样品(曲线B)。曲线C为阴性对照物。该实验中，输入500yL在痰中为IO4/ mL的炭疽杆菌细胞，使其通过此处所述的中玻璃料过滤器板，收集约100 μ L的洗脱液并使 用定量、实时PCR进行分析。如图所示，在PCR扩增约27个周期之后，使用本发明的物质和 方法处理的样品清楚且显著地优于未处理的样品所获得的结果。上述方法和装置可成功地用于从表1所列的各种有机物中鉴定DNA和/或RNA，所 述有机物存在于表2所列的各种基质(即，样品类型)中。表 1病毒性马脑炎(VEE)牛痘病毒鼠疫杆菌炭疽杆菌腺病毒化脓链球菌肺炎衣原体A型流感B型流感腺病毒+化脓链球菌的混合物A型流感和腺病毒的混合物使用本发明的方法和装置有效地分析了以下物质表 2水/TE(10mMTris-HCl，1. OmM EDTA 缓冲液)棉签提取物(swab extracts)痰洗鼻水全血结论与现有技术相比，本发明提供了几个优点1)不需要离心分离或用以移动流体的 高压的简化的方法和装置；2)流体整合至完整的分析系统的模块式装置；3)可在保持低流 体阻力的同时处理复杂样品的大孔径；4)因流体可由两个方向移动而具有的高提取和洗 脱效率；5)不需附加支持结构的刚性；和6)可将装置再利用于连续取样的耐用性。虽然此 处描述了多个具体实施方式
和实施例，但是本领域普通技术人员将会理解，可以实现本发 明的许多不同实施方式，而不背离本公开文件的要旨或范围。例如，具有核酸亲合力的其它材料可用于玻璃料过滤器板，或者可将玻璃料过滤器板修改为能够更好地吸引核酸和不需使用如胍等离液盐即能够更好地吸引核酸。玻璃料过滤器板可以含有固定抗体来提取微生 物和毒素。对于本领域普通技术人员而言其它变化是显而易见的。文献目录以下参考文献通过援弓I整体并入本说明书中，其适用于各种目的。Beach, R. A. , Strittmatter, R. P.等(2007). Integrated MicropumpAnalysis Chip and Method of Making the Same (集成微泵分析芯片及制造其的方法)US 7，189，358.Co Ipan, Μ. (2001) . Process and device for the Isolation of CellComponents, Such as Nucleic Acids, from 20 Natural Sources (从 20 种天然来源 分离如核酸等细胞成分的方法和装置)US 6，274，371.Deshmukh, A. J. (2006). Method and Automated Fluidic System forDetecting Protein in Biological Sample (用于检测生物样中的蛋白质的方法和自动化流体系统) US 6，989，130.Kalra, K. L. , Pawlak, K.等(1990). Immunoassay Test Device andMethod (免疫 测定装置和方法)US 4，912，034.Knollenberg, B. Α. ，Rodier, D.等(2007). Molecular ContaminationMonitoring System and Method (分子污染监控系统和方法)US 7, 208, 123.McCormack, R. Μ. (1990).Process for Purling Nucleic Acids US4, 923, 978.Terry, B. R. ,Scudder,K. M.等(2004). Method and Apparatus for HighDensity Format Screening for Bioactive Molecules (高密度方式筛分生物活性分子的方法和装 置).US 6，790，652.Tittgen,1(2004). Chromatography Material and a Method Using theSame(fe 谱材料和使用其的方法)US 6，800，752.Wick,C. H. (2007). Method and System for Detecting and RecordingSubmicron Sized Particles (用于检测和记录亚微型颗粒的方法和系统).US7, 250，138.
权利要求
一种从含有核酸和外来杂质的混合物中分离所述核酸的方法，所述方法包括使所述混合物流动通过空腔的内部体积；所述空腔具有设置于其中的至少一个玻璃料过滤器板，所述玻璃料过滤器板布置在所述空腔中，使得所述混合物在能有效地将所述核酸与所述外来杂质充分分离的条件下流动通过所述玻璃料过滤器板。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述玻璃料过滤器板为烧结的玻璃料过滤器板。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸包括微生物DNA和RNA。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸包括人基因组DNA和RNA。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述混合物通过玻璃料过滤器板的所述流动产生 第一过滤混合物，并且所述方法还包括在能有效地从所述第一过滤混合物中分离所述核酸 的条件下，使所述第一过滤混合物流动通过第二玻璃料过滤器板。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述玻璃料过滤器板具有约2微米 约220微米的 孔径。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述玻璃料过滤器板具有约150微米 约200微米 的孔径。
8.如权利要求6所述的方法，其中，所述玻璃料过滤器板具有约2微米 约100微米的孔径。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述玻璃料过滤器板具有约40微米 约75微米的 孔径。
10.如权利要求8所述的方法，其中，所述玻璃料过滤器板具有约2微米 约20微米的孔径。
11.一种从含有核酸和外来杂质的混合物中分离所述核酸的方法，所述方法包括使 所述混合物流动通过空腔的内部体积；所述空腔具有设置于其中的至少一个玻璃料过滤器 板，所述玻璃料过滤器板布置在所述空腔中，使得所述混合物流动通过所述玻璃料过滤器 板，其中，所述流动包括先使所述混合物沿第一方向流动穿过所述玻璃料过滤器板，再使所 述混合物沿与所述第一方向相反的方向流动穿过所述玻璃料过滤器板，从而所述混合物在 能有效地将所述核酸与所述外来杂质充分分离的条件下穿过所述玻璃料过滤器板至少两 次。
12.—种从含有核酸和外来杂质的混合物中分离所述核酸的装置，所述装置包括其 中设置有至少一个玻璃料过滤器板的空腔，所述玻璃料过滤器板布置在所述空腔中，使得 当所述混合物穿过所述空腔时所述混合物流动穿过所述玻璃料过滤器板，并且所述玻璃料 过滤器板具有约2微米 约220微米的孔径。
13.如权利要求12所述的装置，其中，所述玻璃料过滤器板为烧结的玻璃料过滤器板。
14.如权利要求13所述的装置，所述装置还包含被配置为加热所述玻璃料过滤器板的 加热装置。
15.如权利要求12所述的装置，其中，所述玻璃料过滤器板具有约150微米 约200微 米的孔径。
16.如权利要求15所述的装置，其中，所述玻璃料过滤器板具有约2微米 约100微米 的孔径。
17.如权利要求16所述的装置，其中，所述玻璃料过滤器板具有约40微米 约75微米的孔径。
18.如权利要求16所述的装置，其中，所述玻璃料过滤器板具有约2微米 约20微米 的孔径。
19.一种从核酸和外来杂质的混合物中鉴定一种或多种所述核酸的流体装置，所述装 置包括入口、出口和位于所述入口和所述出口之间并与所述入口和所述出口都相通的至 少一个流体反应腔室；所述装置还包含设置在邻近所述入口和所述至少一个反应腔室处 并与所述入口和至少一个流体反应腔室都流体连通的至少一个玻璃料过滤器板，所述玻璃 料过滤器板具有约2微米 约220微米的孔径，使得所述混合物通过所述入口进入所述装 置并穿过所述玻璃料过滤器板从而作为过滤产物离开，然后进入所述至少一个流体反应腔 室；设置在所述玻璃料过滤器板与所述至少一个反应腔室之间的至少一个流体试剂分配 器，所述至少一个流体试剂分配器与所述至少一个流体反应腔室流体连通。
20.如权利要求19所述的装置，其中，所述至少一个玻璃料过滤器板包括至少一个烧 结的玻璃料过滤器板。
21.如权利要求19所述的装置，其中，所述至少一个玻璃料过滤器板包括至少一个具 有约150微米 约200微米孔径的玻璃料过滤器板。
22.如权利要求19所述的装置，其中，所述至少一个玻璃料过滤器板包括至少一个具 有约2微米 约100微米孔径的玻璃料过滤器板。
23.如权利要求22所述的装置，其中，所述至少一个玻璃料过滤器板包括至少一个具 有约40微米 约75微米孔径的玻璃料过滤器板。
24.如权利要求22所述的装置，其中，所述至少一个玻璃料过滤器板包括至少一个具 有约2微米 约20微米孔径的玻璃料过滤器板。
25.如权利要求24所述的装置，所述装置还包含邻近至少一个所述至少一个玻璃料过 滤器板的加热器。
全文摘要
本发明提供从含有核酸和外来杂质的混合物中分离所述核酸的方法和装置。在一个实施方式中，本发明的方法包括在能有效地将核酸与外来杂质分离的条件下，使所述混合物穿过玻璃料过滤器板。在一个更特定的实施方式中，玻璃料过滤器板为烧结的玻璃料过滤器板。
文档编号G01N33/543GK101883776SQ200880116501
公开日2010年11月10日 申请日期2008年3月11日 优先权日2007年10月31日
发明者菲利普·贝尔格莱德 申请人:阿考尼生化系统公司