专利名称：一种基于持续荧光物标记的试条定量检测系统及其方法
技术领域：
本发明涉及生物医疗器械领域，具体涉及一种基于持续荧光物标记的试条定量检测系统 及其方法。该系统对持续荧光物标记的试条可进行自动扫描检测与结果判读，实现对病原体、 抗原、抗体、违禁药品、重大疾病(肿瘤、癌症、心血管疾病和糖尿病等)、农药残留量、食 品安全生物检测等多种目标被检物的定量或定性检测。
背景技术：
在免疫检测中，目前主要采用放射性免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金标 记等方法实现样品定量或者定性检测。这些方法存在不同程度缺陷。激光诱导荧光检测技术 被认为是目前最灵敏的检测方法之一。该方法具有灵敏度高、选择性好、响应速度快等诸多 优点，其应用范围遍及生物医学检验各领域。
激光诱导荧光检测技术目前最常使用的荧光标记物为有机荧光染料(如荧光素、罗丹明 等)。有机荧光标记物荧光寿命短，很难克服背量荧光干扰，检测灵敏度低。其后出现的绿 色荧光蛋白虽然发光强而稳定，但由于蛋白分子体积大、对环境比较敏感，实际操作不方便。 近年来出现的量子点和含有大量荧光报告分子(包括量子点、稀土螯合物、有机染料等)的纳 米颗粒可免受溶剂干扰，荧光发射强而稳定，目前已成为免疫标记领域的新热点。
稀土离子，主要是Eu ( III) 、 Tb ( m) 、 Sm ( III) 、 Dy ( III)的镧系螯合物，其激 发波长可通过配体调节，荧光发射特异性强，Stokes位移大，发射荧光寿命长，利用时间分 辨荧光技术可以大大减少生物医学样品本底和杂散光干扰，灵敏度可提高几个数量级。利用 具有长寿命荧光的稀土离子Eu、 Sm、 Dy、 Tb的镧系螯合物及它们的混合物组成的稀土纳米颗 粒作为荧光标记物现认为是很有前途的超微量分析方法。
量子点(Quantum Dot,简称QD)是20世纪90年代新发展的一种相对于传统荧光染料和 镧系螯合物更具优良光谱特征和光化学稳定性的半导体纳米晶体，其荧光发光效率高、激发 谱线范围宽、发射谱线范围窄、粒径与生物分子相近、表面修饰多功能化、荧光寿命更长。 作为新一代生物荧光标记物，其在免疫分析中的多组分同时测定、免疫示踪分子定位、纳米 生物传感器、实时检测、细胞成像、体内成像、疾病诊断以及研究生物大分子之间的相互作 用、组分在机体内的循环和作用方式等方面具有独特作用和广阔应用前景。文献报道，量子 点作为新一代生物荧光标记物，具有取代传统有机染料的深远潜力。与有机染料分子相比， 量子点主要优点有(1)光稳定性好。在激发光照射下，有机染料的荧光信号往往很快变暗， 而量子点则会持续发光，光漂白速度为罗丹明的1/100。 (2)发光强度高。量子点为多电子 体系，发光效率远高于单个有机分子，它在可见和紫外区的吸光系数为105L/ (mol.cm)数量 级，使得其荧光发射强度远高于有机染料。(3)激发光谱范围宽。普通有机荧光分子常常有 特定的激发波长和发射波长，测定几种荧光光谱时必须用几种波长的光去激发，这给多标记 同时分析造成极大麻烦。而量子点的激发光谱在吸收阀值以上几乎是连续的，谱峰较宽,只 需一个比其发射光波长短的任意波长的光源激发，即可发射高亮度的荧光，并可被同时检测。 (4)具较大Stokes位移和狭窄对称的发光光谱。量子点的荧光谱峰相对有机染料峰形狭窄
5对称，半峰高宽度只有荧光素的1/3,半高峰宽常常只有40nm或更小，且在长波方向无拖尾 现象，此允许同时使用不同光谱特征的量子点，发射光谱不出现交叠，使标记生物分子荧光 谱的区分、识别变得很容易，这给生物医学领域实现样品同时检测带来极大方便。(5)荧光 寿命较长，约为数百纳秒。荧光漂白速率只有罗丹明6G的1/100，较高的光化学稳定性可以 保证其在体内存留数天乃至数月。有文献报道，在小鼠体内注入量子点，8周后，仍有荧光 检出。
量子点、稀土螯合物的结构特性、荧光机理和长寿命荧光特点，使它们作为持续荧光标 记物标记免疫层析试条在通过一个延迟时间检测时能有效消除背景荧光干扰(包括生物体自 荧光干扰和分析用材料产生的本底荧光干扰等)，从而达到准确检测样品被检物浓度目的。 而且，量子点用作持续荧光标记物，由于不同原料和同一原料不同粒子大小的量子点，可产 生不同波长的发射荧光，且量子点混合物不产生可变光谱荧光，因而可根据特定大小、成分 和结构的量子点产生特定荧光之光学特性来对量子点标记的目标被检物进行特定荧光测定， 能达到准确检测样品多组分目标物的浓度。
采用量子点标记试条检测生物医学样品，中国专利申请号200610024086. 7披露了一种快 速免疫层析试条检测方法，该申请号专利利用不同量子点标记不同目标物抗体，在紫外下可 用肉眼快速观察检测结果，实现样品多组分同时检测。不足之处是(1)该申请号专利只对 量子点标记试条的制作进行了描述，而没有披露相应配套的仪器检测系统，其检测需要借助 其它紫外检测仪才能进行，而且只是定性检测，不能实现定量检测。(2)采用紫外检测对人 体有害，操作不安全。(3)测量结果客观性差。由于检测者是通过肉眼来观察试条检测带和 质控带在紫外下产生的荧光强弱程度来判断检测结果的，检测结果易受检测者经验影响，主 观性强，同一试条在不同状态下有可能会作出不同的、甚至是错误的判断结果，特别是对于 那些目标物含量极低的样本，紫外发出的荧光很弱就更难用肉眼来判断结果，灵敏度低。(4) 不能监测生物反应的动态过程。免疫层析是一个动态反应过程，试条上处于虹吸渗移状态的 量子点标记粒子产生荧光属动态范畴，紫外目视法显然不能对这一动态反应过程进行观察和 分析，所以无法更深入地研究免疫层析反应过程。即使生物反应失败，检测者也无法很好地 分析反应失败的原因。中国专利申请号200610024566. 3披露了一种量子点荧光探针联合检测 生物芯片寻找中药靶点方法，该专利同样存在不足其涉及的"量子点-中药成分"荧光探针 的检测不仅需要其它技术提供相应蛋白芯片，而且其检测同样需要借助另外的专用仪器设备。 中国专利申请号200510059892.3披露了一种包括用于量子点试条检测的光电子快速诊断测 试系统，但该专利目前尚未开发出现成产品，且内容与本发明完全不同。此外，本发明作者 在中国专利申请号200810186010.3、 200820209876.7、 200810045548.2、 200820064223. 4文 件中分别披露了两种基于量子点标记的试条检测系统及其方法，但所述检测系统中的光学成 像系统的结构组成与本发明不同。
在稀土荧光纳米颗粒标记试条用以检测生物样品方面，中国专利申请号200510052292. 4 (发明名称"一种用荧光稀土纳米颗粒作为标记物的免疫层析方法及其检测试条")披露 了一种免疫层析方法及其检测试条，该专利申请同样只对稀土纳米颗粒标记试条的制作进行 了描述，其标记试条的检测需要借助其他荧光检测仪器，如借助紫外检测仪用肉眼检测、或 用数码相机进行辅助观察、或通过专用的荧光测量仪进行检测，这使所述试条的实际应用受 到极大限制。中国专利申请号03819391. 4(发明名称"采用时间分辨荧光的基于膜的检测")虽然披露了一种基于荧光稀土纳米颗粒标记膜的检测装置，但该装置结构组成尤其是其光学 成像系统的结构组成与本发明完全不同。还需指出的是，目前运用稀土纳米颗粒作持续荧光 标记物标记微孔板的固相检测方法己有较多文献报道，并已开发出相应配套检测仪——肘间 分辨荧光检测仪(或系统)，其检测虽能达到较高灵敏度，可以实现定量或半定量检测，但 缺点是操作复杂，涉及加样、温浴、洗涤、显色、终止、检测等多个步骤，操作需要2-4小 时才能完成，对操作人员和环境也有一定要求，而且，除了需要价格昂贵的配套仪器——时 间分辨检测仪——外，还需要洗板机等其他辅助仪器设备，因此，其普遍应用仍然受到限制。
鉴于现有技术的上述不足，本发明公开一种基于持续荧光物标记的试条定量检测系统及 其方法，其试条制作、所述系统结构组成、检测使用方法等都与现有技术完全不同。
本发明所述定量检测系统及其检测使用方法用于生物医学样品定量或定性检测，简单快 速，操作方便，除与系统配套使用的持续荧光物标记试条、 一张IC卡和系统本身硬件外，不 再需要其他任何仪器设备和试剂。所述试条制作简便，成本低廉，为一次性使用产品。样品 检测时，检测者只需将加有样品的持续荧光标记试条置入所述系统并插入配套IC卡后，几分 钟内就能准确获得检测结果。检测结果客观，灵敏度高，不仅能准确实现样品单组分和多组 分定量或定性检测，还能对试条免疫层析反应成败进行动态监测提示。
发明内容
本发明技术方案如下-
本发明所述持续荧光物标记试条定量检测系统包括持续荧光物标记试条18、用于放置试 条的试条架28、照明系统、成像系统、荧光图像接收器8、信号放大器9、模/数转换器10、 数据处理与控制系统11、输出显示装置12、打印机13、键盘14和一张与试条配套的IC卡 15。
所述系统的试条架28有试条槽。试条槽用于放置待测的持续荧光物标记试条18。所述 试条18顺次设有相互搭接粘贴的样品垫19、包被有持续荧光物标记物的玻璃纤维膜结合垫 20、具有检测带25和质控带26的分析膜21、强吸水垫22、试条反应终点指示标签23和试 条辨识标签24。
所述照明系统包括一激发光源1，在该激发光源1的输出光路上依次为光纤束2、准直照 明透镜3、分色镜4、前镜组5，直至持续荧光物标记试条18。激发光源1包括发光二极管 LED或激光二极管。光纤束2将光源1发出的光分为具有一定间距、且强度相同的两激光束， 该两激光束由准直照明透镜3准直为两束平行光后入射到分色镜4表面经前镜组5同步照射 到试条检测带25和质控带26上激发试条检测带25和质控带26的持续荧光物标记复合物发 出特征波长反射荧光。
所述成像系统包括共光轴的前镜组5、分色镜4、滤光片6、后镜组7。分色镜4反射面 与光轴夹角成45。C。前镜组5和后镜组7均采用分离结构。照明系统光路在分色镜4之前部 分与所述成像系统的光轴相垂直，在分色镜4之后的部分与所述成像系统共光轴。
所述荧光图像接收器8位于后镜组7像面上。荧光图像接收器8的信号输出端经信号放 大器9与模/数转换器10相连。荧光图像接收器8收集试条检测带25和质控带26反射来的 特征波长荧光信号，将其转换成为电信号后由信号放大器9进行电信号放大。荧光图像接收 器8具有多种可供选择对象，包括CCD、 CMOS、光电倍增管、光电二极管、光电三极管。
所述的模/数转换器10的信号输入端与荧光图像接收器8之后的信号放大器9信号输出端相连，模/数转换器10的信号输出端与数据处理与控制系统11的信号输入端相连。所述的 模/数转换器10用于将信号放大器9传输来的放大电信号转变为数字信号。 一个显而易见的 实施例是，所述定量检测系统当选用CMOS作荧光图像接收器8时，由于现今商业型号的CMOS 己集成有功能放大器9和模/数转换器10，因此，由此构成的定量检测系统可不再另外使用 功能放大器9和模/数转换器10。
所述数据处理与控制系统U采集、存储模/数转换器10传输来的试条检测带和质控带反 射荧光信号的数字信号，并对该数字信号进行数据处理。所述数据处理与控制系统ll还配有 输出显示装置12、打印机13、键盘14和一张与试条相配套的IC卡15，它们分别与数据处 理与控制系统11相连。所述数据处理及控制系统11与试条架28之间还有一驱动控制电路 16, 17，该电路16， 17能使所述定量检测系统通过其数据处理与控制系统11读取IC卡15 上参数后发出指令从而自动控制试条架28运动以适合照明系统发出的光能对试条检测带25 和质控带26进行自动扫描。所述数据处理与控制系统11可以为具有相应数据处理和控制软 件的单片机、CPU或PC机。
所述定量检测系统的输出显示装置12可以为上位机、字母数字LCD、 LED、声音等。所 述定量检测系统配合不同的输出显示装置12，可实现样品单一成分或多组分定量或定性检测 当所述定量检测系统用于样品定量检测时，输出显示装置12可以为上位机或字母数字LCD; 当所述定量检测系统用于样品定性检测时，输出显示装置12可以为LED或声音等。
所述IC卡15贮存有各被检物相应检测标准工作曲线和试条质控带光密度参考监控值。 IC卡15与数据处理与控制系统15之间采用USB串口通讯，样品检测时，IC卡15能实肘插 拔。IC卡15贮存的各被检物相应检测标准工作曲线可以采用下述两种曲线方式之一其一 为被检物标准品系列浓度与该被检物标准品系列浓度经本发明所述定量检测系统测得的检测 带光密度值/质控带光密度值的比值(0Dtegw/0D Sffi)之间的对应关系曲线；也可以为被检物 标准品系列浓度与该被检物标准品系列浓度经本发明所述定量检测系统测得的检测带光密度 值/ (检测带光密度值+质控带光密度值)的比值(0D检鰣/ (OD糊+OD质飾))之间的对应关 系曲线。^^准曲线制作时得到的试条质控带28光密度值(0DffiS1ff)同时随标准工作曲线存ie 于IC卡15上兼作试条反应成败的参考监控值。样品实际检测中，如果反应失败，样品检测 得到的OD鹏*与IC卡15上存贮的相应0D鹏*值将会产生极大统计学误差。IC卡15贮存参 数与各批次试条产品相配套。样品检测时，操作者插入IC卡15,数据处理与控制系统11读 取IC卡15参数后发出指令自动控制试条架28运动使照明系统发出的、并经分色镜4反射来 的光能对试条检测带25和质控带26进行自动扫描，从而得到检测带25和质控带26发出的 特征频率荧光光密度值，并根据IC卡15存贮的相应被检物标准工作曲线(同时参考试条质 控带光密度参考监控值所提示的生物反应成败)即可实现被检物浓度准确测定。IC卡15还 可作临时存储器存储检测结果信息，每一检测都可以打印或保存。所述IC卡15存忙的各被 检物相应标准工作曲线的制作方法为(1)配制标准品系列浓度；(2)将各标准品系列浓 度置于本发明所述定量检测系统测得相应OD糊#和OD鹏带并分别计算出OD检鰣/0D鹏#比值或 OD检,/ (0D检脚带+OD质控带)比值；(3 )以各标准品系列浓度作X轴，测试结果以0D检鰣/OD质 控带比值作Y轴，绘制标准工作曲线；或以各标准品系列浓度作X轴，领!l试结果以ODSiW/ (OD检躺+OD质控带)比值作Y轴，绘制标准工作曲线；(4)编写标准工作曲线软件，并将该曲 线软件与试条质控带光密度参考监控值存贮于IC卡15上。本发明检测原理基于持续荧光物标记试条检测带25上的持续荧光物标记复合物被一定 波长激光激发后可发出相应特征波长荧光，该荧光信号与待测样品浓度成正相关。如果试样 中待测样品浓度越大，试条检测带25上的持续荧光物标记复合物发出的特征波长荧光信号就 越强。反之，试样中待测样品浓度越小，试条检测带25上的持续荧光物标记复合物发出的特 征波长荧光信号就越弱。根据这一关系，本发明将待测样品施加在试条一端(即加样孔27处)， 利甩试条微孔滤膜的毛细管虹吸作用，使目标被检物液体样品在试条另一端的强吸水垫22的 拉动下慢慢向试条微孔滤膜后端渗移，当液体样品中有目标被检物分子(如被检物特异抗原 或抗体)时，它们便与包被在试条前中段的玻璃纤维膜结合垫20上的被标记有持续荧光物的 相应生物分子结合并一起向试条后端渗移至试条分析膜21的检测带25，与包被在检测带25 的特异目标被检物相关分子(如相应目标被检物分子的特异抗体或抗原)结合形成检测带持 续荧光物标记复合物，剩余的一部分标有持续荧光标记物的生物分子继续渗移至试条质控带 26并与质控带26预包被的质控物(如二抗)结合形成质控带持续荧光物标记复合物。结合 在试条检测带25和质控带26的持续荧光物标记复合物因结合有持续荧光物，它们在激发光 源发出的光的激发下，即发射出相应长寿命的特征波长荧光，该特征波长持续荧光强度可反 映被检物浓度。通过接收、转换、传输、处理该特征波长荧光强度信息，因此能准确检测出 被检物浓度。
本发明所述持续荧光物系指一类被一定波长激发光激发后能持续发出寿命相对较长特征 波长荧光的物质，其特别包括量子点和纳米稀土荧光配合物。
所述量子点包括ZnS、 CdS、 HgS、 ZnSe、 CdSe、 HgSe、 CdTe、 ZnTe、 ZnO、 PbSe、 HgTe、 CaAs、 InP、 InAs、 InCaAs、 CdS/ZnS、 CdS/Ag2S、 CdS/PbS、 CdS/Cd(0H)2、 CdS/HgS、 CdS/HgS/CdS、 ZnS/CdS、 ZnS/CdS/ZnS、 ZnS/HgS/ZnS/CdS、 CdSe/CdS、 CdSe/ZnS、 CdSe/ZnSe、 CdSe/GuSe、 CdSe/HgTe、 CdSe/HgSe、 CdSe/HgSe/CdSe、 CdTe/HgS、 CdTe/HgTe、 InAs/InP、 InAs/CdSe、 InAs/ZnSe、 MgS、 MgSe、 MgTe、 CaS、 CaSe、 CaTe、 SrS、 SrSe、 SeTe、 BaS、 BaSe、 BaTe、 CdS Mn、 ZnS:Mn、 CdS:Cu、 ZnS:Cu、 CdS:Tb、 ZnS:Tb中的任意一种或任意几种纳米粒子的组合，以及 由上述任意一种量子点为核、二氧化硅为壳的核-壳型纳米复合粒子。
所述纳米稀土荧光配合物包括铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)、铽(Tb)的镧系螯合物 或它们的混合物。
上述持续荧光物标记的目标被检物包括病原体、抗原、抗体、违禁药品、重大疾病(肿瘤、 癌症、心血管疾病和糖尿病等)、农药残留量、食品安全生物检测等多种目标被检物。本发明 对上述持续荧光物标记的目标被检物进行单一或混合定量或定性检测。
本发明所述持续荧光物标记试条的制备方法包括以下步骤 (1)试条各组件制备
① 样品垫制备选用纤维素膜作为样品垫固相材料，切成具有一定规格的膜块，将样品 垫膜块放入样品垫封闭液(pH:7.2 0. 03mol/L磷酸盐缓冲液+5《BSA， +0. l%Tween 20)中浸 泡，取出，烘干，使其充分干燥备用。
② 玻璃纤维膜结合垫制备选用玻璃纤维膜作为结合垫固相材料，切成具有一定规格的 膜块，在该膜块上加上持续荧光物与目标被检物相关分子的结合物溶液(即持续荧光物标记 物溶液)，烘干膜块，使其充分干燥备用。
③ 分析膜制备选用销酸纤维素膜作为分析膜固相材料，切成具有一定规格的膜块，在该膜块上相隔一定距离分别喷点目标被检物相关特异分子作为检测带和喷点二抗质控物作为 质控带，烘千该膜块，使其充分干燥备用。
④ 强吸水垫制备选用纤维素膜并切成具有一定规格的膜块，充分干燥备用。
⑤ 试条反应终点指示标签制备选用变色范围为5.0-9.0的精密pH试纸，切成具有一定 规格的膜块，充分干燥备用。
⑥ 试条辩识标签制备选用印制有试纸标识的标签纸切成具有一定规格的膜块，充分干 燥备用。
(2)试条装配将制备好的试条各组分按样品垫19、玻璃纤维膜结合垫20、分析膜21、 强吸水垫22、试条反应终点指示标签23、试条辩识标签24顺次相互搭接粘于塑料背板上， 并剪切成一定规格的试条。该试条可以装入外壳中，在干燥条件下备用。该外壳可以是塑料 的。
本发明所述定量检测系统的工作过程为将加有样品的待测持续荧光物标记试条18放于 试条架28的试条槽内。光源1发出的光经光纤束2分为具有一定间距且强度相同的两激光束， 该两激光束由准直照明透镜3准直为两束平行光入射到分色镜4表面，经分色镜4反射后通 过前镜组5同步照射到位于前镜组5物面试条18的检测带25和质控带26上激发试条lg检 测带25和质控带26的持续荧光物标记复合物发出特征波长反射荧光，检测带25和质控带 26发出的特征波长反射荧光经前镜组5收集、透过分色镜4、滤光片6滤去杂光后出后镜组 7进入荧光图像接收器8中被检测转换为电信号，转换后的电信号经信号放大器9放大信号 后传输给模/数转换器IO转换为数字信号，数据处理与控制系统11采集、存储传输来的数字 信号并对其进行数据处理，获得各被检物检测带25光密度值0D tt糾和质控带26光密度值0D 质控带，进而计算得到OD检測带/OD鹏带比值或0D检鹏/ (0D检,+0D通控#)比值，并自动根据IC卡 15上存贮的相应被检物标准工作曲线分析计算出被检物浓度，检测结果传输给输出显示装置 12，完成整个检测过程。
免疫层析是一个动态反应过程，持续荧光物标记粒子在试条上虹吸渗移产生激发荧光的 过程因而也属动态范畴。不同厂家生产的试条产品、或同一厂家生产的不同批次试条产品、 甚至同一厂家生产的同一批次不同分号的试条产品，由于制作工艺和原材料选用方面可能存 在差异，其生产的试条产品的质量可能不会完全相同。当这些试条产品用于被检物浓度测定 时，势必会影响到被检物浓度的精确测定。例如，制作试条所用的纤维素膜来源不同、膜滤 孔大小不同、试条厚度不同等都有可能使反应物在所制作的试条上不会以完全相同的虹吸渗 移速率前行，有的反应物甚至有可能被滞留在试条检测带25和质控带26之前的试条渗移途 中。此外，检测者检测样品时所处环境条件不可能完全一样，例如，野外现场检测和室内检 测时存在的温度、湿度等差异也有可能影响到试条反应物在试条上不会以完全相同的渗移速 率前行，从而影响到被检物浓度的精确测定。为解决上述问题，本发明采用试条随配IC卡 15存贮相应被检物标准工作曲线和由IC卡15同时提供试条质控带光密度参考监控值提示反 应成败办法。IC卡15上的标准曲线和试条质控带光密度参考监控值可随试条批间差异而调 整，操作不仅十分简便，而且提高了检测的精确性和灵活性。检测通过查IC卡15上标准工 作曲线，即可得到准确检测结果；同时，结合IC卡15上存贮的试条质控带光密度参考监控 值，可获知试条反应过程是否成立，从而可判断出所检测到的结果是否真实有效。此外，本 发明经过大量试条反应试验还发现^^条在加入样品反应3分钟后,试条上的试条反应终点
10指示标签23能够显色，提示试条在加入样品反应3分钟后的某一特定时刻，试条反应物B充 分渗移过检测带25和质控带26位置。因此，本发明采用在所述定量检测系统开机3分钟以 后的特定时刻才正式使所述系统开始样品检测，这比较适宜所述系统IC卡15标准工作曲线 和试条质控带光密度参考监控值工作。本发明将这一试条反应时间拟合为系统自检扫描时间， 该时间参数也可标识在与试条相配套的IC卡15上。
本发明所述定量检测系统的检测使用方法通过下述步骤实现
① 开机接通电源；
② 插入存贮有被检物检测标准工作曲线和试条质控带光密度参考监控值的IC卡15;
③ )将加有待测样品的持续荧光物标记试条18放于试条架28的试条槽中；
④ 键盘读入检测参数，包括IC卡15上存贮的被检物检测标准工作曲线和质控带光密度 参考监控值、系统自检扫描时间、样品名称、样品编号、试条批号、试条效期、检测者姓名、 检测日期、IC卡密码等，之后系统自动开始自检计时；
⑤ 系统自检结束，数据处理与控制系统11读取IC卡15参数，并驱动试条架28运动以 适合照明系统发出的光对试条18检测带25和质控带26进行自动扫描，扫描得到的光信号经 光电及模/数转换后，转换为数字信号，传输给数据处理与控制系统ll;
⑥ 数据处理与控制系统11自动识别数字信号中被检物特征波长处的光密度值OD^tt和质 控带光密度值OD展控带，自动计算得到OD检鹏/OD鹏带比值或OD检糾/ (OD检鹏+OD质控带)比值， 并根据IC卡15中存贮的相应被检物检测标准工作曲线自动计算得到被检物浓度，IC卡15 同时提供的质控带光密度参考监控值(ODag#)可判断所得被检物浓度是否有效
⑦ 将分析结果传输给输出显示装置12，输出结果。 本发明要解决的技术问题
本发明要解决的第一个问题是提供一种基于持续荧光物标记的试条定量检测系统。该检 测系统不仅能对目标被检物进行单一或混合定量或定性检测，而且还能实现对免疫层析反应 动态过程进行观測。所述检测系统具有检测灵敏度高、检测结果客观公正、使用灵活等优点。
本发明要解决的第二个问题是提供所述定量检测系统的检测使用方法。
本发明有益效果
(1) 能快速准确实现样品单一或多组分定量或定性检测。本发明所述持续荧光物发射特 征波长荧光亮度高、峰窄、对称、Stokes位移大、寿命长，用其标记试条目标被检物相关分 子，通过一个适当延迟时间检测其所发出的特征波长持续荧光强度，能在有效消除短寿命背 景荧光干扰的同时，达到对试条上发出持续荧光信号的相关目标被检物分子进行定量或定性 检测。其中，量子点作持续荧光标记物更具优良特性，不同粒径、不同成分和不同结构的量 子点不仅能产生不同特征波长持续荧光峰谱，且量子点混合物产生的持续荧光峰谱不重叠。 选用不同粒径、成分和结构的量子点分别标记试条目标被检物相关分子混合物并进行特定荧 光信号测定，能快速准确检测出样品单一组分和多组分目标被检物浓度。
(2) 能对反应过程进行动态监测。本发明根据试条检测带和质控带的OD SS!S/OD皿带比 值或OD检,/ (0D检,+0D质翻)比值、利用随配IC卡15上存贮的各目标被检物相应标准工作 曲线来由数据处理与控制系统ll自动分析确定目标被检物浓度。如果检测反应失败，检测过 程中所得到的质控带光密度值OD鹏带会与IC卡15存贮的质控带光密度参考监控值0D鹏带存 在极大统计学误差，提示试条反应失败。IC卡15上的标准曲线和质控带光密度参考监控值可随试条批间差异而调整，克服了不同批次、不同厂家生产试条质量差异可能造成的被检物 浓度检测差异；本发明还对系统正式检测样品前的试条反应时间进行了反复考察，该试条反 应时间在本发明中被拟合为系统自检扫描时间也被标识在IC卡15上，该时间参数可指令系
统在该时间之后才开始正式对样品进行检测，保证了试条反应物在系统正式开始检测前己充 分渗移至试条检测带25和质控带26位置以适合照明系统发出的光能对试条检测带25和质控 带26进行自动扫描，提高了检测的精确性。
(3) 能实现样品在线检测。本发明所述荧光图像接收器8可以为CCD、 CMOS、光电倍增 管、光电二极管或光电三极管。CCD和CM0S作荧光图像接收器8，所构成的试条定量检测系 统不仅适用于室内检测，而且还可实现样品在线检测，广大室外场所均能方便使用。CM0S体 积小，成本价格低廉。
(4) 能方便检测者用户对检测结果信息进行灵活实时存取与外携。本发明所述IC卡15 通过USB串口与数据处理与控制系统11相连，IC卡15除用于存贮被检物相应标准工作曲 线和质控带光密度参考监控值外，还可用于临时存贮检测者的样品检测结果信息，检测者根 据自己需要可对IC卡15进行实时插拔，从而方便检测者灵活实现对检测结果信息的存取与 外携。
(5) 检测快速，操作方便，检测不需要其他仪器设备和试剂，检测者只要将加有样品的 持续荧光物标记试条18置入所述定量检测系统后，几分钟就能准确获得准确检测结果。检测 结果客观，灵敏度高。
图l:基于持续荧光物标记的试条定量检测系统结构框图。 图2:试条侧视结构图。 图3:试条俯视结构图。
图4:乙肝病毒表面抗原(HBsAg)检测标准工作曲线。
图5:量子点标记的HBsAg荧光光谱曲线。
图6:肿瘤标志物AFP、 CEA、 PSA检测标准工作曲线。
图7:量子点标记的AFP、 CEA、 PSA荧光光谱曲线。
图8: CEA检测标准工作曲线。
图9: EiT纳米微粒标记的CEA荧光光谱曲线。
序号表示如下1、光源；2、光纤束；3、准直照明透镜；4、分色镜；5、前镜组；6、
滤光片；7、后镜组；8、荧光图像接收器；9、信号放大器；10、模/数转换器；11、数据处 理与控制系统；12、输出显示装置(如上位机、字母数字LCD、 LED、声音等)；13、打印机；
14、键盘；15、 IC卡；16、驱动模块；17、步进电机；18、试条；19、样品垫；20、玻璃纤 维膜结合垫；21、分析膜；22、强吸水垫；23、试条反应终点指示标签；24、试条辨识标签； 25、检测带；26、质控带；27、加样孔(其下对应着样品垫19) ; 28、试条架；29、光纤束
包裹两束光纤具体实施例方式
实施例1持续荧光物标记试条定量检測系统结构、工作流程和检測方法 (一)持续荧光物标记试条定量检瀕系统结构
图1是本发明所述持续荧光物标记试条定量检测系统的结构框图。所述定量检测系统包
12括持续荧光物标记试条18、用于放置试条的试条架28、照、明系统、成像系统、荧光屈像接收 器8、信号放大器9、模/数转换器10、数据处理与控制系统ll、输出显示装置12、打印机 13、键盘14和一张与试条配套的IC卡15。
所述系统的试条架28有试条槽。试条槽用于放置待测的持续荧光物标记试条18。所述 试条18顺次设有相互搭接粘贴的样品垫19、包被有持续荧光物标记物的玻璃纤维膜结合垫 20、具有检测带25和质控带26的分析膜21、强吸水垫22、试条反应终点指示标签23和试 条辨识标签24。
所述照明系统包括一激发光源1，在该激发光源1的输出光路上依次为光纤束2、准直照 明透镜3、分色镜4、前镜组5，直至持续荧光物标记试条18。激发光源1包括发光二极管 LED或激光二极管。光纤束2将光源发出的光分为具有一定间距、且强度相同的两激光束， 该两激光束由准直照明透镜3准直为两束平行光后入射到分色镜4表面经前镜组5同步照射 到试条检测带25和质控带26上激发试条检测带25和质控带26的持续荧光物标记复合物发 出特征波长反射荧光。
所述成像系统包括共光轴的前镜组5、分色镜4、滤光片6、后镜组7。分色镜4反射面 与光轴夹角成45"C。前镜组5和后镜组7均采用分离结构。照明系统光路在分色镜4之前部 分与所述成像系统的光轴相垂直，而在分色镜4之后的部分与所述成像系统共光轴。
所述荧光图像接收器8位于后镜组7像面上。所述荧光图像接收器8的信号输出端经信 号放大器9与所述模/数转换器10相连。所述荧光图像接收器8收集试条检测带25和质控带 26反射来的特征波长荧光信号，将其转换成为电信号后由信号放大器9进行信号放大。本发 明所述持续荧光物标记试条定量检测系统的荧光图像接收器8具有多种可供选择对象，包括 CCD、 CMOS、光电倍增管、光电二极管、光电三极管。选用CCD和CMOS作荧光图像接收器8 所构成的持续荧光物标记试条定量检测系统既可用于样品室内检测，也可用于样品实时在线 检测以方便室外样品现场检测使用。现今商业型号的CMOS荧光图像接收器产品已获CCD相似 图像质量，体积小，功耗和价格较之CCD更低，并已集成有信号放大和模/数转换器，能将信 号进行放大和具有模/数转换功能。因此，当选用CMOS构成本发明持续荧光物标记试条定量 检测系统时，可不再另外使用信号放大器9和模/数转换器10以更能降低所述定量检测系统 生产成本。即CMOS采集试条检测带和质控带反射并传输来的持续荧光物标记复合物特征波长 荧光信号并进行光电及模/数转换，转换后的数字信号由数据处理与控制系统11进行存储、 处理。
所述的模/数转换器10的信号输入端与荧光图像接收器8后的信号放大器9信号输出端 相连，模/数转换器10的信号输出端与数据处理与控制系统11的信号输入端相连。所述的模 /数转换器10用于将信号放大器9传输来的放大电信号转变为数字信号。
所述数据处理与控制系统11采集、存储模/数转换器10传输来的数字信号，并对数字信 号进行数据处理。所述数据处理与控制系统11还配有输出显示装置12、打印机13、键盘14 和一张与试条相配套的IC卡15，它们分别与数据处理与控制系统11相连。所述数据处理及 控制系统11与试条架28之间还有一驱动控制电路16， 17，该电路16, 17能使所述定量检 测系统通过其数据处理与控制系统11读取IC卡15上参数后发出指令从而自动控制试条架 28运动以适合照明系统发出的光能对试条检测带25和质控带26进行自动扫描。所述数据处 理与控制系统ll可以为具有相应数据处理和控制软件的单片机、CPU或PC机。所述定量检测系统的输出显示装置12可以为上位机、字母数字LCD、 LED、声音等。所 述系统配合不同的输出显示装置12,实现样品单一成分或多组分定量或定性检测。即所述 系统用于样品定量检测时，输出显示装置12可以为上位机或字母数字LCD;所述系统用于样 品定性检测时，输出显示装置12可以为LED或声音等。
所述IC卡15贮存有各被检物相应检测标准工作曲线和试条质控带光密度参考监控值。 IC卡15与数据处理与控制系统11之间采用USB串口通讯，样品检测时，IC卡15能实时插 拔。IC卡15 IC存的各被检物相应检测标准工作曲线可以采用下述两种曲线方式之一其一 为被检物标准品系列浓度与该被检物标准品系列浓度经本发明所述定量检测系统测得的检测 带光密度值/质控带光密度值的比值(OD检a带/OD鹏带)之间的对应关系曲线；也可以为被检物 标准品系列浓度与该被检物标准品系列浓度经本发明所述定量检测系统测得的检测带光密度 值/ (检测带光密度值+质控带光密度值)的比值(OD检鰣/ (OD检,+OD质控带))之间的对应关 系曲线。标准曲线制作时得到的试条质控带26光密度值(OD廣控裕)同时随标准工作曲线存贮 于IC卡15上兼作试条反应成败的参考监控值。样品实际检测中，如果反应失败，样品裣测 得到的OD鹏《值与IC卡15上存贮的相应OD鹏带值将会产生极大统计学误差。IC卡15贮存 参数与各批次试条产品相配套。样品检测时，操作者插入IC卡15，数据处理与控制系统ll 读取IC卡15参数后发出指令自动控制试条架28运动使照明系统发出并经分色镜4反射来的 光能对试条检测带25和质控带26进行自动扫描，从而得到检测带25和质控带26发出的特 征频率荧光光密度值，并根据IC卡15存贮的相应被检物标准工作曲线(同时参考试条质控 带光密度参考监控值所提示的生物反应成败)即可实现被检物浓度准确测定。IC卡15还可 作临时存储器存储检测结果信息，每一检测都可以打印或保存。所述IC卡15存贮的各被检 物相应标准工作曲线的制作方法为(1)配制标准品系列浓度；(2)将各标准品系列浓度 置于本发明所述定量检测系统测得相应OD检,和OD质控带并分别计算出OD检飾/OD质控带比值或OD 检測带/ (OD检拥带+OD质控带 )比值；(3)以各标准品系列浓度作X轴，测试结果以OD检鰣/OD质控带 比值作Y轴，绘制标准工作曲线。或以各标准品系列浓度作X轴，测试结果以OD检鹏/ (OD 检測带+OD质控带)比值作Y轴，绘制标准工作曲线；(4)编写标准工作曲线软件，并将该曲线软 件与试条质控带光密度参考监控值存贮于IC卡15上。
本发明采用试条随配IC卡15存贮相应被检物标准工作曲线和由IC卡15提供试条质控 带光密度参考监控值提示反应成败办法。IC卡15上的标准曲线和质控带光密度参考监控值 可随试条批间差异而调整。本发明采用在所述定量检测系统开机3分钟以后的特定时刻才正 式使所述系统开始进行样品检测，以适合IC卡的检测标准工作曲线和试条质控带光密度参考 监控值工作。这一试条反应时间在本发明中被拟合为系统自检扫描时间，其参数仍标识在与 试条相配套的IC卡15上。
本发明所述持续荧光物系指一类被一定波长激发光激发后可持续发出寿命相对较长特征 波长荧光的物质，其特别包括量子点和纳米稀土荧光配合物。其中，所述量子点包括ZnS、 CdS、 HgS、 ZnSe、 CdSe、 HgSe、 CdTe、 ZnTe、 ZnO、 PbSe、 HgTe、 CaAs、 InP、 InAs、 InCaAs、 CdS/ZnS、 CdS/Ag2S、 CdS/PbS、 CdS/Cd(0H)2、 CdS/HgS、 CdS/HgS/CdS、 ZnS/CdS、 ZnS/CdS/ZnS、 ZnS/HgS/ZnS/CdS、 CdSe/CdS、 CdSe/ZnS、 CdSe/ZnSe、 CdSe/CuSe、 CdSe/HgTe、 CdSe/HgSe、 CdSe/HgSe/CdSe、 CdTe/HgS、 CdTe/HgTe、 InAs/InP、 InAs/CdSe、 InAs/ZnSe、 MgS、 MgSe、 MgTe、 CaS、 CaSe、'CaTe、 SrS、 SrSe、' SeTe、.BaS、-BaS-e、 BaTe、"GdS:Mn、'ZnS:Mn、 CdS:Cu、ZnS:Cu、 CdS:Tb、 ZnS:Tb中的任意一种或任意几种纳米粒子的组合，以及由上述任意一种量 子点为核、二氧化硅为壳的核-壳型纳米复合粒子。所述纳米稀土荧光配合物包括铕(Eu)、 钐(Sin)、镝(Dy)、铽(Tb)的镧系螯合物或它们的混合物。
上述持续荧光物标记的目标被检物包括病原体、抗原、抗体、违禁药品、重大疾病(肿瘤、 癌症、心血管疾病和糖尿病等)、农药残留量、食品安全生物检测等多种目标被检物。本发明 对上述持续荧光物标记的目标被检物进行单一或混合定量或定性检测。
与现有技术相比较，本发明的特点在于能实现样品单一组分或多组分准确定量检测， 根据需要也可进行样品半定量或定性检测；利用荧光图像接收器(如CCD、 CMOS)、模数转 换器及数据处理与控制系统(包括CPU、单片机、PC机)并结合试条反应时间(即开机后所 述系统自检扫描时间)，能方便分析试条反应物的渗移分布状态，实现对生物反应过程的动 态监测，达到深入了解该生物反应过程的成败细节；处理软件(如IC卡)能自动有机结合持 续荧光物标记试条检测带25和质控带26荧光强弱准确定量目标被检物浓度或定性检测目标 被检物有无，克服了不同批次、不同厂家生产的试条产品因其质量差异而造成的检测结果差 异，检测结果客观，操作方便，不需其他任何仪器设备和试剂，几分钟内就能准确获得检测 结果，工作效率高。
(二) 本发明所述持续荧光物标记试条定量检測系统工作过程 本发明所述定量检测系统的工作过程为:将加有样品的待测持续荧光物标记试条18放于
试条架28的试条槽内。光源1发出的光经光纤束2分为具有一定间距且强度相同的两激光束， 该两激光束由准直照明透镜3准直为两束平行光入射到分色镜4表面，经分色镜4反射后通 过前镜组5同步照射到位于前镜组5物面试条18的检测带25和质控带26上激发试条18检 测带25和质控带26的持续荧光物标记复合物发出特征波长反射荧光，检测带25和质控带 26发出的特征波长反射荧光经前镜组5收集、透过分色镜4、滤光片6滤去杂光后出后镜组 7进入荧光图像接收器8中被检测转换为电信号，转换后的电信号经信号放大器9放大信号 后传输给模/数转换器10转换为数字信号，数据处理与控制系统11采集、存储传输来的数字 信号并对其进行数据处理，获得各被检物检测带25光密度值0D糊*和质控带26光密度值0D 质控带，进而计算得到0D检a带/0D鹏带比值或0D检,/ (OD检鹏+OD鹏裕)比值，并自动根据IC卡 15上存贮的相应被检物标准工作曲线分析计算出被检物浓度，之后将检测结果传输给输出显 示装置12,完成整个检测过程。
(三) 本发明所述持续荧光物点标记试条定量检測系统的检測使用方法
技术领域：
本发明所述定量检测系统的检測使用方法通过下述步骤实现
① 开机接通电源； △
② 插入存贮有被检物检测标准工作曲线和试条质控带光密度参考监控值的IC卡15;
③ )将加有待测样品的持续荧光物标记试条18放于试条架28的试条槽中；
④ 键盘读入检测参数，包括IC卡15上存贮的被检物检测标准工作曲线和质控带光密度 参考监控值、系统自捡扫描时间、样品名称、样品编号、试条批号、试条效期、检测者姓名、
检测日期、IC卡密码等，之后系统自动开始自检计时；
⑤ 系统自检结束，数据处理与控制系统11读取IC卡15参数，并驱动试条架28运动以 适合照明系统发出的光对试条18检测带25和质控带26进行自动扫描，扫描得到的光信号经 光电及模/数转换后，转换为数字信号，传输给数据处理与控制系统ll;⑥ 数据处理与控制系统11自动识别数字信号中被检物特征波长处的光密度值00糊*和质 控带光密度值0D 质控带，自动i十算得至廿OD检羹带/OD质控带比值或OD检翻带/ (OD检糾+OD质控带) 比值， 并根据IC卡15中存贮的相应被检物检测标准工作曲线自动计算得到被检物浓度，IC卡15 同时提供的质控带光密度参考监控值(OD鹏带)可判断所得被检物浓度是否有效。
⑦ 将分析结果传输给输出显示装置12，输出结果。
实施例2量子点作持续荧光物标记试条检測乙肝表面抗原冊sAg (单项检測) ( 一 )量子点标记的乙肝表面抗原冊sAg试条制作
所述检测用的量子点标记试条顺次设有相互搭接粘贴的样品垫19、包被有量子点标记的 HBsAg单克隆抗体的玻璃纤维膜结合垫20、具有检测带25和质控带(26)的分析膜21、强 吸水垫22、试条反应终点指示标签23和"HBsAg"试条辨识标签(24)。检测带25包被有 HBsAg单克隆抗体。质控带26包被有二抗质控物羊抗鼠IgM抗体、或羊抗鼠IgG抗体、或兔 抗鼠IgM抗体、或兔抗鼠IgG抗体。
1、 试条各组分制备
(1) 样品垫:选用纤维素膜，切成297xl5mra膜块，置长形槽中，加封闭液(pH=7.2 0. 03mol/L磷酸盐缓冲液+5WBSA， +0. l%Tween 20)常温浸泡30min。取出膜块，37°C烘干， 充分干燥备用。
(2) 玻璃纤维膜结合垫选用玻璃纤维膜，切成297xl0mm膜块，置长形槽中，如预先 准备好的量子点-HBsAg单克隆抗体结合物溶液于其上，取出膜块，37T烘干，充分干燥备用。
(3) 分析膜选用硝酸纤维素膜，切成297x25rara膜块，置长形槽中，自膜块底边起由 下自上相隔一定距离用点膜仪分别喷点0. 5-5mg/mlHBsAg单克隆抗体作检测带和喷点 0.5-5mg/ml羊抗鼠IgM抗体、或羊抗鼠IgG抗体、或兔抗鼠IgM抗体、或兔抗鼠IgG抗体作 质控带，之后将所制膜块于37。C烘干，充分干燥备用。
(4) 强吸水垫选用具有强吸水作用的纤维素膜，切成297x30ram膜块，充分干燥备用。
(5) 试条反应终点指示标签选用变色范围为5. 0-9. 0的精密pH试纸，切成具有297x5mm 的膜块，充分干燥备用。
(6) 试条辩识标签选用印制有"HBsAg"标识的标签纸切成具有297x5ram的膜块，充 分干燥备用。
2、 试条装配
将制备好的试条各组分按样品垫19、玻璃纤维膜结合垫20、分析膜21、强吸水垫22、 试条反应终点指示标签23、试条辩识标签24顺次相互搭接粘于塑料背板上，并剪切成一定 规格的试条。该试条可以装入外壳中，在干燥条件下备用。该外壳可以是塑料的。 (二)乙肝表面抗原冊sAg检測标准工作曲线绘制与存贮
图4是HBsAg检测标准工作曲线。其制作方法如下
1、 朋sAg标准品系列浓度配制
用1:10稀释的正常人血清(以pH=7.2 0.03mol/L PB缓冲液稀释)作稀释液，将HBsAg 标准品配成系列浓度20份Opg/ral、 100pg/ml、 200pg/ml、 300pg/ml、 400pg/ml、 500pg/ml、 600pg/ml、 700pg/ml、 800pg/ml、 900pg/ml、 1000pg/ml、 1100pg/ml、 1200pg/ml、 1300pg/ml、 1400pg/ml、 1500pg/ml、 1600pg/ml、 1700pg/ml、 1800pg/ml、 1900pg/ml。
2、 绘制HBsAg检测标准工作曲线上述每一 HBsAg标准品系列浓度分别用10条量子点标记的HBsAg试条于相同系统设置条 件下检测10次，分别读得其检测带光密度值(OD检鰣)与质控带光密度值(OD鹏J ,计算 平均值和OD检,/OD廣控带比值。以HBsAg标准品系列浓度作X轴，以每一 HBsAg标准品系列浓 度对应求得的OD检糾/OD鹏《比值作Y轴绘制标准工作曲线，结果见图4。
3、编写HBsAg检测标准工作曲线软件，将该曲线软件连同OD质控带值(样品实际检测中， 该OD质絲值作为试条质控带光密度参考监控值)存入IC卡。 (三)乙肝患者血清样品HBsAg检測
1、 样品来源乙肝患者血清样品由某妇幼保健院提供，检测前血清样品用PH = 7.2 0. 03mol/L PB缓冲液作10倍稀释。
2、 样品检测-
(1) 开机接通系统电源；
(2) 插入存贮有HBsAg检测标准工作曲线和试条质控带光密度参考监控值的IC卡15:
(3) 将加有乙肝患者待测血清样品的量子点标记试条18放于试条架28的试条槽中；
(4) 键盘14读入检测参数包括IC卡的HBsAg标准工作曲线和质控带光密度参考监控 值、检品名称、检品编号、试条批号、试条效期、检测日期、检测者姓名、IC卡密码等，系 统自检扫描时间设为5分钟，之后系统自动开始自检计时；
(5) 系统自检结束，数据处理与控制系统11读取IC卡15参数，并驱动试条架28运动 以适合照明系统发出的光对试条18检测带25和质控带26进行自动扫描，扫描得到的光信号 经光电及模/数转换后，转换为数字信号，传输给数据处理与控制系统ll:
(6) 数据处理与控制系统ll自动识别数字信号中检测带特征波长处的光密度值(OD目 带)和质控带光密度值(OD质絲)，自动计算得到OD检鰣/ODffi随比值，并根据IC卡中存贮的 HBsAg标准工作曲线自动计算得到血清样品中的HBsAg浓度。如本实施例血清样品经所述定 量检测系统检测其HBsAg浓度为205. 9563 pg/ml;
(7〉输出显示装置12显示检测结果； (8)系统打印检测结果报告。
3、 乙肝患者血清样品HBsAg最终浓度计算-
血清样品中朋sAg最终浓度(pg/ml) -系统测得的HBsAg浓度X血清稀释倍数 本实施例中，所述血清样品HBsAg最终浓度(pg/ml) =205. 9563pg/ml X10
=2059. 563pg/ml
图5为量子点标记的HBsAg荧光光谱曲线。其中，I为检測带中的冊sAg光谱峰，II为 质控带中的质控物光谱峰。
实施例3量子点作持续荧光物标记试条检涮血清肿瘇标志物AFP、 CEA和PSA (—检多项) (一)量子点标记的肿痛标志物一检多项试条制作
所述试条1&顺次设有相互搭接粘贴的样品垫19、玻璃纤维膜结合垫20、具有检测带25 和质控带26的分析膜21、强吸水垫22、试条反应终点指示标签(23)和"AFP/CEA/PSA"试 条辨识杏，签24。玻璃纤维膜结合垫20包被有量子点杏^记的甲胎蛋白(AFP)单抗、量子点标 记的癌胚抗原(CEA)单抗、和量子点标记的前列腺特异抗原(PSA)单抗的混合物；检测带 25包被有AFP抗体、CEA抗体和PSA抗体的混合物；质控带26包被有二抗质控物羊抗鼠IgM 抗体、或羊抗鼠IgG抗体、或兔抗鼠IgM抗体、或兔抗鼠IgG抗体。1、 试条各组分制备
(1) 样品垫:选用纤维素膜，切成297x15mm膜块，置长形槽中，加封闭液(pH = 7.2 0. 03mol/L磷酸盐缓冲液+5鬼BSA， +0. l%Tween 20)常温浸泡30min。取出膜块，37°C烘干， 充分千燥备用。
(2) 玻璃纤维膜结合垫选用玻璃纤维膜，切成297x10mm膜块，置长形槽中，加预先 准备好的量子点标记物溶液(为含有量子点标记的AFP单抗、量子点标记的CEA单抗、量子 点标记的PSA单抗的混合物溶液)于其上，取出膜块，37。C烘干，充分干燥备用。
(3) 分析膜选用硝酸纤维素膜，切成297x25mm膜块，置长形槽中，自膜块底边起由 下自上相隔一定距离用点膜仪喷点AFP抗体(0.5-5mg/ml) 、 CEA抗体(0.5-5mg/ml)和PSA 抗体(0.5-5mg/ml)的混合物作检测带，用点膜仪喷点0. 5-5mg/ral羊抗鼠IgM抗体、或羊抗 鼠IgG抗体、或兔抗鼠IgM抗体、或兔抗鼠IgG抗体作质控带，之后将所制膜块于37°C烘干， 充分干燥备用。
(4) 强吸水垫选用具有强吸水作用的纤维素膜，切成297x30mm膜块，充分干燥备用。
(5) 试条反应终点指示标签选用变色范围为5. 0-9. 0的精密pH试纸，切成具有297x5mra 的膜块，充分干燥备用。
(6) 试条辩识标签选用印制有"AFP/CEA/PSA"标识的标签纸切成具有297x5mm的膜 块，充分干燥备用。
2、 试条装配
将制备好的试条各组分按样品垫19、玻璃纤维膜结合垫20、分析膜21、强吸水垫22、 试条反应终点指示标签23、试条辩识标签24顺次相互搭接粘于塑料背板上，并剪切成一定 规格的试条。该试条可以装入外壳中，在干燥条件下备用。该外壳可以是塑料的。
(二) 标准工作曲线绘制与存贮
图6是AFP、 CEA、 PSA检测标准工作曲线。其制作方法如下
1、 标准品系列浓度配制
用1:10稀释的正常人血清(以pH=7. 2 O.03mol/L PB缓冲液稀释)作稀释液，将AFP、 CEA和PSA标准品分别按Opg/ml、 100pg/ml、 200pg/ml、 300pg/ml、 400pg/ml、 500pg/ml、 600pg/ml、 700pg/ml、 800pg/ml、 900pg/ml、 1000pg/ml、 1100pg/ml、 1200pg/ml、 1300pg/ml、 1400pg/ml、 1500pg/ml、 1600pg/ml、 1700pg/ml、 1800pg/ml、 1900pg/ml配成系列浓度各20 份。
2、 绘制肿瘤标志物检测标准工作曲线
每份肿瘤标志物标准品系列浓度分别用10条量子点标记的肿瘤标志物一检多项试条在 相同系统设置条件下检测10次，分别读得其检测带光密度值(0Dttam)与质控带光密度值(OD 质控带)，得到平均值和OD检鰣/OD鹏带比值。以每一肿瘤标志物标准品系列浓度作X轴，以各 肿瘤标志物标准品系列浓度对应求得的OD检,/OD鹏#比值作Y轴绘制标准工作曲线，结果见 图6。
3、 编写肿瘤标志物检测标准工作曲线软件，将该曲线软件连同OD质絲值(样品实际检测 中，该OD质控带值作为试条质控带光密度参考监控值)存入IC卡。
(三) 肿瘤患者血清样品肿瘪标志物检溯
1、样品来源血清样品由某肿瘤医院化验室提供。检测前血清样品用pH=7. 2 0. 03mol/L
18PB缓冲液作10倍稀释。
2、 样品检测-
(1) 开机接通系统电源；
(2) 插入存贮有AFP、 CEA、 PSA检测标准工作曲线和试条质控带光密度参考监控值的 IC卡15;
(3) 将加有肿瘤患者待测血清样品的量子点标记试条18放于试条架28的试条槽中；
(4) 键盘14读入检测参数包括IC卡的AFP、 CEA、 PSA标准工作曲线和质控带光密度 参考监控值、检品名称、检品编号、试条批号、试条效期、检测日期、检测者姓名、ic卡密 码等，系统自检扫描时间设为5分钟，之后系统自动开始自检计时；
(5) 系统自检结束，数据处理与控制系统11读取IC卡15参数，并驱动试条架28运动 以适合照明系统发出的光对试条18检测带25和质控带26进行自动扫描，扫描得到的光信号 经光电及模/数转换后，转换为数字信号，传输给数据处理与控制系统ll;
(6) 数据处理与控制系统ll自动识别数字信号中检测带特征波长处的光密度值
带)和质控带光密度值(OD鹏带)，自动计算得到OD检飾/OD质絲比值，并根据IC卡中存贮的 AFP、 CEA、 PSA标准工作曲线自动计算得到血清样品中的AFP、 CEA和PSA浓度。如本实施例 血清样品经所述定量检测系统检测其AFP为1753. 4526pg/ral、 CEA浓度为878. 3892pg/ml、 PSA浓度为983. 4257pg/ml;
(7) 输出显示装置12显示检测结果；
(8) 系统打印检测结果报告。
3、 肿瘤患者血清样品AFP、 CEA、 PSA最终浓度计算
公式为血清样品肿瘤标志物最终浓度(pg/ml) -系统测得浓度X血清稀释倍数
由此得
血清样品AFP最终浓度(pg/ml) = 1753. 4526pg/ml x 10=17534. 526pg/ml 血清样品CEA最终浓度(pg/ml) =878. 3892pg/ml x 10=8783. 892pg/ml 血清样品PSA最终浓度(pg/ml) =983. 4257pg/ml X 10=9834. 257pg/ml 图7为量子点标记的AFP、 CEA、 PSA荧光光谱曲线。其中，I为检测带中的AFP光谱峰， II为检测带中的CEA光谱峰，m为检测带中的PSA光谱峰，IV为质控带中的质控物光谱峰。 实施例4纳米稀土荧光配合物作持续荧光物标记试条检溯血淸癌胚抗原CEA (单项检測) 纳米稀土荧光配合物以E,纳米微粒为例。 (一)试条制作
Eu"纳米微粒标记试条18顺次设有相互搭接粘贴的样品垫19、玻璃纤维膜结合垫20、具 有检测带25和质控带26的分析膜21、强吸水垫22、试条反应终点指示标签23和"CEA"试 条辨识标签24。玻璃纤维膜结合垫20包被有E^纳米微粒标记的CEA单抗；检测带25包被 有CEA抗体；质控带26包被有二抗质控物羊抗鼠IgM抗体、或羊抗鼠IgG抗体、或兔抗鼠 IgM抗体、或兔抗鼠IgG抗体。
1、试条各组分制备
(1)样品垫:选用纤维素膜，切成297xl5mm膜块，置长形槽中，加封闭液(pH;7.2 0. 03mol/L磷酸盐缓冲液+5《BSA， +0. l%Tween 20)常温浸泡30min。取出膜块，37°C烘干， 充分千燥备用。(2) 玻璃纤维膜结合垫选用玻璃纤维膜，切成297x10mm膜块，置长形槽中，加预先 准备好的Eu"纳米微粒标记的CEA单抗溶液于其上，取出膜块，37"C烘干，充分干燥备用。
(3) 分析膜选用硝酸纤维素膜，切成297x25mra膜块，置长形槽中，自膜块底边起由 下自上相隔一定距离用点膜仪喷点CEA抗体(0.5-5mg/ml)作检测带，用点膜仪喷点 0.5-5mg/ml羊抗鼠IgM抗体、或羊抗鼠IgG抗体、或兔抗鼠IgM抗体、或兔抗鼠IgG抗体作 质控带，之后将所制膜块于37"C烘干，充分干燥备用。
(4) 强吸水垫选用具有强吸水作用的纤维素膜，切成297x30mm膜块，充分干燥备用。
(5) 试条反应终点指示标签选用变色范围为5. 0-9. 0的精密pH试纸，切成具有297x5mm
的膜块，充分干燥备用。
(6) 试条辩识标签选用印制有"CEA"标识的标签纸切成具有297x5mm的膜块，充分
干燥备用。
2、试条装配
将制备好的试条各组分按样品垫19、玻璃纤维膜结合垫20、分析膜21、强吸水垫22、 试条反应终点指示标签23、试条辩识标签24顺次相互搭接粘于塑料背板上，并剪切成一定 规格的试条。该试条可以装入外壳中，在干燥条件下备用。该外壳可以是塑料的。
(二) 标准工作曲线绘制与存贮 图8是CEA检测标准工作曲线。其制作方法如下
1、 标准品系列浓度配制
用l:10稀释的正常人血清(以pH:7.2 0.03mol/L PB缓冲液稀释)作稀释液，将CEA标 准品分别按Opg/ml 、 100pg/ml 、 200pg/ml 、 300pg/ml 、 400pg/ml 、 500pg/ral 、 600pg/ral 、 700pg/ml 、 800pg/ml、900pg/ml、1000pg/ml、1100pg/ml、1200pg/ml、1300pg/ml、1400pg/ml、1500pg/ml、 1600pg/ml、 1700pg/ml、 1800pg/ml、 1900pg/ml配成系列浓度各20份。
2、 绘制CEA检测标准工作曲线
每份CEA标准品系列浓度分别用10条Eu3+纳米微粒标记的CEA试条在相同系统设置条件 下检测10次，分别读得其检测带光密度值(OD检,)与质控带光密度值(OD鹏带)，得到平 ^ ^0 OD检激带/ (OD廣控带+0D质控带 )比值。以每一CEA标准品系列浓度作X轴，以各CEA标准品 系列浓度对应求得的OD检鹏/ (0D质飾+OD廣糾)比值作Y轴绘制标准工作曲线，结果见图8。
3、 编写CEA检测标准工作曲线软件，将该曲线软件连同ODs絲值(样品实际检测中，该 OD质飾值作为试条质控带光密度参考监控值)存入IC卡。
(三) 血清样品CEA检測
1、 样品来源血清样品由某妇幼保健院化验室提供。检测前血清样品用pH = 7.2 0. 03mol/L PB缓冲液作10倍稀释。
2、 样品检测
(1) 开机接通系统电源；
(2) 插入存贮有CEA检测标准工作曲线和试条质控带光密度参考监控值的IC卡15;
(3) 将加有待测血清样品的Eu3+纳米微粒标记的CEA试条18放于试条架28的试条槽中；
(4) 键盘14读入检测参数包括IC卡的CEA标准工作曲线和质控带光密度参考监控值、 检品名称、检品编号、试条批号、试条效期、检测日期、检测者姓名、IC卡密码等，系统自 检扫描时间设为5分钟(含延迟400nS)、之后系统自动开始自检计时；(5) 系统自检结束，数据处理与控制系统11读取IC卡15参数，并驱动试条架28运动 以适合照明系统发出的光对试条18检测带25和质控带26进行自动扫描，扫描得到的光信号 经光电及模/数转换后，转换为数字信号，传输给数据处理与控制系统ll;
(6) 数据处理与控制系统ll自动识别数字信号中检测带特征波长处的光密度值(0D检糊 带)和质控带光密度值(OD质控带)，自动计算得至ll 0D检測带/ (OD质控带+OD廣控带 )比值，并根据ic 卡中存贮的CEA标准工作曲线自动计算得到血清样品中的CEA浓度。如本实施例血清样品经 所述定量检测系统检测其CEA浓度为586. 4602pg/ml;
(7) 输出显示装置12显示检测结果；
(8) 系统打印检测结果报告。 3、血清样品CEA最终浓度计算
血清样品中CEA最终浓度(pg/ml)=系统测得的CEA浓度X血清稀释倍数 本实施例中，所述血清样品CEA最终浓度(pg/ml) =586. 4602pg/ml X10
=5864.602pg/ml
图9为Eu3+纳米微粒标记的CEA荧光光谱曲线。其中，I为检測带中的CEA光谱峰，II 为质控带中的质控物光谱峰。
上面实施例及其附图仅是为了进一步说明本发明，本领域人员不应以此限制本发明的保 护范围。特别需要指出的是，本发明所述定量检测系统所适合的持续荧光物除量子点、纳米 稀土荧光配合物外，还可以是其他一些受激发光激发能够产生相对长寿命特征波长荧光的持 续荧光物，例如由有机单体苯乙烯、丙稀酸聚合成的有机高分子荧光纳米微粒等。因此，凡 是对本发明所指持续荧光物含义及所述持续荧光物标记试条定量检测系统采用任何等同替换 或等效变换形成的其它技术方案，均落在本发明权利要求的保护范围中。
2权利要求
1、一种基于持续荧光物标记的试条定量检测系统，其特征在于它包括持续荧光物标记试条(18)、用于放置试条的试条架(28)、照明系统、成像系统、荧光图像接收器(8)、信号放大器(9)、模/数转换器(10)、数据处理与控制系统(11)、输出显示装置(12)、打印机(13)、键盘(14)和一张与试条配套的IC卡(15)所述照明系统包括一激发光源(1)，在该激发光源(1)的输出光路上依次为光纤束(2)、准直照明透镜(3)、分色镜(4)、前镜组(5)，直至持续荧光物标记试条(18)；所述成像系统包括共光轴的前镜组(5)、分色镜(4)、滤光片(6)、后镜组(7)，分色镜(4)反射面与光轴夹角成45℃，前镜组(5)和后镜组(7)均采用分离结构，照明系统光路在分色镜(4)之前部分与所述成像系统的光轴相垂直，照明系统光路在分色镜(4)之后的部分与所述成像系统共光轴；所述荧光图像接收器(8)位于后镜组(7)像面上，荧光图像接收器(8)的信号输出端经信号放大器(9)与模/数转换器(10)相连，所述模/数转换器(10)与所述数据处理与控制系统(11)相连；所述输出显示装置(12)、打印机(13)、键盘(14)和IC卡(15)分别与所述数据处理与控制系统(11)相连；所述数据处理与控制系统(11)与试条架(28)之间有一驱动控制电路(16，17)，所述数据处理与控制系统(11)读取IC卡(15)参数发出指令通过该驱动控制电路(16，17)自动控制试条架(28)运动以适合照明系统发出的光对试条检测带(25)和质控带(26)进行自动扫描；光源(1)发出的光经光纤束(2)分为具有一定间距且强度相同的两激光束，该两激光束由准直照明透镜(3)准直为两束平行光入射到分色镜(4)表面，经分色镜(4)反射后通过前镜组(5)同步照射到位于前镜组(5)物面试条(18)的检测带(25)和质控带(26)上激发试条(18)检测带(25)和质控带(26)的持续荧光物标记复合物发出特征波长反射荧光，检测带(25)和质控带(26)反射荧光经同一前镜组(5)收集、透过分色镜(4)、滤光片(6)滤去杂光后出后镜组(7)进入荧光图像接收器(8)中被检测转换为电信号，转换后的电信号经信号放大器(9)放大信号后传输给模/数转换器(10)转换为数字信号并传输给数据处理与控制系统(11)进行存储和数据处理，数据处理与控制系统(11)自动对检测带(25)和质控带(26)传输来的特征频率荧光光密度进行识别、并根据IC卡(15)存贮的被检物标准工作曲线进行浓度计算和技术分析，将结果传输给输出显示装置(12)。
2、 根据权利要求1所述的持续荧光物标记试条定量检测系统，其特征在于所述激发光 源(1)包括发光二极管LED或激光二极管。
3、 根据权利要求1所述的持续荧光物标记试条定量检测系统，其特征在于所述荧光图 像接收器(8)可以为CCD、 CMOS、光电倍增管、光电二极管或光电三极管。
4、 根据权利要求1所述的持续荧光物标记试条定量检測系统，其特征在于所述数据处理与控制系统(11)可以为具有相应数据处理和控制软件的单片机、CPU或PC机。
5、 根据权利要求1所述的持续荧光物标记试条定量检測系统，其特征在于所述输出显示装置(12)可以为上位机、字母数字LCD、发光二极管LED或声音。
6、 根据权利要求1所述的持续荧光物标记试条定量检測系统，其特征在于所述持续荧 光物标记试条(18)为所述定量检测系统相配套的持续荧光物标记试条(18)，其上顺次设 有相互搭接粘贴的样品垫(19)、玻璃纤维膜结合垫(20)、具有检測带(25)和质控带(26) 的分析膜(21)、强吸水垫(22)、试条反应终点指示标签(23)和试条辨识标签(24)。
7、 根据权利要求1或6所述的持续荧光物标记试条定量检测系统，其特征在于所述持 续荧光物标记试条的玻璃纤维膜结合垫(20)包被有持续荧光物标记的用于目标被检物检测 的相关生物分子，检测带(25)包被有用于目标被检物检测的相关特异生物分子，质控带(26) 包被有包括二抗的质控物。
8、 根据权利要求7所述的持续荧光物标记试条定量检测系统，其特征在于:其中所述试 条的玻璃纤维膜结合垫(20)的所述持续荧光物为一类能被一定波长激发光激发后可持续发 出寿命相对较长特征波长荧光的物质。
9、 根据权利要求8所述的持续荧光物标记试条定量检测系统，其特征在于其中所述的 持续荧光物为量子点，包括ZnS、 CdS、 HgS、 ZnSe、 CdSe、 HgSe、 CdTe、 ZnTe、 Zn0、 PbSe、 HgTe、 CaAs、 InP、 InAs、 InCaAs、 CdS/ZnS、 CdS/Ag2S、 CdS/PbS、 CdS/Cd(0H)2、 CdS/HgS、 CdS/HgS/CdS、 ZnS/CdS、 ZnS/CdS/ZnS、 ZnS/HgS/ZnS/CdS、 CdSe/CdS、 CdSe/ZnS、 CdSe/ZnSe、 CdSe/CuSe、 CdSe/HgTe、 CdSe/HgSe、 CdSe/HgSe/CdSe、 CdTe/HgS、 CdTe/HgTe、 InAs/InP、 InAs/CdSe、 InAs/ZnSe、 MgS、 MgSe、 MgTe、 CaS、 CaSe、 CaTe、 SrS、 SrSe、 SeTe、 BaS、 BaSe、 BaTe、 CdS:Mn、 ZnS:Mn、 CdS:Cu、 ZnS:Cu、 CdS:Tb、 ZnS:Tb中的任意一种或任意几种纳米粒 子的组合，以及由上述任意一种量子点为核、二氧化硅为壳的核-壳型纳米复合粒子。
10、 根据权利要求8所述的持续荧光物标记试条定量检测系统，其特征在于其中所述 的持续荧光物为纳米稀土荧光配合物，包括Eu、 Sm、 Dy、 Tb的镧系螯合物或它们的混合物。
11、 根据权利要求1所述的持续荧光物标记试条定量检测系统，其特征在于所述IC卡 (15)贮存有被检物检测标准工作曲线，其或为被检物标准品系列浓度与该被检物标准品系列浓度经本发明所述系统测得的检测带光密度值/质控带光密度值的比值OD esw/OD 旨之 间的对应关系曲线，或为被检物标准品系列浓度与该被检物标准品系列浓度经本发明所述系 统测得的检测带光密度值/ (检测带光密度值+质控带光密度值)的比值OD检鹏/ (OD检鹏+OD质 之间的对应关系曲线。
12、 根据权利要求1所述的持续荧光物标记试条定量检测系统，其特征在于所述IC卡 (15)贮存有试条质控带光密度参考监控值。
13、 一种如权利要求1所述的持续荧光物标记试条定量检测系统的检测使用方法，其特征在于包括以下步骤① 开机接通电源；② 插入IC卡(15);③ )将加有待测样品的持续荧光物标记试条(18)放于试条架(28)的试条槽中； 键盘(14)读入检测参数，包括IC卡(15)上存贮的被检物检测标准工作曲线和质控 带光密度参考监控值、系统自检扫描时间、样品名称、样品编号、试条批号、试条效期、检 测者姓名、检测日期，之后系统自动开始自检计时；⑤ 系统自检结束，数据处理与控制系统(11)读取IC卡(15)参数，并驱动试条架(28) 运动以适合照明系统发出的光对试条(18)检测带(25)和质控带(26)进行自动扫描，扫 描得到的光信号经光电及模/数转换后，转换为数字信号，传输给数据处理与控制系统(ll);⑥ 数据处理与控制系统(11)自动识别数字信号中被检物特征波长处的光密度值OD检拥带 和质控带光密度值OD鬼控帝，自动计算得到OD检射/OD逮絲比值或OD检糾/ (OD检鹏+OD鹏带)比 值，并根据IC卡(15)中存JC的相应被检物检测标准工作曲线自动计算得到被检物浓度，IC 卡(15)同时提供的质控带光密度参考监控值ODa^协助判断所测得的被检物浓度是否有效；⑦ 分析结果传输给输出显示装置U2)，输出结果。
全文摘要
本发明属于生物医疗器械领域，具体涉及一种基于持续荧光物标记的试条定量检测系统及其方法。系统包括持续荧光物标记试条、试条架、照明系统、成像系统、荧光图像接收器、信号放大器、模/数转换器、数据处理与控制系统、输出显示装置、打印机、键盘和一张与试条配套的IC卡。数据处理与控制系统读取IC卡参数后控制试条架运动，使照明系统发出的光经分色镜反射后自动对试条进行扫描，所采集的特征波长反射荧光经荧光图像接收器、信号放大器、模/数转换器传输给数据处理与控制系统进行光密度识别和浓度计算，输出显示装置显示结果。本发明能快速准确实现单组分和多组分样品定量或定性检测。系统具有检测灵敏度高、结果客观、使用灵活等特点。
文档编号G01N33/558GK101592659SQ200910058298
公开日2009年12月2日 申请日期2009年2月9日 优先权日2009年2月9日
发明者敏 顾, 灵 马, 马义才 申请人:马义才