专利名称：乳品中β-内酰胺酶的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及生物分析技术，更具体涉及一种乳品中β -内酰胺酶的快速检测方 法，适用于各类液态食品中酶或酶底物，尤其是乳品中的β -内酰胺酶的快检测分析。
背景技术：
目前，直接检测内酰胺酶的方法主要是基于抗原-抗体反应的检测试剂盒。 检测费用高(百元/每样品)，且抗体的特异性不好，容易受到其它成分的干扰，精度不够。 另一种方法是应用色谱间接的测量内酰胺酶的活性，该方法测试精度高，但测试费用 更加昂贵，且测试周期相对较长，无法现场检测。所有的现有方法都不能快速和现场(如采 奶站)进行测试，因为它们都需要对奶样品进行预处理。本发明所涉及的乳品中β -内酰胺酶的快速检测方法是基于酶热生物分析仪技 术(Enzyme Thermistor)。它集成了酶技术、微流体分析技术、微热传感技术等。它不需要 对样品进行预处理、具有很高的测量精度、快速、检测费用低等优点。该检测仪由两大部件 构成酶热生物反应和传感器以及信号放大与处理器。酶热生物分析仪是基于这一原理，即，将特异性的酶催化反应(如，奶中β “内酰 胺酶催化青霉素)与一种普遍的流动量热分析结合起来，从而实现独一无二的、万能的生 物分析和测量。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种乳品中内酰胺酶的快速检测方法，适用于对各 类液态食品中酶或酶底物，尤其是对乳品中的内酰胺酶的快检测分析。本发明的主要内容为发展了一种β “内酰胺酶的快速测定方法。该方法将待测 样品，如奶液中含有的β -内酰胺酶与其底物，如青霉素以两组独立的流动相在一反应器 进行混合并进行催化反应，将其生物催化产生的热量转化成温度的变化，并通过测量其温 度的相对变化来确定其待测物的成分、浓度或活性等。该内酰胺酶测定仪为酶热生物 分析仪，能定量分析和定性分析液态样品中的内酰胺酶含量和活性。适合于食品分析 中尤其是乳制品、饮料等中的内酰胺酶的快速检测，并具有检测价格低、操作简便、无 需对样品进行预处理和很高的灵敏度和精度。—种乳品中β -内酰胺酶的快速检测方法，其步骤如下B.将磷酸二氢钠(NaH2PO4) 2_6g，磷酸氢二钠(Na2HPO4) 17_24g (购于 sigma 公司) 混合，然后去离子水定容至IOOOmL得到50-200mM磷酸盐溶液，pH为7-7. 4。C.用配制好的IOOmM磷酸盐溶液配置浓度为1000U/mL的青霉素酶原液(青霉素 原液为青霉素酶与IOOmM磷酸盐溶液的混合液)。青霉素酶PeniciIlinase (360U/mg)购于 sigma公司。再用IOOmM浓度磷酸盐溶液稀释浓度1000U/mL青霉素酶原液，得到青霉素酶 浓度为10U/mL的青霉素酶原液。继续用IOOmM磷酸盐溶液，按相同方法梯度稀释，制备青 霉素酶浓度为5U/mL，2U/mL，lU/mL，0. 5U/mL，0. 25U/mL的青霉素酶标准液。
D.用经梯度稀释的青霉素酶标准液(10U/mL，5U/mL，2U/mL，lU/mL，0. 5U/mL，0U/ mL)与牛奶(脂肪含量0. 5-3. 3% )混合(体积比1 1)，得到青霉素酶浓度分别为5U/mL， 2U/mL, lU/mL,0. 5U/mL,0. 25U/mL 以及 0U/mL(空白对照)的牛奶样品。Ε.用磷酸盐溶液配制底物，浓度为IOOmM的青霉素溶液(青霉素Penicillin G购 于sigma公司)，稀释到所需的底物浓度ImM。F.装配，调节仪器(采用欧米克生物科技(武汉)有限公司生产的酶热生物分析 仪Enzyme Thermistor)将蠕动泵校准为所需的流速(0. 25-1. OmL/min)，接入进样阀(样 品量为100-500 μ L)，并将仪器信号放大旋钮调至50-200 (信号放大50-200倍)，然后将安 培表指针调至中央0点位置。最后将记录仪(或市场购买的通用色谱工作站)连接信号输 出端，记录检测的电压信号。G.待基线稳定后，向进样阀中分别注射含青霉素酶浓度分别为5U/mL，2U/mL，IU/ mL,0. 5U/mL,0. 25U/mL以及OU/mL的牛奶样品。然后将进样阀由“加样”端转切至“进样” 端。检测一个样品需时5 10分钟。当一个样品的反应峰回落至基线时，将进样阀调回至 “加样”端，注射下一个样品。H.在检测青霉素酶浓度为OU/mL的牛奶样品时，由于混合热和牛奶粘稠度的关 系，会出现微小的非信号峰值。在在处理检测含有青霉素酶牛奶样品的数据时，需要用其被 测样品的峰值减去空白样品的峰值，从而得到校正数据，校正数据为所要求得的数据。校正 数据依检测样品的浓度呈线性比例关系。I.检测结束之后，泵入70 75%浓度酒精溶液，清洗仪器及样品环(约30分钟)。一种乳品中β -内酰胺酶的快速检测方法，它包括以下步骤本发明所涵盖检测和分析的范围和分析对象包括Α、所有乳制品中的β -内酰胺酶。此处所有乳制品定义为包括原料乳和成品乳， 液态乳和固态乳，百分之百成分乳或部分含乳成分制成品，中国或外国乳产品；B、本发明可扩展至其它非含乳成分的液态食品、饮料、药品、化妆品、化学制剂、发 酵制剂、废水等；C、β _内酰胺酶的检测定义为β -内酰胺酶的活性、含量、定性分析或定量分析、 连续分析或非连续分析、制动分析或手动分析、直接分析或间接分析、预处理或未经处理的 样品分析等。本发明的检测和分析方法包括D、基于生物酶催化其底物(待测分析物)所产生热焓变化的原理；Ε、测量由该热焓变化所产生的反应系统的温度变化为检测信号。该温度信号可以 差分或非差分方式测定；F、流动注射进样分析与酶热生物分析相结合；G、含β _内酰胺酶的待测样品(如奶液)与含其底物(如青霉素)的缓冲液(详 见如下)分别在两个独立的流动腔进入反应系统，在反应器混合后产生催化反应；H、该酶-底物催化反应可包含单一酶对单一底物的催化、单一酶同时对多底物 的催化、多酶对单一底物的催化、多酶同时对多底物的催化等。本发明的β -内酰胺酶分析仪的权利包括I、双通道流动控制系统及其混合器、反应器和检测器；
J、检测传感器为温度传感器，包括热敏电阻、热电偶、热电堆、感温晶体管等；K、酶热分析电极包括流动系统，反应柱和温度传感器。反应器为可置换和不可置 换两种，以及可填充和非填充两种方式；L、测量体系可为单测量酶热电极和多测量酶热电极方式；M、测量体系可为全自动型或手动型，集成或非集成流动控制，信号报警或非报警 系统；N、电子测量为惠斯通电桥，差分温度测量方式。其检测灵敏度可达10_5°C。检测方法与步骤0、两独立的流动腔通过一个蠕动泵同时将磷酸盐缓冲液(如0. 1Μ，ρΗ7. 0-7. 4)和 含青霉素(如ImM Penicillin G)的相同缓冲液以如，0. 5mL/分钟的流速分别注入到酶热 生物分析仪(ENZYME THERMISTOR INSTRUMENT)的输入端，且在该分析仪的反应器中进行混 合并经过热敏传感器流出输出端；P、待测样品(如含β -内酰胺酶奶液)通过样品进样阀将如，350 μ L样品量混入 仅含磷酸盐缓冲液的流动腔，并与其含青霉素的磷酸盐缓冲液在反应器混合，其催化反应 产生的热量通过温度传感器测量。与现有技术相比，本发明具有如下优点直接对乳品中的β -内酰胺酶进行分析；方法简单、仪器操作方便。待测奶样品无 需特殊预处理，可直接进样分析；测量快速(约5分钟/每样品)；检测成本低(约几元人 民币/每样品)；灵敏度高(低于0.5U酶活性/mL奶样品，或低于2ppm酶含量)；奶样品适 合原料奶、奶制品和其他液态食品中的内酰胺酶的检测，也可用于其它酶的检测或酶 底物的分析。
图1为记录仪所示测试样品信号峰值记录图。图中显示的是使用酶热生物分析仪(Enzyme Thermistor)分别检测牛奶中活性为 0U/mL、0. 25U/mL、0. 5U/mL、l. 0U/mL、2. OU/mL 及 5. OU/mL 的 β -内酰胺酶样品检测响应。每 种样品重复检验两次。通过这个检测，可以得知该方法检测方法速度快，检测稳定且精度高
具体实施例方式实施例1 一种乳品中β -内酰胺酶的快速检测方法，其步骤是一 .材料准备磷酸氢二钠(Na2HPO4)(购买自sigma)，磷酸二氢钠(NaH2PO4)(购买自sigma)， 青霉素酶(Penicillinase from bacillus cereus, 360U/mg 购买自 sigma),青霉素 (Penicillin G potassium salt，购买自 sigma)，牛奶(脂肪含量 3% )，4°C冰箱储藏。二.配置样品1.配制 IOOmM 磷酸盐溶液(pH = 7. 4)称量 NaH2PO4 2 6g，Na2HPO4 17_24g，用 去离子水定容至IOOOmL ；2.用配制好的IOOmM磷酸盐溶液配置浓度为1000U/mL的青霉素酶原液(青霉素 原液为青霉素酶与IOOmM磷酸盐溶液的混合液)。4°C冰箱储存。(注意，酶溶液易失活，冻 干品2 8°C可稳定一周。)；
3.再用IOOmM浓度磷酸盐溶液稀释浓度1000U/mL青霉素酶原液，得到青霉素酶浓 度为10U/mL的青霉素酶原液；4.继续用IOOmM磷酸盐溶液，按相同方法梯度稀释，制备青霉素酶浓度为5U/mL， 2U/mL, lU/mL，0. 5U/mL，0. 25U/mL 的青霉素酶原液；5.用青霉素酶原液浓度分别为 10U/mL、5U/mL、2U/mL、lU/mL、0. 5U/mL、0U/mL 与牛 奶(脂肪含量3% )混合(体积比1 1)，得到青霉素酶浓度分别为5U/mL，2U/mL，lU/mL, 0. 5U/mL,0. 25U/mL以及OU/mL(空白对照)的牛奶样品。6.用磷酸盐溶液配制底物，浓度为IOOmM的青霉素溶液(青霉素Penicillin G potassium salt，购买自sigma)，稀释到所需的底物浓度为ImM。7.用浓度为IOOmM的青霉素溶液与IOOmM磷酸盐溶液梯度稀释为浓度10mM，5mM, ImM的青霉素溶液。三.操作步骤一种乳品中β -内酰胺酶的快速检测方法，其步骤是1.装配仪器(欧米克生物科技公司生产的酶热生物分析仪Enzyme Thermistor)， 将蠕动泵校准为0. 5mL/min。2.安装350 μ L样品环(样品环为市场通用非亲水透明塑料管制成)。3.将仪器信号放大旋钮调至100 (信号放大100倍)，然后将安培表指针调至中央 0点位置。4.将记录仪(市场购买通用型记录仪)电压调至1伏，记录纸滚动速度IOcm/ hour ο5.待基线稳定后，向进样阀中分别注射青霉素酶浓度分别为5U/mL，2U/mL，lU/ mL,0. 5U/mL,0. 25U/mL以及OU/mL的牛奶样品。然后，将进样阀由“加样”档调至“进样”档。 检测一个样品需时5 10分钟。当一个样品的响应峰回落至基线时，将进样阀调回“进样” 档，注射下一个样品。6.在检测青霉素酶浓度为OU/mL的牛奶样品时，由于混合热和牛奶粘稠度的关 系，会出现非信号峰值。在处理检测含有青霉素酶牛奶样品的数据时，需要用含有青霉素酶 的牛奶样品的峰值减去青霉素酶浓度为OU/mL的牛奶样品峰值，从而得到校正数据，校正 数据为所要求得的数据。校正数据依检测样品的浓度呈线性比例关系。7.检测结束之后，泵入70 75%浓度酒精溶液，达到清洗仪器及样品阀的目的。下表1中是测试的数值(每样品检测二次)，通过测试可以得出结论该方法可以 较为准确的检测出样品中的青霉素酶的活性。
权利要求
一种乳品中β 内酰胺酶的快检测方法，其步骤是A、将磷酸二氢钠2 6g、磷酸氢二钠17 24g混合，然后去离子水定容至1000mL得到100mM磷酸盐溶液，pH为7 8.6；B、用配制好的100mM磷酸盐溶液配置浓度为1000U/mL的青霉素酶原液，再用100mM浓度磷酸盐溶液稀释浓度1000U/mL青霉素酶原液，得到青霉素酶浓度为10U/mL的青霉素酶原液，继续用100mM磷酸盐溶液，按相同方法梯度稀释，制备青霉素酶浓度为5U/mL，2U/mL，1U/mL，0.5U/mL，0.25U/mL的青霉素酶原液；C、经梯度稀释的青霉素酶原液为10U/mL，5U/mL，2U/mL，1U/mL，0.5U/mL，0U/mL与牛奶混合，得到青霉素酶浓度分别为5U/mL，2U/mL，1U/mL，0.5U/mL，0.25U/mL以及0U/mL的牛奶样品；D、用磷酸盐溶液配制底物，浓度为100mM的青霉素溶液，稀释到所需的底物浓度为1mM；E、将蠕动泵校准为所需的流速为0.5mL/min，安装样品环，并将仪器信号放大旋钮调至100倍，然后将安培表指针调至中央0点位置，最后将记录仪电压调至1伏，记录纸滚动速度10cm/hour；F、待基线稳定后，向注射阀中分别注射青霉素酶浓度分别为5U/mL，2U/mL，1U/mL，0.5U/mL，0.25U/mL以及0U/mL的牛奶样品，然后将注射阀由注射档调至上样档，检测样品5～7分钟，样品的峰回落至基线时，将注射阀调回注射档，注射下一个样品；G、在检测青霉素酶浓度为0U/mL的牛奶样品时，记录仪记录峰值信号，在处理检测含有青霉素酶牛奶样品的数据时，用峰值减去空白样品的峰值，得到校正数据；H、检测结束之后，泵入70～75％浓度酒精溶液，清洗仪器及样品环。
2.如权利要求1所述的一种乳品中内酰胺酶的快检测方法，所涵盖检测和分析的 范围和分析对象包括Α、所有乳制品中的内酰胺酶。此处所有乳制品定义为包括原料乳和成品乳，液态 乳和固态乳，百分之百成分乳或部分含乳成分制成品，中国或外国乳产品；B、本发明可扩展至其它非含乳成分的液态食品、饮料、药品、化妆品、化学制剂、发酵制 剂、废水等；C、β_内酰胺酶的检测定义为β -内酰胺酶的活性、含量、定性分析或定量分析、连续 分析或非连续分析、制动分析或手动分析、直接分析或间接分析、预处理或未经处理的样品 分析等。
3.如权利要求1所述的一种乳品中内酰胺酶的快检测方法，检测和分析方法包括Α、基于生物酶催化其底物(待测分析物)所产生热焓变化的原理；B、测量由该热焓变化所产生的反应系统的温度变化为检测信号。该温度信号可以差分 或非差分方式测定；C、流动注射进样分析与酶热生物分析相结合；D、含内酰胺酶的待测样品(如奶液)与含其底物(如青霉素)的缓冲液(详见如 下)分别在两个独立的流动腔进入反应系统，在反应器混合后产生催化反应；Ε、该酶-底物催化反应可包含单一酶对单一底物的催化、单一酶同时对多底物的催化、多酶对单一底物的催化、多酶同时对多底物的催化等。
4.如权利要求1所述的一种乳品中β-内酰胺酶的快检测方法，β -内酰胺酶分析仪 包括Α、双通道流动控制系统及其混合器、反应器和检测器；B、检测传感器为温度传感器，包括热敏电阻、热电偶、热电堆、感温晶体管等；C、酶热分析电极包括流动系统，反应柱和温度传感器。反应器为可置换和不可置换两 种，以及可填充和非填充两种方式；D、测量体系可为单测量酶热电极和多测量酶热电极方式；Ε、测量体系可为全自动型或手动型，集成或非集成流动控制，信号报警或非报警系统；F、电子测量为惠斯通电桥，差分温度测量方式。其检测灵敏度可达10_5°C。
5.如权利要求1所述的一种乳品中β-内酰胺酶的快检测方法，检测方法与步骤Α、两独立的流动腔通过一个蠕动泵同时将磷酸盐缓冲液(如0. 1Μ，ρΗ7. 0-7. 4)和含青 霉素(如ImM Penicillin G)的相同缓冲液以如，0. 5mL/分钟的流速分别注入到酶热生物 分析仪(ENZYME THERMISTOR INSTRUMENT)的输入端，且在该分析仪的反应器中进行混合并 经过热敏传感器流出输出端；B、待测样品(如含内酰胺酶奶液)通过样品进样阀将如，350 μ L样品量混入仅含 磷酸盐缓冲液的流动腔，并与其含青霉素的磷酸盐缓冲液在反应器混合，其催化反应产生 的热量通过温度传感器测量。
全文摘要
本发明公开了一种β-内酰胺酶的快速测定的方法。该方法将待测样品，如奶液中含有的β-内酰胺酶与其底物，如青霉素以两组独立的流动相在一反应器进行混合并进行催化反应，将其生物催化产生的热量转化成温度的变化，并通过测量其温度的相对变化来确定其待测物的成分、浓度或活性等。该β-内酰胺酶测定仪为酶热生物分析仪(Enzyme Thermistor)，能定量分析和定性分析液态样品中的β-内酰胺酶含量和活性。适合于食品分析中尤其是乳制品、饮料等中的β-内酰胺酶的快速检测(5分钟/样品)，并具有检测价格低(约几元人民币/样品)、操作简便、无需对样品进行预处理和很高的灵敏度和精度(可测量低于0.5活性单位/mL)。
文档编号G01N25/48GK101928748SQ20091006285
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者谢斌 申请人:谢斌