专利名称：用于生物分离和检测的磁性拉曼纳米复合材料的制备方法
技术领域：
本发明属于纳米材料和生物技术领域，特别涉及一种可用于生物分离和生物检测的磁性 拉曼纳米复合材料及其制备方法。
背景技术：
随着纳米科技的迅猛发展，把先进的纳米技术引入生物医药领域，运用具有特殊物理化 学性能的无机纳米材料作为生物标记物，实现对生物分子(蛋白质、DNA、抗体、多肽等) 高灵敏度的分析和检测巳成为国内外研究的热点。金、银等金属纳米材料、CdSe等半导体荧 光纳米晶已被广泛应用于生物标记、免疫分析和活体成像等诸多领域，并取得了阶段性的研 究进展。
然而，对低浓度标记分子进行高效、快速分离和提取仍然是这些体系面临的关键性技术 难题之一。磁性纳米材料由于具有超顺磁特性，在实现生物分子快速、实时、高通量分离和 检测等方面均体现出了明显的优势。如果将磁性纳米材料与其它纳米材料生物标记体系结合， 使其优势互补，必能同时解决标记分子的分离、纯化和检测等多方面问题。近年来，国内外 多个研究小组先后报道了利用磁性一金属纳米复合材料进行生物标记的工作，如Fe304/Au、 FePt/Au等体系。但是，由于这类纳米复合材料利用的主要金的光散射作用进行生物分析和检 测，Au与磁性纳米材料复合势必会对其光学性能产生影响，使检测灵敏度受到局限。还有一 些研究小组尝试将磁性纳米材料与半导体荧光纳米晶复合，制备集磁性分离特性和荧光检测 功能于一体的磁性荧光纳米生物探针，但是由于磁性纳米粒子和半导体荧光纳米晶之间存在 能量转移，导致半导体纳米晶的荧光被部分猝灭，无法获得较高的检测灵敏度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有纳米生物标记材料的缺陷，设计一种磁性拉曼纳 米复合材料的合成方法。使该方法具有操作简便，节约成本，重复性好等特点，得到的产物 磁性强、共振拉曼信号明显，能与生物样品偶联，可同时实现对生物样品的快速磁性分离和 高灵敏度的拉曼检测。本发明的磁性拉曼纳米复合材料的制备方法是1、将已知合成方法的磁性纳米粒子、锌
盐及碱的乙醇溶液按照1:1:1.4至1:60:120的摩尔比混合，加入到密闭反应釜中，在90-150。C 的溶剂热条件下，反应3-12小时，利用锌盐的水解反应，在磁性纳米粒子表面在位生长ZnO 基半导体纳米晶，2、然后利用磁性分离技术洗去自成核的ZnO基半导体纳米晶和杂质，获 得高纯度的磁性拉曼纳米复合材料。3、最后，利用纳米Au或Si02中对其进行表面修饰，4、 制得可用于生物分离和生物检测的磁性拉曼纳米复合材料。
所述的磁性纳米粒子可选用Fe或FePt或Fe304或Fe203或CoFe20或NiFe04或MnFe04 等；碱可以是氢氧化锂或氢氧化钠或氨水或四甲基氢氧化胺或六次甲基四胺等；ZnO基半导 体纳米晶可以是ZnO或ZnO基掺杂复合材料。
所述的利用纳米Au对磁性拉曼纳米复合材料进行表面修饰方法是，将磁性拉曼纳米材 料与氯金酸、柠檬酸钠按照1:1:9至300:1:9的摩尔比混合，室温剧烈搅拌条件下，反应5-72 小时，利用磁性分离技术进行纯化，得到纳米Au修饰的磁性拉曼纳米复合材料。
所述的利用Si02对磁性拉曼纳米复合材料进行表面修饰方法是，将磁性拉曼纳米复合材 料与0.1 M的硅烷试剂混合，室温、搅拌反应2-96小时，利用磁性分离技术进行纯化，得到 Si02修饰的磁性拉曼纳米复合材料。
所述的可用于生物分离和生物检测的的磁性拉曼纳米复合材料的制备方法是，在纳米Au 或SiO2修饰的磁性拉曼纳米复合材料体系中加入10nM的生物样品，在4'C条件下偶联，之 后进行生物样品的磁性分离或生物样品的拉曼。这里所说的生物样品包括蛋白质、氨基酸、 DNA、抗原、抗体、多肽等。
本发明可以实现磁性拉曼纳米复合材料的磁学性质、共振拉曼散射特征及表面性质的可 控。即，可以制备出不同种磁学性质、拉曼散射性质及表面性质的磁性拉曼纳米复合材料。 磁性强弱可通过选用不同种类或不同粒径的磁性材料实现，还可通过复合材料中磁性粒子的 含量来控制。拉曼散射性质主要包括拉曼散射位移和散射强度，可通过选用不同种类或不同 含量的半导体纳米晶实现。磁性拉曼纳米复合材料的表面性质可通过表面官能化(硅烷化或 表面沉积纳米金)来实现。
本发明的磁性拉曼纳米复合材料的制备方法简单，条件温和，成本低。所得的产物具有 稳定性好，磁性可调，共振拉曼信号明显，生物相容性好等特点。利用纳米复合材料的磁性 质，在普通商用永磁铁的作用下在30秒内即可实现被标记物的高效分离。制得的纳米复合材 料通过表面功能化，可对多种生物样品进行稳定、无损害的标记，利用其多声子共振拉曼指 纹特征可对未知生物样品进行高灵敏度的生物检测。
具体实施例方式
实施例l:磁性拉曼纳米复合材料的合成(1)
将利用化学共沉淀法制备的具有超顺磁性的Fe304纳米粒子乙醇溶液与醋酸锌、氢氧化 锂按照1:30:1.4的摩尔比混合，置于密闭的反应釜中，在120°C反应6小时，利用磁性分离 技术洗涤后，即得到Fe304/ZnO纳米复合材料，其尺寸约为120nm。
可将超顺磁性的Fe304纳米粒子替换成Fe、 FePt、 Fe203、 CoFe20、 NiFe04或MnFe04 等；可将醋酸锌替换成硝酸锌、氯化锌、硝酸镁、硝酸锰、氯化锰、醋酸钴、氯化钴、硝酸 钴中的1-2种；可将氢氧化锂替换成氢氧化钠、氨水、四甲基氢氧化胺或六次甲基四胺，得 到其它组分的磁性拉曼纳米复合材料。
实施例2:磁性拉曼纳米复合材料的合成(2)
将实施例1中的Fe304纳米粒子乙醇溶液与醋酸锌、氢氧化锂的摩尔比换成1:1 :1.4，反 应温度换成90。C，反应时间换成3小时，其余反应过程和条件不变，可得到尺寸约为23nm 的磁性拉曼纳米复合材料。
实施例3:磁性拉曼纳米复合材料的合成(3)
将实施例1中的Fe304纳米粒子乙醇溶液与醋酸锌、氢氧化锂的摩尔比换成1:60 :120， 反应温度换成150°C，反应时间换成12小时，其余反应过程和条件不变，可得到尺寸约为210 nm的磁性拉曼纳米复合材料。
实施例4:磁性拉曼纳米复合材料的表面金修饰(1)
将实施例1或2或3中的磁性拉曼纳米复合材料均匀分散在1mM柠檬酸钠的水溶液中， 在剧烈搅拌条件下，滴加l mM氯金酸水溶液，磁性拉曼纳米复合材料、氯金酸、柠檬酸钠 的摩尔比为1:150:9，室温反应48小时，利用磁性分离技术洗涤后，即得到Au修饰的磁性拉
曼纳米复合材料。
实施例5:磁性拉曼纳米复合材料的表面金修饰(2)
将实施例4中的磁性拉曼纳米复合材料、氯金酸、柠檬酸钠的摩尔比换为300:1:9，反应 时间换成5小时，其余反应过程和条件不变，得到相应的Au修饰的磁性拉曼纳米复合材料。。 实施例6:磁性拉曼纳米复合材料的表面金修饰(3)
将实施例4中的磁性拉曼纳米复合材料、氯金酸、柠檬酸钠的摩尔比换为1:1:9,反应时 间换成72小时，其余反应过程和条件不变，得到相应的Au修饰的磁性拉曼纳米复合材料。 实施例7:磁性拉曼纳米复合材料的表面Si02包覆(1)
将实施例1或2或3中的磁性拉曼纳米复合材料与0.1 M的Na2Si03溶液混合，用1 M 的HCl将溶液的pH值调为10.0，室温搅拌，反应2小时，利用磁性分离技术洗涤，得到Si02
5包覆的磁性拉曼纳米复合材料。
实施例8:磁性拉曼纳米复合材料的表面Si02包覆(2)
将实施例7中的反应时间换为24小时，其余反应过程和条件不变，可得到相应的Si02 包覆的磁性拉曼纳米复合材料。
实施例9:磁性拉曼纳米复合材料的表面Si02包覆(3)
将实施例7或8中的Si02包覆的磁性拉曼纳米复合材料分散于50ml无水乙醇、2ml水、 2.3ml25。/。氨水和25 pl正硅酸乙酯的混合液中，室温下搅拌反应3小时，利用磁性分离技术
提纯，得到Si02包覆的磁性拉曼纳米复合材料。
实施例10:磁性拉曼纳米复合材料的表面Si02包覆(4)
将实施例9中的正硅酸乙酯的体积换为250 pl，反应时间换为30小时，其余反应过程和 条件不变，可得到相应的Si02包覆的磁性拉曼纳米复合材料。 实施例ll:磁性拉曼纳米复合材料的表面Si02包覆(5)
在实施例9或10中的Si02包覆的磁性拉曼纳米复合材料溶液中加入20 ^的3-氨丙基三 乙氧基硅垸，40。C搅拌反应2小时，利用磁性分离技术提纯，得到3-氨丙基三乙氧基硅烷修
饰的Si02包覆的磁性拉曼纳米复合材料。
实施例12:磁性拉曼纳米复合材料的表面Si02包覆(6)
将实施例ll中的3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积换为200 ^d，反应时间换为42小时，其 余反应过程和条件不变，可得到相应的3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的Si02包覆的磁性拉曼纳 米复合材料。
实施例13:磁性拉曼纳米复合材料的生物偶联(1)
向实施例4或5或6制得的Au修饰的磁性拉曼纳米复合材料中加入10 nmol/ml的抗体， 4。C反应24小时，利用磁性分离技术提纯，得到相应的生物偶联产物。用常规方法可同时实 现对生物样品的快速磁性分离和高灵敏度的拉曼检测。
可将抗体替换成蛋白质、氨基酸、DNA、抗原或多肽，得到其它类型的生物偶联产物。
实施例14:磁性拉曼纳米复合材料的生物偶联(2)
向实施例7或8或9或10制得的Si02包覆的磁性拉曼纳米复合材料中加入DNA，反应 10分钟，利用磁性分离技术提纯，得到相应的生物偶联产物。用常规方法可同时实现对生物 样品的快速磁性分离和高灵敏度的拉曼检测。
实施例15:磁性拉曼纳米复合材料的生物偶联(3)
向实施例11或12制得的3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的Si02包覆的磁性拉曼纳米复合材 料中加入戊二醛，反应24小时后，加入0.5mol/LNaBH4，反应3小时。然后加入10 nmol/ml的抗体，4'C反应24小时后，加入0.5mol/LNaBH4，反应3小时。最后利用磁性分离技术提 纯，得到相应的生物偶联产物。用常规方法可同时实现对生物样品的快速磁性分离和高灵敏 度的拉曼检测。
可将抗体替换成蛋白质、氨基酸、抗原或多肽，得到其它类型的生物偶联产物。
权利要求
1、用于生物分离和检测的磁性拉曼纳米复合材料的制备方法、其特征在于(1)、将已知合成方法的磁性纳米粒子、锌盐及碱的乙醇溶液按照1∶1∶1.4至1∶60∶120的摩尔比混合，加入到密闭反应釜中，在90-150℃的溶剂热条件下，反应3-12小时，利用锌盐的水解反应，在磁性纳米粒子表面在位生长ZnO基半导体纳米晶；(2)、然后利用磁性分离技术洗去自成核的ZnO基半导体纳米晶和杂质，获得高纯度的磁性拉曼纳米复合材料；(3)、最后，利用纳米Au或SiO2中对其进行表面修饰将磁性拉曼纳米材料与氯金酸、柠檬酸钠按照1∶1∶9至300∶1∶9的摩尔比混合，室温剧烈搅拌条件下，反应5-72小时，利用磁性分离技术进行纯化，得到纳米Au修饰的磁性拉曼纳米复合材料；将磁性拉曼纳米复合材料与0.1M的硅烷试剂混合，室温、搅拌反应2-96小时，利用磁性分离技术进行纯化，得到SiO2修饰的磁性拉曼纳米复合材料；(4)、制得可用于生物分离和生物检测的磁性拉曼纳米复合材料在纳米Au或SiO2修饰的磁性拉曼纳米复合材料体系中加入10nM的生物样品，在4℃条件下偶联，之后能够进行生物样品的磁性分离或生物样品的拉曼。
2、 按照权利要求1的用于生物分离和检测的磁性拉曼纳米复合材料的制备方法、其特征 在于所述的磁性纳米粒子选用Fe或FePt或Fe304或Fe203或CoFe20或NiFe04或MnFe04;
3、 按照权利要求l的用于生物分离和检测的磁性拉曼纳米复合材料的制备方法、其特征 在于所述的碱是氢氧化锂或氢氧化钠或氨水或四甲基氢氧化胺或六次甲基四胺。
4、 按照权利要求1的用于生物分离和检测的磁性拉曼纳米复合材料的制备方法、其特征 在于所述的ZnO基半导体纳米晶可以是ZnO或ZnO基掺杂复合材料。
5、 按照权利要求1的用于生物分离和检测的磁性拉曼纳米复合材料的制备方法、其特征 在于所述的生物样品为蛋白质、氨基酸、DNA、抗原、抗体、多肽。
6、 按照权利要求1的用于生物分离和检测的磁性拉曼纳米复合材料的制备方法制备的磁 性拉曼纳米复合材料。
7、 按照权利要求1的用于生物分离和检测的磁性拉曼纳米复合材料的制备方法制备的磁 性拉曼纳米复合材料在生物检测和分离中的应用。
全文摘要
本发明属于纳米材料制备技术和纳米生物应用领域，涉及一种磁性拉曼纳米复合材料的制备及其在生物分离和免疫检测方面的应用。将磁性纳米粒子、锌盐和碱源溶于无水乙醇中，采用溶剂热的方法制备磁性拉曼纳米复合材料，通过表面修饰技术，实现与生物样品的偶联。本发明方法操作简便，节约成本；可实现磁性拉曼纳米复合材料的磁学性质、共振拉曼散射特征及表面性质的可控；可用于生物样品的分离和检测等领域。
文档编号G01N33/48GK101482554SQ20091006649
公开日2009年7月15日 申请日期2009年1月22日 优先权日2009年1月22日
发明者刘益春, 霞 洪, 鹏 邹 申请人:东北师范大学