专利名称：用于连续检测样本中葡萄糖浓度的方法、试剂盒和使用生物传感器的方法
技术领域：
本发明涉及一种葡萄糖检测方法，且特别是关于一种连续检测待测样本的葡萄糖 浓度的方法。
背景技术：
目前血糖检测大多以酶反应为主，然而酶的使用在连续检测上稳定性不佳。有 鉴于此，利用葡萄糖接受蛋白或其它专一性受体(例如螯合物)检测葡萄糖的方法也陆 续被开发出来，以解决酶活性不易维持的问题。其中，已有研究证实利用多糖-凝集素 (polysaccharide-lectin)系统对葡萄糖进行检测的可行性。目前多糖-凝集素检测系 统是用葡萄糖、多糖类、以及凝集素三者间的竞争(competition)与凝集(aggregation) 特性作为检测手段，特别是结合荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)效应的检测方式。然而，有研究指出随着凝集程度与时间的增加，会造成 检测时逆向(reversible)反应时的难度提升并增加花费时间，进而影响检测准确度，因此 传统的多糖_凝集素系统并不适用于长时间连续检测上。
发明内容
本发明提供一种连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法，包括(a)提供生物传感 器，其中该生物传感器包括转换器与覆盖于该转换器的表面上的多糖(polysaccharide)； (b)提供特定浓度的糖类结合蛋白溶液，其中该糖类结合蛋白具有至少一受体，且该受体具 有与该多糖及葡萄糖结合的能力；(c)将待测样本与该特定浓度的糖类结合蛋白溶液混合 成混合物；(d)将该混合物与生物传感器接触；(e)以该生物传感器检测与该多糖结合的糖 类结合蛋白的量，其中该待测样本的葡萄糖浓度与该多糖结合的糖类结合蛋白的量成反比 关系；以及(f)以一高浓度葡萄糖溶液恢复该生物传感器的表面。本发明也提供一种试剂盒，其用于前述的连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方 法，包括生物传感器，其中该生物传感器包括转换器与覆盖于该转换器的表面上的多糖； 反应液，用以与该待测样本反应，其包括该特定浓度的糖类结合蛋白溶液；以及清洗液，用 以恢复该生物传感器的表面，其包括高浓度葡萄糖溶液。本发明还提供一种使用生物传感器的方法，包括(a)提供生物传感器，其中该生 物传感器包括转换器与覆盖于该转换器的表面上的多糖；(b)将包括特定浓度的糖类结合 蛋白溶液的反应液及待测样本的混合物与该生物传感器接触，其中该糖类结合蛋白具有 与该多糖及葡萄糖结合的能力；(c)以该生物传感器检测与该多糖结合的糖类结合蛋白的 量，以获得该待测样本的葡萄糖浓度；以及(d)以清洗液恢复该生物传感器的表面，其中该 清洗液包括高浓度葡萄糖溶液。为了让本发明的上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施 例，并配合所附图示，作详细说明如下
图式简单说明第1A-1C图显示本发明连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法的示意图。第2图显示本发明实施例中所使用的流体装置的示意图。第3图显示修饰有葡聚糖的石英晶体微天平进行伴刀豆球蛋白A-葡萄糖复合物 实时连续测量的频率变化情形。第4图显示不同浓度葡萄糖与伴刀豆球蛋白A混合后造成石英晶体微天平频率变 化的测量曲线。主要组件符号说明100 生物传感器(transducer)101 转换器103 多糖105 结合蛋白溶液107 糖类结合蛋白107a 全部受体为葡萄糖所占据的糖类结合蛋白107b 部分受体为葡萄糖所占据的糖类结合蛋白107c 未受葡萄糖占据的糖类结合蛋白109 待测样本111 葡萄糖113 混合物115 高浓度葡萄糖溶液200 流体装置201 注入样本203 移动相205 流体反应槽205-1 生物传感器207 振荡电路209 计频器211 电源供应器213 计算机215 泵217 废液
具体实施例方式本发明为利用糖类结合蛋白可与葡萄糖或多糖相互结合的特性与其对葡萄糖与 多糖的亲和力(affinity)差异，并结合生物感测技术来检测样本中的葡萄糖浓度。此方 式可以解决以往利用竞争特性作为连续检测手段时，随着糖类结合蛋白与多糖聚集时间增 长，而造成于葡萄糖检测时无法轻易逆向的问题。
在本发明一实施方式中，提供连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法。第1A-1C 图显示本发明连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法的示意图。参见第IA图，首先提供 生物传感器100，而生物传感器100可包括转换器101与覆盖于转换器101的表面上的 多糖103。转换器101可包括重量、光学、电学、电化学或声学传感器等。在一实施例中， 转换器101可包括石英晶体微天平(quartzcrystal microbalance, QCM)、表面等离子共 振转换器(surfaceplasmon resonance transducer, SPR transducer)或表面声波组件 (surface acoustic wave element, SAW element)。多糖 103 可包括葡聚糖(dextran)或 糊精(dextrin)。参见第IB图。接着，提供具有特定浓度的糖类结合蛋白溶液105，其中糖类结合蛋 白107具有至少一受体，且受体具有与多糖及葡萄糖结合的能力。根据检测情况，可视需要 来调整糖类结合蛋白溶液的特定浓度。在一实施例中，糖类结合蛋白溶液的特定浓度为约 0.12-0.24%。又糖类结合蛋白107的受体对于葡萄糖的亲和力大于对多糖的亲和力。糖 类结合蛋白107可包括凝集素，例如伴刀豆球蛋白Akoncanavaline A, Con A)、麦芽凝集 素、花生凝集素或大豆凝集素等。此外，混合一待测样本109与上述具有特定浓度的糖类结合蛋白溶液105以形成 一混合物113。在混合过程中，待测样本中的葡萄糖111会与糖类结合蛋白107的受体结 合，而使该混合物113具有全部受体为葡萄糖所占据的糖类结合蛋白107a、部分受体为葡 萄糖所占据的糖类结合蛋白107b与未受葡萄糖占据的糖类结合蛋白107c。然后，将上述混合物113与生物传感器100进行接触，而于混合物中113中的部分 受体为葡萄糖所占据的糖类结合蛋白107b及未受葡萄糖占据的糖类结合蛋白107c会与生 物传感器100的多糖103结合。在一优选实施例中，可进一步利用一流体装置，而使上述接 触步骤为在流体通道中进行。又部分受体为葡萄糖所占据的糖类结合蛋白107b与未受葡 萄糖占据的糖类结合蛋白107c与多糖103结合时会产生物理或化学变化。在一实施例中， 物理或化学变化包括重量变化。又糖类结合蛋白107可进一步包含偶联物(conjugate)，用 以作为物理或化学变化的来源或用以增强该物理或化学变化。偶联物可包括荧光染剂、酶、 电活性物质或纳米粒子等具可检测性的物质。之后，生物传感器100会检测与生物传感器100的多糖103结合的糖类结合蛋白 的量，且藉此获得待测样本的葡萄糖浓度。其中待测样本的葡萄糖浓度与生物传感器100 的多糖103结合的糖类结合蛋白的量成反比关系。在一实施例中，生物传感器100藉由转 换器101来测定上述的物理或化学变化以检测与多糖结合的糖类结合蛋白的量。参见第IC图。最后，以高浓度葡萄糖溶液115清洗生物传感器100的表面。由于 糖类结合蛋白107的受体对于葡萄糖的亲和力大于对多糖的亲和力且所加入的葡萄糖溶 液为高浓度，所以葡萄糖会取代已与糖类结合蛋白受体结合的多糖，而与糖类结合蛋白结 合。因此高浓度葡萄糖溶液恢复生物传感器100的表面，使生物传感器可重复使用，而可重 复进行上述的步骤，以达成连续检测待测样本中葡萄糖浓度。高浓度葡萄糖溶液115的浓 度可大于约200mg/dl，在一实施例中，则可为约400-2000mg/dl。此外，本发明也提供试剂盒，其可用于上述的本发明连续检测待测样本中葡萄糖 浓度的方法。试剂盒可包括上述的生物传感器100、反应液以及清洗液。生物传感器100可 包括转换器101与覆盖于转换器101的表面上的多糖103。转换器101可包括重量、光学、
6电学、电化学或声学传感器等。在一实施例中，转换器101可包括石英晶体微天平、表面等 离子共振转换器或表面声波组件。多糖103可包括葡聚糖或糊精。反应液用以与待测样本反应，其可包括上述具有特定浓度的糖类结合蛋白溶液 105。其中糖类结合蛋白107至少具有一受体，且受体具有与多糖及葡萄糖结合的能力。根 据检测情况，可视需要来调整糖类结合蛋白溶液的特定浓度。在一实施例中，糖类结合蛋白 溶液的特定浓度为约0. 12-0. 24%。又糖类结合蛋白107的受体对于葡萄糖的亲和力大于 对多糖的亲和力。糖类结合蛋白107可包括凝集素，例如伴刀豆球蛋白A(Con Α)、麦芽凝集 素、花生凝集素或大豆凝集素等。清洗液用以恢复生物传感器100的表面，其包括上述高浓度葡萄糖溶液115。由于 糖类结合蛋白107的受体对于葡萄糖的亲和力大于对多糖的亲和力且所加入的葡萄糖溶 液为高浓度，所以葡萄糖会取代已与糖类结合蛋白受体结合的多糖，而与糖类结合蛋白结 合。因此高浓度葡萄糖溶液恢复生物传感器100的表面，使生物传感器可重复使用，而可重 复进行上述的步骤，以达成连续检测待测样本中葡萄糖浓度。高浓度葡萄糖溶液115的浓 度可大于约200mg/dl，在一实施例中，则可为约400-2000mg/dl。更进一步而言，藉由使用本发明试剂盒结合本发明连续检测待测样本中葡萄糖浓 度的方法，可以获得连续检测待测样本中葡萄糖浓度的系统。另外，本发明也可为使用生物传感器的方法。同样参见第1A-1C图。于第IA图中， 首先提供生物传感器100，而生物传感器100可包括转换器101与覆盖于转换器101的表面 上的多糖103。转换器101可包括重量、光学、电学、电化学或声学传感器等。在一实施例 中，转换器101可包括石英晶体微天平、表面等离子共振转换器或表面声波组件。多糖103 可包括葡聚糖或糊精。接着，在第IB图中，将包括特定浓度的糖类结合蛋白溶液105的反应液及待测样 本109的混合物113与生物传感器100接触。糖类结合蛋白107具有与多糖及葡萄糖结合 的能力。根据检测情况，可视需要来调整糖类结合蛋白溶液的特定浓度。在一实施例中，糖 类结合蛋白溶液的特定浓度为约0. 12-0. 24%。在混合物113中，待测样本中的葡萄糖会与 糖类结合蛋白结合。糖类结合蛋白107的受体对于葡萄糖的亲和力大于对多糖的亲和力。 糖类结合蛋白107可包括凝集素，例如伴刀豆球蛋白A(Con Α)、麦芽凝集素、花生凝集素或 大豆凝集素等。在混合物113与生物传感器100接触后，部分受体为葡萄糖所占据的糖类结合蛋 白107b及未受葡萄糖占据的糖类结合蛋白107c会与生物传感器100的多糖103结合。部 分受体为葡萄糖所占据的糖类结合蛋白107b与未受葡萄糖占据的糖类结合蛋白107c与多 糖103结合时会产生物理或化学变化。在一实施例中，物理或化学变化包括重量变化，而上 述糖类结合蛋白可进一步包含偶联物，用以作为物理或化学变化的来源或用以增强该物理 或化学变化。偶联物可包括荧光染剂、酶、电活性物质或纳米粒子等具可检测性的物质。然后，生物传感器100会检测与生物传感器100的多糖103结合的糖类结合蛋白 的量，以获得待测样本109的葡萄糖浓度。在一实施例中，生物传感器100藉由转换器101 来测定上述的物理或化学变化以检测与多糖结合的糖类结合蛋白的量。最后参见第IC图。将生物传感器100的表面以清洗液恢复，其中清洗液包括高浓 度葡萄糖溶液115。由于糖类结合蛋白107的受体对于葡萄糖的亲和力大于对多糖的亲和力，又所加入清洗液含有的葡萄糖溶液为高浓度，所以葡萄糖会取代与糖类结合蛋白的受 体结合的多糖，而与糖类结合蛋白结合。因此清洗液可恢复生物传感器100的表面，使生物 传感器可重复使用，而可重复进行上述的步骤，而达成连续检测待测样本中葡萄糖浓度。高 浓度葡萄糖溶液115的浓度可大于约200mg/dl，在一实施例中，则可为约400_2000mg/dl。实施例本实施例中利用以葡聚糖修饰(覆盖)的石英晶体微天平做为生物传感器，并配 以流体装置200 (如第2图所示)，将具有0. 12-0. 24 %伴刀豆球蛋白A及不同浓度葡萄糖溶 液的混合物，藉由本发明的检测方法，达成动态测量葡萄糖的目的。流体装置200包括注入 样本 201、移动相 203、流体反应槽(flow cell) 205、振荡电路(oscillating circuit) 207、 计频器(frequency counter) 209、电源供应器211、计算机213、泵215与废液217。移动 相203主要提供流体通道与流体反应槽205 —液相环境，并负责将注入样本201携带至置 于流体反应槽205中的生物传感器205-1的表面以进行反应，其中注入样本201与移动相 203间的切换可由一流体切换开关控制，以避免气泡于流体通道中形成。而流体通道内液体 的流动则由泵215带动的。在讯号量取部分，主要将生物传感器205-1电性连接至振荡电 路207，此时将可使石英晶体微天平稳定振荡于特定基频(本实施例采用的传感器所提供 的基频为IOMHz)，并可由计频器209纪录其频率值；根据石英晶体微天平的质量加载效应 (mass-loading effect)，糖类结合蛋白与多糖结合时所产生的微小物理或化学变化，将可 反应于振荡频率的变化量上，并由计频器209实时纪录其变化量。最后，再将讯号传输到计 算机213显示输出，实时并连续监控频率变化情形。多糖修饰(覆盖)转换器的方法以葡聚糖修饰石英晶体微天平表面的方法如下(1)首先，将带有酸基的硫醇类有机化合物(0. 5mM, 16-Mercaptohexadecanoic acid)与石英晶体微天平上的金电极反应，使石英晶体微天平表面带酸基；(2)以50mM EDC/200mM NHS活化酸基后，再与带醇基的一级胺类有机化合物 (2%, 2- (2-aminoethoxy) ethanol)反应，使石英晶体微天平表面带醇基；(3)再用环氧氯丙烷(0.6M，epicholorohydrin)与醇基反应，使石英晶体微天平 表面带环氧基；(4)最后将5%分子量400KD-40MD的葡聚糖与环氧基反应，便可以用共价键结的 方式将葡聚糖修饰石英晶体微天平表面。连续检测方法首先，将0. 24%伴刀豆球蛋白A与等体积待测物葡萄糖混合，并注入流体通道内， 并透过移动相将样本带至位于流体反应槽205内修饰有葡聚糖的石英晶体微天平，此时， 没有被葡萄糖占据到的伴刀豆球蛋白A上的受体，将与石英晶体微天平上的葡聚糖结合， 因伴刀豆球蛋白A与葡聚糖结合后重量增加，会改变石英晶体微天平的振荡频率，最后以 计频器测量频率的变化，即可对应出葡萄糖的浓度，因此葡萄糖浓度越低，所测得的讯号越 大。且于反应流程结束后，再将高浓度葡萄糖(1200mg/dl)注入流体通道，可使伴刀豆球蛋 白A-葡聚糖复合物的伴刀豆球蛋白A脱附，即可重复进行伴刀豆球蛋白A-葡萄糖复合物 的测量(参见第IA-C图)。伴刀豆球蛋白A-葡萄糖复合物测量
第3图显示修饰有葡聚糖的石英晶体微天平进行伴刀豆球蛋白A-葡萄糖复合物 测量的原始数据。其中，加入伴刀豆球蛋白A或伴刀豆球蛋白A-葡萄糖复合物后，因伴刀豆 球蛋白A与葡聚糖(分子量5-40MD)结合后重量增加，会使石英晶体微天平振荡频率下降； 再加入高浓度葡萄糖(1200mg/dl)后，因葡萄糖-伴刀豆球蛋白A的亲和力比伴刀豆球蛋 白A-葡聚糖强，葡聚糖会被取代下来，使重量减少，会使石英晶体微天平振荡频率上升。第 3图中前两个波峰(peak)为0. 12%纯伴刀豆球蛋白A的反应，之后六个波峰依序为等体积 葡萄糖浓度200、400、600、800、1000及1200mg/dl与0. 24%伴刀豆球蛋白A混合溶液(最 后浓度葡萄糖依序为100、200、300、400、500及600mg/dl，伴刀豆球蛋白A固定为0. 12%). 第3图中，波峰频率下降区段为伴刀豆球蛋白A与石英晶体微天平上葡聚糖结合后所产生 重量增加的变化；波峰上升区段为，注入高浓度葡萄糖后石英晶体微天平上伴刀豆球蛋白 A-葡聚糖复合物中的伴刀豆球蛋白A脱附所产生重量下降的变化。检量特性将不同浓度葡萄糖与伴刀豆球蛋白A混合后造成石英晶体微天平频率变化的检 量曲线如第4图所示。随待测样本中葡萄糖浓度的升高，其讯号变化量逐渐下降。虽然本发明已以优选实施例公开如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技 艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作一些的变动与润饰，因此本发明的保护范围 当视后附的申请专利权利要求书的范围所界定者为准。
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权利要求
一种连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法，包括(a)提供生物传感器，其中该生物传感器包括转换器与覆盖于该转换器的表面上的多糖；(b)提供特定浓度的糖类结合蛋白溶液，其中该糖类结合蛋白至少具有一受体，且该受体具有与该多糖及葡萄糖结合的能力；(c)将待测样本与该特定浓度的糖类结合蛋白溶液混合成混合物；(d)将该混合物与该生物传感器接触；(e)以该生物传感器检测与该多糖结合的糖类结合蛋白的量，其中该待测样本的葡萄糖浓度与多糖结合的糖类结合蛋白的量成反比关系；以及(f)以高浓度葡萄糖溶液恢复该生物传感器的表面。
2.权利要求1中所述的连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法，还包括在步骤(f)后 的步骤(g)重复步骤(b)至⑴。
3.权利要求1中所述的连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法，其中于步骤(c)中，在 该混合物中的部分受体为葡萄糖所占据的糖类结合蛋白及未受葡萄糖占据的糖类结合蛋 白与多糖结合时产生物理或化学变化。
4.权利要求3中所述的连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法，该物理或化学变化是 通过该转换器测定以检测与多糖结合的糖类结合蛋白的量。
5.权利要求3中所述的连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法，其中该物理或化学变 化为重量变化。
6.权利要求3中所述的连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法，其中该糖类结合蛋白 包含偶联物用以作为该物理或化学变化的来源或用以增强该物理或化学变化。
7.权利要求1中所述的连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法，其中该转换器包括重 量、光学、电学、电化学或声学传感器。
8.权利要求1中所述的连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法，其中该转换器包括石 英晶体微天平、表面等离子共振转换器或表面声波组件。
9.权利要求1中所述的连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法，其中该多糖包括葡聚 糖或糊精。
10.权利要求1中所述的连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法，其中该糖类结合蛋 白包括凝集素。
11.权利要求1中所述的连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法，其中该糖类结合蛋 白包括伴刀豆球蛋白A、麦芽凝集素、花生凝集素或大豆凝集素。
12.权利要求1中所述的连续检测待测样本中葡萄糖浓度的方法，其中该高浓度葡萄 糖溶液的浓度为约400-2000mg/dl。
13.—种检测待测样本中葡萄糖浓度的试剂盒，包括生物传感器，其中该生物传感器包括转换器与覆盖于该转换器的表面上的多糖；反应液，用以与该待测样本反应，其包括该特定浓度的糖类结合蛋白溶液；以及清洗液，用以恢复该生物传感器的表面，其包括该高浓度葡萄糖溶液。
14.权利要求13中所述的试剂盒，其中该转换器包括重量、光学、电学、电化学或声学 传感器。
15.权利要求13中所述的试剂盒，其中该转换器包括石英晶体微天平、表面等离子共 振转换器或表面声波组件。
16.权利要求13中所述的试剂盒，其中该多糖包括葡聚糖或糊精。
17.权利要求13中所述的试剂盒，其中该糖类结合蛋白包括凝集素。
18.权利要求13中所述的试剂盒，其中该糖类结合蛋白包括伴刀豆球蛋白A、麦芽凝集 素、花生凝集素或大豆凝集素。
19.权利要求13中所述的试剂盒，其中该高浓度葡萄糖溶液的浓度为约400-2000mg/dl。
20.一种使用生物传感器的方法，包括(a)提供生物传感器，其中该生物传感器包括转换器与覆盖于该转换器的表面上的多糖；(b)将包括特定浓度的糖类结合蛋白溶液的反应液及待测样本的混合物与该生物传感 器接触，其中糖类结合蛋白具有与多糖及葡萄糖结合的能力；(c)以生物传感器检测与多糖结合的糖类结合蛋白的量，以获得该待测样本的葡萄糖 浓度；以及(d)以清洗液恢复该生物传感器的表面，其中清洗液包括高浓度葡萄糖溶液。
21.权利要求20中所述的使用生物传感器的方法，还包括在步骤(d)之后的步骤(e) 重复步骤(a)至(d)。
22.权利要求20中所述的使用生物传感器的方法，其中于步骤(b)中，在该混合物中的 部分受体为葡萄糖所占据的糖类结合蛋白及未受葡萄糖占据的糖类结合蛋白与多糖结合 时产生物理或化学变化。
23.权利要求22中所述的使用生物传感器的方法，该物理或化学变化是通过由该转换 器测定以检测与多糖结合的糖类结合蛋白的量。
24.权利要求22中所述的使用生物传感器的方法，其中该糖类结合蛋白包含偶联物用 以作为物理或化学变化的来源或用以增强物理或化学变化。
25.权利要求20中所述的使用生物传感器的方法，其中该转换器包括重量、光学、电 学、电化学或声学传感器。
26.权利要求20中所述的使用生物传感器的方法，其中该转换器包括石英晶体微天 平、表面等离子共振转换器或表面声波组件。
27.权利要求20中所述的使用生物传感器的方法，其中该多糖包括葡聚糖或糊精。
28.权利要求20中所述的使用生物传感器的方法，其中该糖类结合蛋白包括凝集素。
29.权利要求20中所述的使用生物传感器的方法，其中该糖类结合蛋白包括伴刀豆球 蛋白A、麦芽凝集素、花生凝集素或大豆凝集素。
30.权利要求20中所述的使用生物传感器的方法，其中该高浓度葡萄糖溶液的浓度为 约 400-2000mg/dl。
全文摘要
本发明涉及用于连续检测样本中葡萄糖浓度的方法、试剂盒和使用生物传感器的方法。本发明连续检测样本中葡萄糖浓度的方法，包括(a)提供生物传感器，其中该生物传感器包括转换器与覆盖于该转换器的表面上的多糖；(b)提供特定浓度的糖类结合蛋白溶液，其中该糖类结合蛋白至少具有一受体，且该受体具有与多糖及葡萄糖结合的能力；(c)将待测样本与该特定浓度的糖类结合蛋白溶液混合成一混合物；(d)将该混合物与生物传感器接触；(e)以该生物传感器检测与多糖结合的糖类结合蛋白的量，其中该待测样本的葡萄糖浓度与多糖结合的糖类结合蛋白的量成反比关系；以及(f)以高浓度葡萄糖溶液恢复该生物传感器的表面。
文档编号G01N33/50GK101936980SQ20091015126
公开日2011年1月5日 申请日期2009年7月1日 优先权日2009年7月1日
发明者张鸿文, 李昆峰, 林玉娟, 陈建安 申请人:财团法人工业技术研究院