专利名称：葡萄糖传感器和葡萄糖浓度测定装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及测定试样中的葡萄糖浓度的技术。
背景技术：
对于糖尿病患者而言，掌握自己的血糖值是重要的，另外通过反 复测定血糖值决定胰岛素的给药时机是必要的。血糖值的测定例如川 做成一次性使用的葡萄糖传感器来进行(例如参照专利文献1)。在使 用此文献记载的葡萄糖传感器的方法中，在测定血糖值时，需要用穿 剌装置从皮肤中采集血液。因此，对于糖尿病患者而言，监测血糖值 的操作很麻烦，还要伴随每次测定血糖值时需要用针剌破皮肤的痛苦。
为了解决这种不方便的问题，提出了可以持续监测血糖值的血糖 值测定方法(例如参照专利文献2)，并且在美国由悉奈斯公司(Cygnus， Inc.)做成"手表式血糖仪"而已经产品化。在前述的血糖值测定方法 中，采用把从皮肤采集的血液或间质液供给电极，利用此电极测定葡 萄糖浓度的电极法。此情况下的电极，在血糖值测定时，配置在紧贴 皮肤处，此外，作为电极而言，通过葡萄糖氧化酶(GOD)，把从血液 或间质液中取出的电子供给于电极(导体成分)。
在使用GOD的电极法中，存在着受试样(血液或间质液)中的溶 解氧的影响、测定精度降低的问题。另外，在使用GOD的方法中，在 GOD把从葡萄糖中取出的电子供给于电极(导体成分)的情况下，通 常的是采用使之生成过氧化氢，通过此过氧化氢把电子供给于电极(导 体成分)的方法，或者，把电子传递物质(例如铁氰化钾等金属配位 化合物)作为介质、把电子供给于电极(导体成分)的方法。在无论 哪种方法中，在将从皮肤中采集的血液等与皮肤隔开的位置测定葡萄 糖浓度的情况下，对人体都几乎没有问题。但是，鉴于过氧化氢和铁 氰化钾等都是对人体不太好的物质，所以，像前述的监测方法那样， 在紧贴皮肤处存在含有GOD的电极的测定方法是不可取的。而且，关于使用电子传递物质的方法，需要使电极内含有电子传 递物质、或把电子传递物质固定在电极表面。不论怎样做，电子传递 物质与GOD要分别进行准备，并且使它们含在电极中，在成本方面是 不利的。
5 专利文献1:日本屈特公平8-10208号公报
专利文献2:日本国特表平9-503924号公报
发明内容
本发明的目的在于不对人体带来不好的影响、并且能够低成本且 io 有利地测定葡萄糖浓度。
本发明的第1方面所提供的葡萄糖传感器，其特征在于，具有将 葡萄糖脱氢酶固定于导体成分中的电极，上述葡萄糖脱氢酶是蛋白质 复合体，该蛋白质复合体包括黄素腺P桌呤双核苷酸(FAD)作为辅 酶进行结合、并且具有葡萄糖脱氢活性的催化活性亚单位；用于将从 15 上述催化活性亚单位提供的电子提供给上述导体成分的电子传递亚单 位。
本发明的第2方面提供的葡萄糖浓度测定装置，是可以根据从皮 下组织中采集的血液或间质液、连续测定葡萄糖浓度或持续多次测定
葡萄糖浓度的葡萄糖浓度测定装置，其特征在于，包括具有将葡萄 20糖脱氢酶固定于导体成分中的电极的葡萄糖传感器；用于测定与上述 血液或间质液和上述电极之间的电子授受量相关的响应量的测定部；
根据上述测定部的测定结果、计算葡萄糖浓度的运算部；禾n，控制上
述运算部计算葡萄糖浓度的时间的控制部，
并且，上述葡萄糖脱氢酶是蛋白质复合体，该蛋白质复合体包括 25 黄素腺嘌呤双核苷酸作为辅酶进行结合、并且具有葡萄糖脱氢活性 的催化活性亚单位；用于将从上述催化活性亚单位提供的电子提供 给上述导体成分的电子传递亚单位。
作为葡萄糖脱氢酶而言，优选的是使用来自属于伯克霍尔德氏菌 属(Burkhorderia属)微生物的葡萄糖脱氢酶。 30 在此，本发明所说的属于伯克霍尔德氏菌属的微生物，只要是可
以产生含有具备葡萄糖脱氢活性的a亚单位(催化活性亚单位)、或
5细胞色素C ((3亚单位)的酶(以下有时简称为"GDH")，就没有特 别的限定，不过其中优选的是洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkhorderia cepacia)，特别是洋葱伯克霍尔德氏菌KSl株(以下有吋简称为"KSl 株")。
5 该KSl株是从温泉附近的土壤中分离的新型菌株，从其菌学性
质鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌，在平成12年9月25日(2000年9 月25日)在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心 (〒305-8566日本国茨城县o〈 K市东1 丁目1番地1中央第6) 以微生物保藏号第FERMBP — 7306号保藏。关于KS1株的详细情况，
10 发表在国际公开WO02/36779号公报中。KS1株可以产生含有作为催 化活性亚单位的oc亚单位(分子量约60kDa)、作为电子传递亚单位 的相当于细胞色素C的|3亚单位(分子量约43kDa)以及Y亚单位(分 子量约14kDa)的GDH。其中，分子量是在还原条件下的SDS-聚丙 烯酰胺凝胶电泳中测定的。
15 在本申请的专利请求范围中，有时通过来源菌特定a亚单位、细
胞色素C ((3亚单位)或Y亚单位，但这些只不过是为了特定各亚单位 的简便方法。即，为了防止万一，在此预先确认即使在将含有作为 目标的亚单位的表达编码的媒介物移入到宿主中并进行转化，将由该 转化体产生的GDH作为葡萄糖脱氢酶使用的情况下，不同点只是GDH
20 (亚单位)的起源时，仍属于本专利发明的技术范围。
上述葡萄糖传感器，可以以例如连续地测定葡萄糖浓度或持续多 次地测定葡萄糖浓度的方式构成。在这种情况下，葡萄糖传感器还具 备用于从皮下组织中釆集血液或间质液的采集要素，以使通过采集要 素釆集的血液或间质液可以接触电极的方式来构成。
25 釆集要素的构成是，例如包括用于穿刺皮肤的中空的穿刺针；
用于存储通过此穿刺针采集的血液或间质液的储液部。在这种情况下， 以使存储在储液部的血液或间质液与电极接触的方式来构成。
储液部例如由接触于电极及穿刺针所配置的多孔质体来构成。 上述的葡萄糖传感器也可以以电极的至少把一部分埋入到皮下组
30织中来使用的方式构成。在这种情况下，电极可以在例如具有可挠性
的绝缘基板上形成。
图1是表示本发明第1实施方式的葡萄糖浓度测定装置的正面图。
图2是沿图1的II-II线的剖面图。 5 图3是图1和图2所示的葡萄糖浓度测定装置的分解立体图。
图4是图1和图2所示的葡萄糖浓度测定装置的框图。 图5是表示本发明第2实施方式的葡萄糖浓度测定装置的立体图。 图6是沿图5的IV—IV线的剖面图。 图7是在实施例3中使用的测定系统的简要结构图。 io 图8是表示在实施例1中使葡萄糖浓度发生变化时的响应电流值
测定结果的曲线图。
图9是表示在实施例2中使葡萄糖浓度发生变化时的响应电流值 测定结果的曲线图。
图10是表示在实施例3中测定将葡萄糖浓度设为一定值时的测定 15响应电流的随时间变化结果的曲线图。
图11是表示在实施例3中使葡萄糖浓度发生变化时的响应电流值 测定结果的曲线图。
具体实施例方式
20 图1所示的葡萄糖浓度测定装置XI是使之密切接触手腕等皮肤来
使用，其目的是能够连续测定葡萄糖浓度、或持续多次测定葡萄糖浓 度。如图2和图3所示，葡萄糖浓度测定装置XI具有框体1和葡萄糖 传感器2。
框体1例如是用带子10 (参照图1)周定在手腕等处，具有凹部 25 11、显示部12、 一对插头13a和13b、以及图外的控制电路。凹部ll 用于放置葡萄糖传感器2，可自由装拆。显示部12主要是用于显示测 定结果，用LCD等构成。插头13a和13b用于与后面要讲的葡萄糖传 感器2的作用极32或对极33接触。插头13a和13b用来在葡萄糖传 感器2的作用极32和对极33之间施加电压、或测定施加电压时的响 30 应电流。
葡萄糖传感器2具有互相接合的传感器主体3和釆样抅件4，把它们做成一个整体，相对于框体1能装卸自如。此葡萄糖传感器2例如
是做成一次性使用的结构。当然，也可以做成传感器主体3和采样构 件4分别相对于框体1装卸自如，也可以是传感器主体3和采样构件4 分别进行交换的结构。 5 传感器主体3在绝缘基板30的下面31上形成作用极32和对极33 。
在绝缘基板30上设置了一对贯通孔30a、 30b。贯通孔30a是使作用极 32露出来用的，贯通孔30b是使对极33露出来用的。也就是说，传感 器主体3的结构是，在把葡萄糖传感器2装入到框体1的凹部11的状 态下，使得插头13a能够接触于作用极32，插头13b能够接触对极33。 io 作用极32含有导体成分和葡萄糖脱氢酶(GDH)，通过戊二醛等
交联剂固定在绝缘基板30上。
导体成分例如由碳粉末构成，其含量例如为5 100mg。当然，作 为导体成分也可以使用碳以外的导体粉末或形成为多孔质的导体(例 如导体粉末的烧结体)。 15 作为GDH而言，使用具有葡萄糖脱氢活性的催化活性亚单位和电
子传递亚单位相互结合的蛋白质复合体。
催化活性亚单位起着从试样中的葡萄糖中取出电子、把此电子提 供给电子传递亚单位的作用，作为辅酶使用具有黄素腺嘌呤双核苷酸 (FAD)的物质。因此，来自催化活性亚单位的电子通过还原型FAD， 20 提供给电子传递亚单位。
催化活性亚单位的含量例如换算成活性，相当于5 100U的量。其 中，l单位酶(1U)定义为在标准检测条件(pH6.0、 37°C)下，对 基于DCIP (2，6-二氯苯酚靛酚)的还原而造成的退色，在作为DCIP 的吸收波长的600nm条件下，检测随时间的变化时，每1分钟氧化lpM 25葡萄糖的量(摩尔吸光系数为4.76X1000岸/cm)。
另一方面，电子传递亚单位起着把从催化活性亚单位提供的电子 提供给导体成分的作用。作为电子传递亚单位而言，例如可以使用细 胞色素C。
作为催化活性亚单位和电子传递亚单位而言，优选的是使用属于 30伯克霍尔德氏菌属的微生物，例如源于KS1株的蛋白质复合体。源于 KS1株的GDH，生成作为具有催化活性亚单位机能的a亚单位(在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子量约为60kDa)、作为 电子传递蛋白质的|3亚单位(在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳中的分子量约为43kDa)以及y亚单位(在还原条件下的SDS-聚丙 烯酰胺凝胶电泳中的分子量约为14kDa)结合成的三聚物，或者生成 5 为由a亚单位和|3亚单位构成的二聚物。当然，作为GDH而言，也可 以使用由移入编码a亚单位、(3亚单位和y亚单位的DNA的转化体生 成的蛋白质复合体。
在通过上述微生物或转化体得到作为目的物的GDH的情况下，不 需要单独精制那些亚单位(蛋白质)或单独准备它们，而且也不需要 10在作用极32中含有GDH以外的电子传递物质，所以在这些点上对成 本有利。
对极33例如可以通过用碳糊进行丝网印刷来形成。当然，对极33 也可以用碳以外的导体成分来形成，也可以采用丝网印刷以外的方法 来形成。
15 釆样构件4是用于从皮肤采集试样(血液或间质液)，具有绝缘基
板40、穿刺针41以及液吸收体42。
绝缘基板40是为了固定穿刺针41和液吸收体42的部件，在其下 面40a上，贴着两面都有粘接性的胶带43。这样，可以拉住绝缘基板 40,把葡萄糖传感器2贴紧在皮肤Sk上并将其固定。穿刺针41是用 20 于穿刺皮肤釆集试样的部分，做成中空状。此穿刺针41贯通绝缘基板 40,在绝缘基板40的上面敞幵。液吸收体42是用于保持用穿刺针41 采集的试样的部件，配置成覆盖穿刺针41的上端。该液吸收体42在 把葡萄糖传感器2放入到框体1中的状态下，传感器主体3的作用极 32和对极33相接触。液吸收体42例如以多孔质体来形成。作为多孔 25 质体而言，可以使用例如织布、无纺布、编织布或发泡体。此外，也 可以取代液吸收体42，设置用于保持所采集的试样的空间。
葡萄糖浓度测定装置Xl,除了上述的要素以外，如图4所示，还 具有电压施加部14、电流值测定部15、运算部16以及控制部17。 电压施加部14是用于向作用极32和对极33施加电压，图面上没 30有表示，导通连接于插头13a、 13b。
电流值测定部15是用于在向作用极32和对极33施加电压时测定
9响应电流值。
运算部16，根据电流值测定部15所测定的响应电流值，计算试样 中的葡萄糖浓度。
控制部17用于控制各部12、 14 16的动作。更具体地说，控制 5电流值测定部15，并且控制测定响应电流值的时间，控制运算部16， 并且计算葡萄糖浓度，或者控制显示部12，并且控制显示部12的显示 内容。
如图2清楚地表示的那样，葡萄糖浓度测定装置XI是把葡萄糖传 感器2固定在皮肤Sk上，并且通过用框体1覆盖葡萄糖传感器2，可
io以连续测定葡萄糖浓度，或持续多次测定葡萄糖浓度。在把葡萄糖传 感器2固定到皮肤Sk上时，采样构件4的穿刺针41刺进皮肤Sk。由 于穿刺针41是做成中空的，试样通过穿刺针41提供给液吸收体42。 在这个状态下，因为液吸收体42和皮下组织之间是液体合流，在皮下 组织中的葡萄糖浓度发生变化的情况下，为了保持与皮下组织的葡萄
15 糖浓度平衡，液吸收体42中的葡萄糖浓度发生变化。也就是说，液吸 收体42中的葡萄糖浓度反映了皮下组织中的葡萄糖浓度。
另一方面，液吸收体42与作用极32相接触。因此，通过作用极 32的催化活性亚单位，从试样中的葡萄糖中取出电子。此电子被提供 给电子传递亚单位。在作用极32和对极33之间，通过图4所示的电
20 压施加部14，持续施加电位差。这是为了抑制电子传递亚单位中积蓄 过多的电子，实时地测定响应电流值。提供给电子传递亚单位的电子， 通过在作用极32和对极33之间施加的电位差，提供给导体成分。因 为作用极32通过插头13a，连接于电流值测定部15，所以在电流值测 定部15中，把由电子传递亚单位提供的电子的量作为响应电流值进行
25 测定。
图4所示的控制部17，连续或每隔一定时间(例如隔5分钟 2 小时)把响应电流值进行取样，同时运算部16根据所取样的响应电流 值，连续或每隔一定时间计算葡萄糖浓度。在运算部16中，通过使测 定到的响应电流与预先测得的标准曲线相比对，来计算葡萄糖浓度。 30 在葡萄糖浓度计算终了时，控制部17令显示部12显示运算部16中的 浓度计算结果。在葡萄糖传感器2中，在作用极32中，作为酶，含有电子传递亚 单位与催化活性亚单位结合(亚单位化)的GDH。因此，在作用极32 中，在具有催化活性的蛋白质(催化活性亚单位)的周围，创造出了 对于作用极32具有传递电子功能的蛋白质(电子传递亚单位)均匀存
5 在的环境。也就是说，对于具有催化活性的蛋白质(催化活性亚单位)， 以贴紧的状态存在着分子数等量的电子传递蛋白质(电子传递亚单 位)。其结果是，在葡萄糖传感器2中，增大催化活性蛋白质和催化 电子传递蛋白质之间的反应速度(电子授受速度)，提高响应灵敏度， 同吋可以测定稳定的响应电流。
io 下面参照图5和图6，对本发明第2实施方式进行说明。
图5和图6所示的葡萄糖浓度测定装置X2,与前面所说明的本发 明第1实施方式的葡萄糖浓度测定装置XI相同，是利用带子或胶带， 使之紧贴在手腕等皮肤Sk上来使用(参照图l)。此葡萄糖浓度测定 装置X2具有可以连续测定葡萄糖浓度、或能持续多次测定葡萄糖浓度
15的结构，具有葡萄糖传感器5和框体6。
葡萄糖传感器5做成相对于框体6可以装卸自如、例如做成能用 完就扔掉的结构。此葡萄糖传感器5具有在绝缘基板50上形成有作用 极51和对极52的方式。绝缘基板50具有用于穿刺皮肤Sk的窄条部 分50a，同时是用聚酰胺树脂等做成，具有可弯性。作用极51和对极
20 52具有端子部51a、 52a。作用极51和对极52做成与前面说明的葡萄 糖传感器2的作用极32和对极33 (参照图3)相同。
框体6具有第1和第2构件61 、 62，在这些构件61 、 62之间形成 空间63。空间63用于保持葡萄糖传感器5。
在第1构件61上设置有显示部64和一对插头65a、 65b。显示部
25 64用于显示各种信息，例如由LCD构成。插头65a、 65b连接于图外 的控制电路，在把葡萄糖传感器5保持在空间63中的状态下，以与作 用极51和对极52的端子部51a、 52a相连接的方式构成。在这种状态 下，可以利用插头65a、 65b向作用极51和对极52之间施加电压，并 且在施加电压的状态下，可以测定电流值。另一方面，在第2构件62
30 上，形成有用于使绝缘基板50的窄条部分50a向外部突出的开口部66。 在这样的葡萄糖浓度测定装置X2中，在把葡萄糖传感器5保持在框体6中的状态下，通过使绝缘基板50的窄条部分50a穿刺至皮肤Sk 中，可以连续测定葡萄糖浓度，或持续多次测定葡萄糖浓度。
在把绝缘基板50的窄条部分50a刺进皮肤Sk的情况下，在作川 极51中，从血液或间质液的葡萄糖中取出电子。此电子被提供给电于 5 传递亚单位。提供给电子传递亚单位的电子，通过在作用极51和对极 52之间施加电位差，提供给作用极51的导体成分。此时提供的电子的 量，通过插头65a、 65b可以作为响应电流值进行测定。在葡萄糖浓度 测定装置X2中，连续或每隔一定时间(例如每隔5分钟 2小时)把 响应电流值进行取样，同时根据所取样的响应电流值，连续或每隔一 io定时间计算葡萄糖浓度。计算结果在显示部64上进行显示。
在葡萄糖传感器5中，作用极51含有催化活性亚单位和电于传递 亚单位结合的蛋白质复合体。因此，葡萄糖传感器5不会对人体带来 不好的影响，还可以低成本地进行稳定的响应电流的测定。
15 在本实施例中，对于酶电极的响应特性，用间歇式的反应槽进行
了研究。
酶电极的结构是在塑料管(直径5mm、长度30mm)内部，把酶 和碳粉进行固定化。酶和碳粉末的固定化如下这样来进行把酶和碳 糊(20mg)的混合物充填到塑料管内之后，在塑料管内部，含浸作为
20交联剂的含1%戊二醛的100mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0) 30分钟。 交联剂的过剩的醛基，通过在10mM的Tris-HCl中处理20分钟，交 联剂的过剩的醛被钝化。酶电极在使用之前，在100mM的磷酸钠缓冲 液(pH7.0)中浸渍、进行平衡。作为酶而言，使用由源于KSl株的a 亚单位(催化活性亚单位)、卩亚单位(电子传递亚单位)和Y亚单位
25构成的CyGDH(92.1U/mg)，或者使用由源于KS1株的a亚单位(催化 活性亚单位)和Y亚单位构成的aGDH(21.3U/mg)，做成两种酶电极。 在酶电极中，使酶的含量成为相当于iou的量。
对于浓度不同的多个葡萄糖溶液，根据测定响应电流的结果，对 响应特性进行了研究。在装有调整成目标浓度的葡萄糖溶液的反应槽
30中，浸入酶电极、参比电极和对极，同时在酶电极和对极之间施加电 压，把参比电极作为基准电极来测定响应电流值。通过把葡萄糖溶解
12到lOOmM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)中，制作了葡萄糖溶液。葡萄糖 溶液的浓度设定为OmM、 0.5mM、 l.OmM、 1.5mM、 2.0itiM、 2.5mM、 8mM、 12mM、 2hnM、 30mM和47mM。使用Ag/AgCl电极作为参比 电极，使用Pt电极作为对极。施加电压值定为+400mV,响应电流值 5 的测定是把反应槽的温度保持在25。C或37"C下来进行。响应电流值的 测定结果如图8所示。
从图8可以看出，使用了没有|3亚单位(电子传递亚单位)的cxGDH 的酶电极，随着葡萄糖浓度的增加，响应电流值的增加量小，在作用 极中的导体成分和a亚单位之间，没有进行适宜的电子传递。与此相 io 反，使用了有卩亚单位(电子传递亚单位)的CyGDH的酶电极,，随着 葡萄糖浓度的增加，响应电流值的增加量增大，得到良好的响应特性。 艮口，可以看出，通过使P亚单位与a亚单位结合(亚单位化)，在作 用极中的导体成分和a亚单位之间进行着适宜的电子传递。
这样的倾向在把测定温度设定为25'C和37"C的任何一种情况下都 15 可以看到。因此，使用结合了电子传递蛋白质的GDH的酶电极，不使 用金属配位化合物等的电子传递物质，在电极法中就可以测定葡萄糖 浓度。
在本实施例中，使用间歇式的反应槽，对于施加电压对酶电极的 20 响应特性的影响进行了研究。酶电极基本上作成与实施例1相同。但 是，作为酶而言，使用了比活性为56.5U/mg的CyGDH，并且把酶电 极中的酶含量定为相当于50U的量。对于响应特性而言，是把目标浓 度的葡萄糖溶液保持在37°C ，把施加电压分别定为+400mV和+250mV 的情况下，根据测定响应电流值的结果进行了研究。葡萄糖溶液的浓 25 度设定为OmM、 0.5mM、 l.OmM、 1.5mM、 2.0mM、 2.5mM、 8mM、 12mM、 21mM和47mM。响应电流值的测定结果如图9所示。
从图9可以看出，在施加电压值为+250mV的情况下，虽然与施加 电压值为+400mV的情况相比，响应电流值变小，但可以说在施加电压 值为+400mV和+250mV的任何一种情况下，都能恰当地测定响应电流 30 值。因此，在使用结合了电子传递蛋白质的GDH的情况下，即使施加 电压值比较小，也能恰当地测定响应电流值，也能测定葡萄糖浓度。其结果是，在像连续或持续监视血糖值的情况那样，在需要连续施加 电压的情况下，或者在由电池驱动用于连续或持续监视血糖值的葡萄 糖浓度测定装置的情况下，发挥优势作用。 [实施例3]
5 在本实施例中，对于使用酶电极连续监视葡萄糖浓度的可能性，
使用流动容器进行了研究。具体地说，对(1) 72小时的连续监视试验、
(2)做成初期(未使用)的酶电极和72小时连续监视使用后的酶电
极的响应特性进行了研究。 (1)连续监视试验
io 连续监视试验，用图7所示基本结构的测定系统7来进行。此测
定系统7的结构是，在反应容器70中装有酶电极71、参比电极72和 对极73,在向反应容器70的内部供给葡萄糖溶液时，这些电极71 73与葡萄糖溶液接触。把各电极71 73连接于恒电位电解装置74。 在反应容器70中规定了流路75，反应容器70的结构是能够连续提供、
15排出葡萄糖溶液的流动容器。其结构是从装有目标浓度的葡萄糖溶液 的容器76,通过泵77的动力，连续向反应容器70提供葡萄糖溶液。 在测定系统7中，酶电极71作成与实施例2相同，使用流动容器用的 Ag/AgCl电极作为参比电极72，使用不锈钢管作为对极73。
在酶电极71和对极73之间施加电压，同时把参比电极72作为基
20 准电极，测定了响应电流值。施加电压值设定为+250mV。在以0.lml/min 的流速连续性地向反应容器70提供5mM的葡萄糖溶液(pH7.0)，同 时在把葡萄糖溶液的温度维持在37'C的状态下，连续地测定响应电流 值。响应电流值随时间的变化如图IO所示。在图10中，表示纵轴的 响应电流是把测定时间为"0"时的值作为100的相对值。
25 (2)使用前后的酶电极的响应特性
使用图7所示的测定系统7，在使目标浓度的葡萄糖溶液保持在 37X:状态下，以0.5ml/min的流速提供目标浓度的葡萄糖溶液，将施加 电压定为+250mV，根据所测定的响应电流值，研究了使用前(Oh)和 使用后(72h)的酶电极的响应特性。葡萄糖溶液的供给如下这样来进
30 行按照OmM、 0.5mM、 l.OmM、 2.5mM、 10.0mM、 15.0mM、 20.0mM 禾口 25.0mM的顺序阶段性地上升后，再与前面相反，阶段性地使浓度降低。响应电流值的测定结果如图ll所示。
从图10可以看出，在72小时连续监视试验中，虽然响应电流值
随吋间而降低，但在72小时后也测定到恒定量的响应电流值。另一方 面，从图ll可以看出，72小时连续监视使用后的酶电极，与使用前的
5 酶电极相比，响应特性变差，但是具有用于测定葡萄糖浓度的足够的
响应特性。这些结果表明，在使用电子传递蛋白质结合了的GDH的酶 电极中，在72小时连续监视试验后，GDH还有充分的残存活性，可 以使用例如用CyGDH的酶电极进行连续监视。
也就是说，在预先调查了酶电极的响应电流值随时间而劣化后，
io 如果基于随时间而劣化的预测，对测定值或运算值进行修正，就能够 连续进行监视。此外，如改进酶电极，抑制随时间而劣化，就能够连 续进行监视。而且，把伴随酶电极的随时间而劣化而造成响应电流值 减少的量与随时间增加施加电压，强制地增加响应电流值来抵消，艮卩， 通过以图11所示的响应电流值用固定值来进行推移的方式控制施加电
15压，就能够连续进行监视。
从连续监视试验可以得到如下的见解。即，在最初的18个小时左 右期间，响应电流值的减少量变大，其后的响应电流值比较稳定。因 此，也考虑了把酶电极(葡萄糖传感器)有意识的进行某种程度的劣 化后，再进行实际葡萄糖浓度测定的使用方法。
20 另外，由图11可以看出，使用前(0h)和使用后(72h)的酶电
极(葡萄糖传感器)，在使葡萄糖^度提高的过程(0mM—25mM)和 使葡萄糖浓度减少的过程(25mM—OmM)之间，可以看到良好的相关 关系。这意味着像连续监视血糠值的情况那样，在葡萄糖浓度随时间 发生变化的环境下，可以恰当地测定葡萄糖浓度。
25
1权利要求
1.一种葡萄糖传感器，其特征在于具有将葡萄糖脱氢酶固定于导体成分中的电极，所述葡萄糖脱氢酶是蛋白质复合体，该蛋白质复合体包括黄素腺嘌呤双核苷酸作为辅酶进行结合、并且具有葡萄糖脱氢活性的催化活性亚单位；用于将从所述催化活性亚单位提供的电子提供给所述导体成分的电子传递亚单位，还具有用于从皮下组织中采集血液或间质液的采集要素，以可以连续地测定葡萄糖浓度、或可以持续多次地测定葡萄糖浓度，以使所述采集要素所采集的血液或间质液能够与所述电极接触的方式构成，所述采集要素包括用于穿刺皮肤的中空的穿刺针、和用于存储通过该穿刺针所采集的血液或间质液的储液部，以使存储于所述储液部的血液或间质液与所述电极接触的方式来构成。
2. 根据权利要求1所述的葡萄糖传感器，其特征在于 所述葡萄糖脱氢酶源自伯克霍尔德氏菌属微生物。
3. 根据权利要求2所述的葡萄糖传感器，其特征在于 所述电子传递亚单位是细胞色素C。
4. 根据权利要求3所述的葡萄糖传感器，其特征在于 所述催化活性亚单位在还原条件下的SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子量约为60kDa，所述细胞色素C在还原条件下的SDS —聚丙 烯酰胺凝胶电泳中的分子量约为43kDa。
5. 根据权利要求4所述的葡萄糖传感器，其特征在于-所述的葡萄糖脱氢酶还含有在还原条件下的SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子量约为14kDa的Y亚单位。
6. 根据权利要求1所述的葡萄糖传感器，其特征在于 所述储液部是接触于所述电极及所述穿刺针所配置的多孔质体。
7. —种葡萄糖浓度测定装置，它是根据体液、以连续地测定葡萄糖 浓度、或持续多次地测定葡萄糖浓度的方式来构成，其特征在于包括权利要求1 6中任一项所述的葡萄糖传感器； 用于测定来自所述葡萄糖传感器的响应量的测定部； 根据所述测定部的测定结果、计算葡萄糖浓度的运算部；和 控制所述运算部计算葡萄糖浓度的时间的控制部。
全文摘要
本发明涉及一种具有将葡萄糖脱氢酶固定于导体成分中的电极(32)的葡萄糖传感器(2)。作为葡萄糖脱氢酶而言，使用蛋白质复合体，该蛋白质复合体包括具有葡萄糖脱氢活性的催化活性亚单位；和用于将从催化活性亚单位提供的电子提供给导体成分的电子传递亚单位。优选为，葡萄糖传感器(2)以能够连续地测定葡萄糖浓度、或者能够持续多次地测定葡萄糖浓度的方式来构成。
文档编号A61B5/15GK101558992SQ20091011813
公开日2009年10月21日 申请日期2004年9月1日 优先权日2003年9月2日
发明者早出广司 申请人:早出广司