专利名称：一种检测婴儿痉挛症患儿对acth药物敏感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及婴儿痉挛症患儿对ACTH药物敏感性的检测试剂盒，具体而言，涉及一 种能快速、有效的检测出婴儿痉挛症患儿基因组MC2R启动子区是否含有纯和TCCT单体型， 从而快速判断患儿是否对ACTH药物治疗敏感的试剂盒。
背景技术：
癫痫是除中风以外的第二位脑部的慢性疾病，是婴儿期第一位脑部慢性疾病。婴 儿痉挛症(Infantile spasms, IS)又称West综合征，是婴儿时期最常见的一种难治性癫 痫综合征,其患病率较高,约为1/2000活产儿[Baram TZ, Mitchell WG, et al. Infantile Spasms Hypothe sis-Driven Therapy and Pilot HumanInfant Experiments UsingCorticotropin-Releasing Hormone Receptor Antagonists. DevNeurosci 1999 ； 21 :281-289. Lux AL, Osborne JP. A proposal for casedefinitions and outcome measures in studies of infantile spasmsand west syndrome consensus statement of the West DelphiGroup. Epilespia 2004 ；45 (11) :1416_1428]。本病通常在生后第 1 年内 出现，多以3 8月龄发病，发病高峰年龄为6月，以痉挛成簇发作、高峰失律脑电图和精神 发育迟滞三联征为主要表现，预后较差，死亡率较高。大量的研究资料证实下丘脑_垂体_肾上腺(HPA)轴功能紊乱在婴儿痉挛症的 发病机制中发挥重要作用。目前尽管ACTH已经成为短期内治疗婴儿痉挛症的主导药物， ACTH能成功地控制痉挛的发作和缓解高峰失律EEG表现，但到目前为止，有关ACTH治疗 婴儿痉挛的作用机制和耐药机制尚不清楚。目前研究表明ACTH可通过以下两种途径下调 脑内某些区域促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的过度分泌和释放，降低婴儿痉挛患儿的 神经元兴奋性发挥临床抗惊厥效应(1)与MC2R结合，促进肾上腺皮质糖皮质激素分泌， 使血浆的皮质醇水平稳定和持续升高；(2)通过直接刺激中枢杏仁体(ACe)的黑皮质素2 受体(MC2R)发挥独立于类固醇激素外的直接效应。这两种途径均可通过长、短负反馈机 制最终抑制脑内致惊厥剂CRH的合成和分泌，有效地控制痉挛发作和缓解高峰失律EEG表 现[Jaseja H.A plausible explanation for superiority ofadreno-cortico-trophic hormone (ACTH) over oral corticosteroids in management of infantile spasms(West syndrome). Med Hypotheses2006 ；67 :721_724· Brunson KL, Avishai-Eliner S，Baram TZ. ACTHtreatment of infantile spasms :mechanisms of its effects inmodulation of neuronal excitability. Int Rev Neurobiol2002 ；49 185-197. Baram TZ. Treatment of infantile spasms :theideal and the mundane. Epilepsia 2003;44:993-994·]。最新的癫癎药物遗传学研究结果表明，某些药物受体基因常见突变，尤其是单核 苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNPs)的改变在很大程度上与癫癎发生、 惊厥结果、抗癫癎药物敏感性，抗癫癎药物耐药等密切相关。SNP是指在基因组上单个核苷 酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换 为T，原因是CG中的C常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP是指
3变异频率大于的单核苷酸变异。因此，SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、 对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。SNP将提供一个强有力的工具，用于高危 群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。SNP在基 因组中分布相当广泛，近来的研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。大量存 在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来 看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病 基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。[Chen JZ, Xie XD，Wang XX, Tao Μ, Shang YP, Guo XG. Single nucleotide polymorphisms of theSCN5A gene in Han Chinese and their relation with Brugada syndrome. Chin Med J(Engl)2004 ； 117 652-656]。在我们既往研究中，我们发现MC2R基因启动子区的SNPs，rsl893220，rs2186944 和-2T > C的基因型和等位基因频率分布在婴儿痉挛病人和对照组之间差异有显著统计学 意义，随后构件的单体型频率分析发现，常见的TCCT单体型与婴儿痉挛症患儿的ACTH药物 反应性高度相关，提示MC2R基因启动子区SNPs的改变可能很大程度上参与了婴儿痉挛症 的发病机制和ACTH治疗的耐药反应。这些研究结果可能为婴儿痉挛症病人的ACTH治疗疗 效提供一定的分子生物学方面预测。人类MC2R基因的表达主要通过cAMP信号途径受配体 ACTH的正向调控，MC2R基因启动子活性基础调控区和cAMP反应元件(CREs)位点目前已 从功能上在 MC2R 基因上被鉴定[Naville D, Jaillard C, Barjhoux L, Durand P, Begeot M. Genomic structure and promotercharacterization of the human ACTH receptor gene. Biochem BiophysRes Commun 1997;230:7-12.]。MC2R 基因编码区突变可导致 cAMP 反应受损，对ACTH刺激所引起受体敏感性丧失以及该受体ACTH结合位点对ACTH高度亲 禾口力的丧失等[Penhoat A, Naville D, ElMourabit H, et al. Functional relationships between three novel homozygous mutationsin the ACTH receptor gene and familial glucocorticoid deficiency. J Mol Med 2002 ;80 :406_411]。我们进一步比较了接受ACTH 治疗的婴儿痉挛症病人TCCT单体型携带者和非携带者的ACTH治疗反应性，结果发现在 TCCT单体型频率分布中婴儿痉挛症病人明显低于对照组，纯合子和杂合子携带者的ACTH 反应性优于非携带者。此外，与ACTH治疗反应性相关的TCCT单体型跨越启动子区上游的_2 到-853区域，该区域恰好包括影响ACTH疗效发挥的CREs区域。体外单核苷酸多态性功 能研究证实MC2R基因启动子区的多态性可使该基因的启动子活性降低[Slawik M，Reisch N, Zwermann O, et al. Characterization of anadrenocorticotropin(ACTH) receptor promoter polymorphism leadingto decreased adrenal responsiveness to ACTH. J Clin EndocrinolMetab 2004 ；89 :3131_3137]。因此，我们推测MC2R基因启动子区TCCT单体型 可能潜在地影响启动子的活性，使之对细胞内cAMP的反应性发生变化，导致受体对ACTH刺 激的敏感性降低，从而最终参与婴儿痉挛症患儿ACTH治疗的耐药机制。
核酸探针作为一种序列同源性的检测技术已经在分子生物学、临床医学、细胞生 物学、分子遗传学等学科领域中应用，得以飞速的发展[曹军胜.核酸探针及其应用.延 安大学学报(医学科学版)2005，(02)]。核酸探针是根据核酸分子之间的互补配对原则设 计的一种检测目标序列是否存在的一段核酸序列，探针与目标序列的这种结合称为杂交。 核酸探针不仅是研究核酸结构和功能的重要手段，还为传染病的诊断、流行性病的调查、食 品卫生检查、肿瘤和遗传病的早期诊断等打开了一个新的突破口，并且是法医学研究的重要技术。在遗传诊断方面，通过检测某一病毒基因的缺失或碱基突变的情况，疾病基因与 另一非疾病基因的非随机关系来确定某一遗传疾病是否存在[Mercatali L，Valenti V, Calistri D,et al. RT-PCR determination of maspin and mammagIobinB in peripheral blood of healthy donors and breast cancerpatients.Ann Oncol,2006,17 (3) 424-428.]。特别重要的是如果能够制作一系列遗传疾病基因的探针，就可以在胎儿出生前 检测是否带有某种遗传疾病，减少患病婴儿的出生率。各种设计巧妙、性能优良的新型核 酸探针被开发研制，并在基因分析、疾病诊断、生物工程等领域得到了广泛的应用。其中， 基于荧光标记的核酸荧光分子探针具有背景较低、检测灵敏度高、操作简易、活体实时分析 等优点，已广泛应用于基因突变疾病的研究、活细胞中mRNA的检测、蛋白质的检测及生物 芯片研究等，越来越受到人们的关注[Nazarenkol，Lowe B, Darfler Μ, etal. Multiplex quantitative PCR using self-quenched primers labeledwith a single fluorophore. Nucleic AcidsRes. 2002,30(9) :e37.]。因此制备一种简便的试剂盒，来检测婴儿痉挛症患儿的基因组MC2R启动子区是 否含有纯和TCCT单体型，显得非常重要，而本发明恰好解决了这一难题。本发明用荧光标 记探针，通过杂交检测痉挛症患儿MC2R基因启动子区是否携带纯和TCCT单体型，以判断该 患儿是否对ACTH治疗敏感。本发明所述的检测患儿痉挛症患儿对ACTH药物敏感性的试剂盒能快速、有效的 检测出婴儿痉挛症患儿基因组MC2R启动子区是否含有纯和TCCT单体型，从而快速判断患 儿是否对ACTH药物治疗敏感。如果不携带此单体型，可较早选用其它抗癫痫药物，为患儿 减少了不必要的痛苦，抓住治疗时机，同时减轻患儿家庭经济负担。
图1为CCT单体型携带者与非携带者ACTH反应性结果比较图；
发明内容
本发明基于MC2R基因启动子区的单核苷酸多态性用于评估婴儿痉挛症患儿对 ACTH药物治疗敏感的基础上，提供了一种检测婴儿痉挛症患儿对ACTH药物敏感性的试剂 盒。本发明所要解决的关键问题在于，快速的诊断婴儿痉挛症患儿是否携带TCCT单体型， 进一步判断患儿是否对ACTH药物治疗敏感，再选择合适的药物为患儿医治。本试剂盒包括检测MC2R基因启动子区rsl893220号的SNP位点的特异性引物对 以及特异性核酸探针、检测MC2R基因启动子区rs2186944号的SNP位点的特异性引物对以 及特异性核酸探针、检测MC2R基因启动子区-2T > C号的SNP位点的特异性引物对以及特 异性核酸探针、荧光定量PCR反应缓冲液、dNTP混合液、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶、去离 子水。本试剂盒中所述的特异性引物对是指对MC2R基因启动子区rs 1893220号、 rs2186944号以及-2T>C号的SNP位点设计，能特异性扩增出靶位点的DNA片段的引物对。 设计这类引物对是本领域技术人员容易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO 1 和2所示序列的引物对、SEQ ID NO 3和4所示序列的引物对以及SEQ ID NO 5和6所示 序列的引物对。特异性地引物对可以用常规地合成技术进行合成。本领域地技术人员能够理解，本发明地引物不限于这两对引物。 本试剂盒中所述的特异性荧光探针是指对MC2R基因启动子区rs 1893220号、 rs2186944号以及-2T > C号的SNP位点设计，能通过荧光定量PCR技术特异性扩增出靶 位点的DNA片段的探针。设计这类引物对是本领域技术人员容易完成的。优选地，试剂盒 中包含具有SEQ ID NO :3和4所示序列的探针。特异性地探针可以用常规地合成技术进行 合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这两对引物，所有可用于荧光定量 PCR检测MC2R基因启动子区rsl893220、rs2186944以及_2T > C的SNP位点的探针均在 本发明范围内。本发明试剂盒的一人份组分盒含量包括
1.0μ 1IOX荧光定量PCR反应缓冲液
0.2μ 125mM dNTP
0.5 μ 125mM MgCl2 溶液
0.02 μ 15unit/y 1 Taq DNA 聚合酶
0.2μ 125 μ M特异性引物
0.1 μ 125 μ M特异性核酸探针
5.68 μ 1去离子水
本试剂羞[的保存温度位-20°C
具体实施方案下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。下面实施例中未表明具体条件的试 验方法，通常按照常规的条件。实施例1检测试剂盒的使用方法步骤一 DNA模板的抽取抽取婴儿痉挛症患儿外周血，提取DNA步骤二 荧光定量PCR试验使用检测痉挛症患儿对ACTH药物敏感性的试剂盒，其中含有下列引物对和荧光 探针(下述核苷酸序列均为5’ -3’)有义引物1:CATGTTGCGGAGGCACAC(SEQIDNO1)
反义引物1TGCTTCTCCGTCCAAAAACT(SEQIDNO2)
有义引物2:AGAAACAGCCACTGGTTTGG(SEQIDNO2)
反义引物2TGGAATTGTCATCTTGCTCTTTT(SEQIDNO4)
有义引物3TGGGGCTATTCCCTTCTTCT(SEQIDNO5)
反义引物3CAGCTCTGAAGCAGGAACTTT(SEQIDNO6)
荧光探针1CTCAGAAACAGTCGAAGTCTGG(SEQIDNO7)
荧光探针2CCCCAGCCCCAAAAACCCAGG(SEQIDNO8)
荧光探针3CTTCTTAATGAAACTAATGAGC(SEQIDNO9) 其中，有义引物1，反义引物1和荧光探针1特异性针对检测MC2R基因启动子区 rsl893220号的SNP位点；有义引物2，反义引物2和荧光探针2特异性针对检测MC2R基因 启动子区rs2186944号的SNP位点；有义引物2，反义引物2和荧光探针2特异性针对检测MC2R基因启动子区-2T > C的SNP位点。荧光定量PCR反应体系为总体积10μ 1，包含浓度25ng/l·! 1的DNA模板2μ1、 1. Ομ 1的IOX荧光定量PCR反应缓冲液、0. 2 μ 1的25mM dNTP、0. 5μ 1的25mMMgC12溶液、 0.02 μ 1的5unit/y 1 Taq DNA聚合酶、0. 2μ 1的25 μ M特异性引物的0. 1μ 1的25 μ M特 异性核酸探针以及5.68 μ 1的去离子水。在荧光定量PCR扩增仪上进行反应，发应条件为 52°C、2分钟，95°C、10分钟，进行55个循环的95°C、45秒，60°C、90秒。反应结束后在荧光 定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤三SNP基因型分析将荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量和正常照相对比，荧光探针1荧光信 号明显高于正常对照，说明被检测样品中MC2R基因启动子区rsl893220号的SNP位点为 C型，为ACTH药物治疗敏感；荧光探针2荧光信号明显高于正常对照，说明被检测样品中 MC2R基因启动子区rs2186944号的SNP位点为C型，为ACTH药物治疗敏感；荧光探针3荧 光信号明显高于正常对照，说明被检测样品中MC2R基因启动子区-2T > C的SNP位点为T 型，为ACTH药物治疗敏感。实施例2 利用本发明检测汉族婴儿对ACTH药物敏感性本发明的一种婴儿痉挛症患儿对ACTH药物敏感性的检测试剂盒的优选实施例 为，我们利用检测试剂盒，对新诊断为婴儿痉挛症的患儿进行了用药前MC2R启动子区的筛 选，了解了患儿是否对ACTH治疗有反应。同时检测了 ACTH治疗不敏感的婴儿痉挛症患儿 MC2R启动子区是否含有TCCT单体型。我们将所述的婴儿痉挛症检测试剂盒检测到的基因分型后，再对婴儿进行针对性 治疗。92例患儿中，TCCT携带者的46例，均给与ACTH肌肉注射治疗，治疗4周后评价治疗 效果，30例患儿发作次数减少75%以上，5例患儿发作次数减少50-75%，即有35例患儿对 ACTH治疗有反应率达76% ；而TCCT/0携带者35例，对ACTH治疗有反应率达71% ；我们也 检测了非携带者患儿对ACTH治疗反应状况，发现在22例中，只有23%病例的发生了发应 (图 1)。发作次数减少75%以上是有效，无明显减少是无效，50-75%是好转，发作次数减 少50%以上即认为对ACTH治疗有反应。探针检测结果与测序结果一致，说明我们设计的探 针试剂盒精确度高，产品成形后使用准确、快速、经济；快速的诊断患儿是否携带TCCT单体 型，所述的婴儿痉挛症检测试剂盒将为临床选择用药提供了很大帮助。显而易见，本领域的普通技术人员可以通过本发明方法，用各种类型多肽的制备 特异性的抗体。上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普 通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，因此所 有等同的技术方案也应属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由各权利要求限定。一种检测婴儿痉挛症患儿对ACTH药物敏感性的试剂盒.txt<110>中国人民解放军总医院<120> 一种检测婴儿痉挛症患儿对ACTH药物敏感性的试剂盒<160>9<210>1
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CAGCTCTGAAGCAGGAACTTT
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CAGCTCTGAAGCAGGAACTTT
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CCCCAGCCCCAAAAACCCAGG
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>探针
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CTTCTTAATGAAACTAATGAGC
权利要求
一种检测痉挛症患儿对ACTH药物敏感性的试剂盒，包括检测MC2R基因启动子区rs1893220号的SNP位点的特异性引物对以及特异性核酸探针、检测MC2R基因启动子区rs2186944号的SNP位点的特异性引物对以及特异性核酸探针、检测MC2R基因启动子区 2T＞C号的SNP位点的特异性引物对以及特异性核酸探针、荧光定量PCR反应缓冲液、dNTP混合液、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶、去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的异性引物对是指对MC2R基因启 动子区rsl893220号、rs2186944号以及-2T > C号的SNP位点设计，能特异性扩增出靶位 点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针是指对MC2R基 因启动子区rsl893220号、rs2186944号以及-2T > C号的SNP位点设计，能通过荧光定量 PCR技术特异性扩增出靶位点的DNA片段的探针。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有SEQID NO :1和2所示序列的引物对、SEQ ID NO 3和4所示序列的引物对以及SEQ ID NO 5和6 所示序列的引物对。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQ ID NO :7、8禾Π 9所示序列的探针。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括浓度25ng/ μ 1的DNA模板2μ 1、1.0μ 1的IOX荧光定量PCR反应缓冲液、0. 2 μ 1的25mM dNTP、 0. 5 μ 1 的 25mMMgC12 溶液、0. 02 μ 1 的 5unit/ μ ITaq DNA 聚合酶、0. 2 μ 1 的 25 μ M 特异性 引物的0. 1 μ 1的25 μ M特异性核酸探针以及5. 68 μ 1的去离子水。试剂盒供一人份检测 使用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明公开了一种婴儿痉挛症患儿对ACTH药物敏感性的检测试剂盒。该试剂盒包括检测MC2R基因启动子区rs1893220号的SNP位点的特异性引物对以及特异性核酸探针、检测MC2R基因启动子区rs2186944号的SNP位点的特异性引物对以及特异性核酸探针、检测MC2R基因启动子区-2T＞C号的SNP位点的特异性引物对以及特异性核酸探针、用于荧光定量PCR检测的常规试剂组件等。本发明的试剂盒通过同时检测分析儿童MC2R基因启动子区SNP位点来预测婴儿痉挛症患儿对ACTH药物的敏感性，为医治婴儿痉挛症患儿选择合适的药物打下基础。
文档编号G01N21/64GK101906468SQ200910223428
公开日2010年12月8日 申请日期2009年11月16日 优先权日2009年11月16日
发明者丁瑛雪, 刘占利, 邹丽萍 申请人:中国人民解放军总医院