专利名称：保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种组织细胞蛋白裂解液的提取装置，尤其涉及一种保持蛋白磷
酸化状态的组织细胞裂解液的提取装置，该装置在提取活体组织裂解液的过程中同时抑制 磷酸酶，从而保持其中蛋白质的磷酸化状态。
背景技术：
迅速裂解动物组织是寻找和研究生物标记、抗体、蛋白表达、蛋白相互作用以及 ELISA和免疫沉淀等实验所必须的步骤。此外，生物体细胞内的磷酸化和去磷酸化的蛋白表 达能揭示一系列生物现象，包括与细胞内信号传递、细胞凋亡、细胞分化和增殖相关联的分 子开关。 目标蛋白通过蛋白激酶，在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上转移磷酸基团，使得蛋 白处理磷酸化状态，其键结合改变了蛋白的形态结构以及结合反应能力。蛋白的磷酸化检 测被广泛应用于疾病的的体外诊断。 除具用专业分子生物实验的部门外，如在医院镜检部门的口常活体组织检验过 程中，都是预先一周内由专业分子生物实验室制备磷酸酶抑制剂，放入某种容器或试管内 准备好，在使用时容器放置在冰上，预备在镜检的操作室内，或把活检组织直接投入液氮。 其制备过程繁琐并会对镜检部门原有的设置和条件产生影响，此外，配制的磷酸酶抑制剂 易受空气中酸性物质(如二氧化碳等)的影响而使得其对酶的抑制失效，或者在从液氮中 复苏，蛋白磷酸化的状态也会有很大变化。由于采集到的活体组织又需要快速裂解，以稳定 其中蛋白质的磷酸化状态，而磷酸酶抑制剂不宜长期保存，在检测过程中组织裂解液当中 的磷酸化蛋白状态易发生改变，都影响了被检测的蛋白磷酸化水平。 实验室配制的磷酸酶抑制剂其保存时间通常为两周左右，当其暴露于空气中时， 其抑制效果会显著下降。GENMED公司提供一种磷酸酶抑制剂混合液，包括氟化钠(Sodium Fluoride)、饥酸納(SodiumOrthovanadate)、焦憐酸納(Sodium Pyrophosphate)禾口甘油憐 酸(Glycerophosphate)等化合物实现对组织提取液中磷酸化酶的抑制，使样品中的各类 蛋白质处理原始的生理状态。在4t:温度下，该抑制剂的稳定性能保持12个月。 以医院镜检部门为例，其对活体组织的检验通常采用微阵列检测(即蛋白或组织 芯片)，这就要求活体组织细胞经常规方法裂解后，还必须要经过测定和校正裂解液中的蛋 白质浓度后，才能进行相应的蛋白磷酸化水平检测。因此受到多种因素的影响(如裂解液 制备时间过长，磷酸酶抑制也会不稳定)，使得磷酸酶抑制剂的抑制效果下降，导致样品中 蛋白质的磷酸化状态发生改变，并进而影响检测结果。还有检测方法借助荧光技术直接作 用于被检测组织上，但其受细胞膜的阻碍作用，抗体效果会受表达不稳定影响。
发明内容本发明的一个目的在于提供一种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装 置，尽可能地保护磷酸化状态并能使组织细胞尽快裂解的方法，以适应于医院活检组织镜检的需要，简化和统一被检的样本的制备，从而提高检测的通量、制备样本一致性和实时的 准确性，来更好地评价生命现象。本装置能实现不具备特殊实验室条件的单位，如医院镜 检部门对活检组织的蛋白磷酸化检测的样本制备。 镜检指通过纤维镜进行的检测，纤维镜是一种可随意弯曲、细小、柔软的内腔镜， 由导光性能良好的玻璃纤维制成，其外部有冷光源照明，能按操作要求进入成角度的生理 或病理性小腔道内，观察微小的病变，采取组织或细胞样本。 在纤维气管镜或胃肠道镜检过程中，技术人员通常需要对活体器官进行取样，以 便于通过进一步的组织检测分析病情。这些活体组织在离体后，其中某些蛋白质的磷酸化 水平会发生变化，使得其与生理状态不相一致，比如在离体状态下，JNK蛋白的磷酸化程 度在逐渐增加，而ERK蛋白的磷酸化程度则在减少。因此，在离体的组织或细胞样本中需要 加入磷酸酶抑制剂，减少活组织离体后某些蛋白磷酸化表达变化，保持活组织离体后蛋白 磷酸化原有状态，以确保检测的结果与实际的生命状况相一致，能为生命现象和疾病的诊 断提供依据。 在镜检的整个过程当中，实时的蛋白磷酸化状态是极其不稳定或易发生改变，不 仅需要对离体样本的及时处理，还需要对处理后样品制备及快速地分析。因此，保持组织细 胞的蛋白磷酸化状态的技术一直是很重要的。 活检组织源自于活体动物器官的细胞或形态相似、功能相同的细胞群及其细胞间 质。活体动物包括人、野生动物和家畜(Livestock)。野生动物为自然状态下未经人工驯化 的动物。家畜是为了提供食物来源而人工饲养的动物，如狗、鼠、仓鼠、猪、兔、奶牛、水牛、 公牛、绵羊、山羊、鹅和鸡等，活体动物器官的具体类型，但不仅限于，如鼻、喉、食管、支气 管、胃、十二指肠、胆道、结肠、膀胱或宫腔等。 先预冷冻装置盒o至-6t:—个小时，再进行蛋白磷酸酶抑制剂和裂解液制备及分 装在微型离心管内，然后将其微型离心管置于真空容器中，在o-4t:避光条件下的制剂能有 效保存14-16个月，以实现医院等镜检部门对活检组织的快速检测。 —种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置，包括 密闭容器，由顶盖和容器腔体组成，腔体内盛有冷冻液体，液体的体积小于腔体的 容积；12至24个大小相同的微型离心管，置于密闭容器的腔体内，各个试管中盛有相同体 积的裂解液及磷酸酶抑制剂。 另一种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置，包括 由顶盖和双层容器腔体组成的密闭容器，容器腔体内盛有冷冻液体，液体的体积
小于腔体的容积；管槽与容器腔体侧面内壁固定连接，将腔体分为上下两层，12至24个大
小相同的微型离心管垂直放置于管槽内；各个微型离心管中盛有相同体积的裂解液及磷酸
酶抑制剂。 容器腔体侧面和顶盖面至少设有一个与内腔向连通的开口。 裂解液为1-2% (w/v)十二烷基磺酸钠溶液，磷酸酶抑制剂2mmol/L钒酸钠溶液 (pH10)，裂解液和磷酸酶抑制剂按等体积混合后分装于微型离心管内。 真空装置通过密闭容器上的开口与容器连接，将内腔中的空气排除，使其真空度 至少小于-lPa，优先选择真空度为-5Pa--10Pa。之后将开口密闭并将装置置于4。C保存。 使用时，打开容器顶盖，将相同体积和相同类型的活检组织样本置于试管内，研磨并离心后得到上清组织裂解液，直接用于蛋白的微阵列检测。 为了避免溶解于溶液中气体的影B向，实现对磷酸酶更好的抑制效果，可以通过超
声的方式将配制后的磷酸酶抑制剂和裂解液中的气体排除。具体方法如将溶液先超声
10-30分钟后，静置20-60分钟，再振摇后超声5-15分钟后，静置10-30分钟。 微型离心管为1.8ml Eppendorf离心管。 冷冻液为试管提供低温环境，具体为水。 本实用新型所涉及的术语与其在本领域的一般概念相同。 所述的"真空度"为相对真空度。 本实用新型技术方案实现的有益效果 本实用新型通过将微型离心管置于本装置的管槽中，有效控制其中液体的温度， 结合真空度小于_5Pa密闭容器使得磷酸酶抑制剂裂解液能较长时间保存，使得裂解和抑 制磷酸化在o-4t:下同时进行，实现了保持原有的蛋白磷酸化状态和组织细胞裂解液的快 速制备。 本装置能在5-6小时内完好保存蛋白的生理状态，可集中收集多个活体组织，还 能稳妥护送组织样本到分子生物实验中心进行磷酸化蛋白微阵列的检测。置于该装置的磷
酸酶抑制剂可在o-4t:的冷藏柜里避光保存l年半。适用于医院活体组织磷酸化蛋白微阵 列的检测，减少对医院纤维镜检部门原有的设置影响和条件要求。
图1为提取活体组织裂解液的装置一实施例的示意图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案，本发明实施例仅用以说明本发明的技
术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员
应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精
神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。 实施例1 结合图l，本发明的一保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置，包括由顶 盖11和容器腔体12组成的密闭容器l，腔体内盛有冷冻液体13，其体积小于容器腔体容 积。管槽4与容器腔体12侧面内壁固定连接，将腔体分为上下两层，12至24个大小相同的 微型离心管2设置于管槽内，各个离心管中盛有裂解液和磷酸酶抑制剂按相同体积混合的 溶液21。 容器腔体侧面设有一个与内腔向连通的抽气口 3。 真空装置通过密闭容器上的开口与容器内腔连接，将内腔中的空气排除，使其真 空度小于-lPa，最后用橡胶塞将抽气口 3封闭。
权利要求一种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置，其特征在于，包括密闭容器，由顶盖和容器腔体组成，腔体内盛有冷冻液体，液体的体积小于腔体的容积；12至24个大小相同的微型离心管，置于密闭容器的腔体内，各个试管中盛有相同体积的裂解液及磷酸酶抑制剂。
2. —种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置，其特征在于包括 密闭容器，由顶盖和双层容器腔体组成，容器腔体内盛有冷冻液体，液体的体积小于腔体的容积；管槽，与容器腔体侧面内壁固定连接，将腔体分为上下两层，12至24个大小相同的微 型离心管设置于管槽内；各个微型离心管中盛有相同体积的裂解液及磷酸酶抑制剂。
3. 根据权利要求1或2所述的保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置，其特 征在于所述磷酸酶抑制剂为钒酸钠溶液，所述裂解液为十二烷基磺酸钠溶液。
4. 根据权利要求1或2所述的保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置，其特 征在于容器腔体侧面和顶盖面设有一个与容器内腔相连通的抽气口 。
5. 根据权利要求1或2所述的保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置，其特 征在于所述密闭容器，腔体内的真空度为-5Pa--10Pa。
专利摘要一种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置，包括由顶盖和容器腔体组成的密闭容器，腔体内盛有冷冻液体；12至24个大小相同的微型离心管，置于密闭容器的腔体内，各个试管中盛有相同体积的裂解液及磷酸酶抑制剂。本装置磷酸酶抑制剂及裂解液有效期14-16个月。使用本装置，能使活检在抑制磷酸酶同时还同步进行组织细胞裂解，蛋白浓度为1-4μg/μl，不测定和校正蛋白浓度，即可直接用于磷酸化蛋白微阵列检测。该方法和装置能保持被检测组织的蛋白磷酸化状态，适合医院等部门的组织镜检需要，简化样本制备步骤及缩短时间，能保证检测组织质和量的一致性，从而能提高了检测速度和数量。实现了快速制备组织细胞裂解液。
文档编号G01N1/28GK201464253SQ20092007162
公开日2010年5月12日 申请日期2009年5月5日 优先权日2009年5月5日
发明者吴建乾, 吴达龙, 周新妹, 宋柱芹, 尹满香, 张成文, 张高忠, 李斌, 杜开齐, 林雪平, 顾旭东 申请人:嘉兴学院;张成文