专利名称：：人α2巨球蛋白ELISA检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本实用新型涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种用于检测人a2巨球蛋白的试剂
背景技术：
：ELISA(酶联免疫吸附实验)是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，可敏感地检测体液中微量的特异性蛋白。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面包被的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法去除固相载体上的游离反应物，再依次加入酶标记的抗原或抗体及底物溶液，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。a2巨球蛋白(a2MG)由肝细胞与单核吞噬细胞系统合成，是血浆中分子量最大的蛋白质。正常情况下a2巨球蛋白是不会从肾小球滤过膜漏出的。当尿液中有ci2巨球蛋白出现，即使是微量的，也提示肾病病情进一步加重，尤其有助于肾小球病变的分析。传统的对a2巨球蛋白的检测设备或检测方法，包括火箭电泳法、免疫散射比浊法、放射性免疫扩散法(RID)和全自动生化分析仪等，有很多弊端。其中，全自动生化分析仪，价格昂贵，一次性投资大，且灵敏度不高，对于极微量a2巨球蛋白的检测准确度不高；火箭电泳法操作比较复杂，并且由于其是通过测量火箭峰的高度或面积来进行定量，所以误差较大，并且稳定性也较差，临床使用较少；免疫散射比浊法是临床比较普遍的检测方法，但只能测定ug/ml以上的含量，很难检测到尿液中微量的a2巨球蛋白，并且需要配备使用大型生化分析仪；而RID法虽然灵敏度较高，但是由于采用放射性同位素，因而不可避免地存在同位素试剂有效期短、放射性污染和操作受限等弊端。
实用新型内容本实用新型要解决的技术问题是提供一种人a2巨球蛋白ELISA检测试剂盒，来检测尿液中人a2巨球蛋白，特别是尿液中极微量人a2巨球蛋白的检测，并且操作简便、成本低。为了解决上述技术问题，本实用新型提供的技术方案是一种人a2巨球蛋白ELISA检测试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，所述固相载体为设置有多个微孔的微孔板，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述包被层是由小鼠抗人a2巨球蛋白单克隆抗体和牛血清白蛋白依次涂布在微孔上形成的。优选的，所述固相载体为96孔聚苯乙烯试剂板(PS)。优选的，所述固相载体为48孔聚苯乙烯试剂板(PS)。本实用新型试剂盒的酶标板微孔上涂布了由小鼠抗人a2巨球蛋白单克隆抗体和牛血清白蛋白组成的包被层，使得本实用新型试剂盒对人a2巨球蛋白的检测质量指标非常好，即灵敏度、特异性和准确度都较高；另外，本实用新型试剂盒还具有操作简便，成本低，试剂稳定，对环境污染小，试验废物易于处理等优点。总之，本实用新型试剂盒适用于尿液中微量人a2巨球蛋白的检测。图1为本实用新型人a2巨球蛋白ELISA检测试剂盒一具体实施例酶标板结构示意图。图2为图1所示酶标板剖视图。固相载体1，固相载体上的微孔2，包被层3。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。如图1所示，本实用新型人a2巨球蛋白ELISA检测试剂盒一具体实施例酶标板结构示意图，固相载体1上有微孔2，其中固相载体1采用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)，当然也可采用48孔聚苯乙烯试剂板(PS)或其他材料。如图2所示，图1所示实施例的酶标板剖视图，包被层3附着在微孔2上。包被层是由小鼠抗人a2巨球蛋白单克隆抗体和牛血清白蛋白依次涂布在微孔上形成的。该具体实施例的试剂盒制备方法是先将作为固相载体的96孔聚苯乙烯试剂板(PS)置于紫外光下辐照2小时，使试剂板板活化；在试剂板微孔上包被一定浓度的小鼠抗人a2巨球蛋白单克隆抗体，4t:过夜，经洗板及牛血清封闭处理后制成包被好的酶标板，以备标本检测。该具体实施例的试剂盒使用方法是依次以生物素化兔抗人a2巨球蛋白多克隆抗体，亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)作为检测试剂A及B，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，完成人a2巨球蛋白(a2MG)ELISA试剂盒的使用。下面通过两个实验来检测该具体实施例的试剂盒的质量指标。实验1:应用人a2巨球蛋白ELISA试剂盒以及大型自动生化分析仪分别定量检测人定值(15.lng/ml，36.5ng/ml，77.lng/ml)尿液标本。1、人a2巨球蛋白(a2MG)ELISA试剂盒方法操作①将试剂盒平衡至室温。②加样分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品(a2MG)或定值样品100ul，覆膜，37t:放置2小时。标准品浓度分别为100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.12ng/ml，1.56ng/ml。③弃去液体，甩干，每孔加检测试剂A工作液100ul，覆膜，37t:放置1小时。④弃去孔内液体，洗板3次，甩干，每孔加检测液试剂B工作液100ul，覆膜，37t:放置1小时。⑤弃去孔内液体，洗板5次，甩干。每孔加TMB溶液90ul，37。C避光显色30分钟。依序每孔加终止溶液50ul，用酶联仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。2、大型自动生化分析仪检测同一上述尿液标本按照仪器要求，上样，运行仪器，仪器自动打出结果。3、结果见表1[0024]表l，应用人a2巨球蛋白(a2MG)ELISA试剂盒对样本1(15.lng/ml)、样本2(36.5ng/ml)和样本3(77.lng/ml)的检测结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>[0026]而应用生化分析仪检测上述样本均显示低于检测限，不能得出有效结果。实验2:临床上会有部分病人尿中a2巨球蛋白含量较高，超过该试剂盒检测限，此时需将样本做适当稀释。本实验即应用人a2巨球蛋白(a2MG)ELISA试剂盒以及大型自动生化分析仪分别定量检测人定值(0.53ug,/ml，3.24ug/ml)尿液标本。操作方法同实验l，但用ELISA方法进行检测时需对标本分别进行20和100倍稀释。结果见表2表2:应用人a2巨球蛋白ELISA试剂盒和生化仪检测法对样本1(0.53ug/ml)和样本2(23.24ug/ml)进行检测的结果。[0030]<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>从表1数据可见，应用ELISA方法能够检测到尿液中极微量的a2巨球蛋白，并且准确度、精密度较高，检测结果较稳定，而生化分析仪对于尿液中微量的a2巨球蛋白检测灵敏度不够，不能得到有效结果。从表2数据可见，当尿液中a2巨球蛋白含量较高，超出试剂盒检测限时，样本需要进行稀释，从实验结果来看，稀释对ELISA结果并未造成明显影响，说明该系统稳定性及回收率较高，也适用于高含量样本的检测，此时生化分析仪也可检测，结果与ELISA结果没有显著性差异。由此可见，针对临床患者a2巨球蛋白含量变化较大的情况，ELISA检测方法与生化分析仪法比较，其适用范围更广。另夕卜，经过对人a2巨球蛋白ELISA检测试剂盒一系列的质量指标检测，包括灵敏度、精密度、特异性、回收率及线性测定，表明该试剂盒检测效果好。与比浊法lug/ml的最低检测限相比，其检测人尿液标本时最低检测限为0.39ng/ml，极大地提高了灵敏度；同时由于采用的是双抗体夹心法，特异性较高；并且回收率为85110%，准确度较高；操作简便，不需要大型自动生化分析仪。相对于放射免疫测定(RIA)技术，该试剂盒具有试剂稳定，对环境污染小，试验废物易于处理等优点。因此该试剂盒适用于尿液中微量人a2巨球蛋白的检测，对于肾功能损伤的早期诊断有重要的临床价值。以上所述实施例仅是为充分说明本实用新型而所举的较佳的实施例，本实用新型的保护范围不限于此。本
技术领域：
的技术人员在本实用新型基础上所作的等同替代或变换，均在本实用新型的保护范围之内。本实用新型的保护范围以权利要求书为准。权利要求一种人α2巨球蛋白ELISA检测试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体为设置有多个微孔的微孔板，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述包被层是由小鼠抗人α2巨球蛋白单克隆抗体和牛血清白蛋白依次涂布在微孔上形成的。2.如权利要求1所述的人a2巨球蛋白ELISA检测试剂盒，其特征在于所述固相载体为96孔聚苯乙烯试剂板。3.如权利要求1所述的人a2巨球蛋白ELISA检测试剂盒，其特征在于所述固相载体为48孔聚苯乙烯试剂板。专利摘要本实用新型提供了一种人α2巨球蛋白ELISA检测试剂盒，包括酶标板，其中酶标板又包括固相载体和包被层，固相载体为设置有多个微孔的微孔板，包被层附着在固相载体的微孔表面，包被层是由小鼠抗人α2巨球蛋白单克隆抗体和牛血清白蛋白依次涂布在微孔上形成的。使用本实用新型检测人α2巨球蛋白时的灵敏度、特异性和准确度都较高；操作简便，不需要大型自动生化分析仪。该试剂盒适用于尿液中微量人α2巨球蛋白的检测，对于肾功能损伤的早期诊断有重要的临床价值。文档编号G01N33/577GK201477100SQ20092016359公开日2010年5月19日申请日期2009年7月6日优先权日2009年7月6日发明者何峰容,李华渊,汪景,章秀波申请人:武汉优尔生科技股份有限公司