测量样品中活化因子Ⅶ含量的方法

专利名称：测量样品中活化因子Ⅶ含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种使用一种血浆来测量样品中活化因子VII (FVIIa)的含量的方 法，该血浆缺少FVII以及至少一种选自于因子VIII (FVIII)、因子IX(FIX)和因子XI (FXI) 的其它因子。
背景技术：
血凝固是一种生物体在血管被伤害时控制出血的机理，并因此避免出血。血凝固在一连串步骤之后发生，该系列步骤包括血液中的不同的酶原和辅因子原 (procofactor)经由蛋白水解酶转换成它们的被活化的形式。在该凝固的连续步骤(或连 串步骤)中，有两种不同的路径，即外源性的凝固路径和内源性的凝固路径。两者都导致被 称之为凝血酶原酶的复合体的形成，该凝血酶原酶由被活化的因子X(FXa)、被活化的因子 V(FVa)、磷脂质以及钙所构成。凝血酶原酶将凝血素活化为凝血酶，使得可溶性的纤维蛋白 原转换成形成血块的不溶性的纤维蛋白。外源性路径包括血浆中存在的FVII的介入。然而，后者必须先被活化成FVIIa以 便开始凝固的连串步骤。单独的FVIIa (未与组织因子复合)表现出低的蛋白水解活性。当 FVIIa与组织因子(TF)，一种在血管损害过程中释放的与磷脂质有关的蛋白复合时，这一 活性被增强。FVIIa-TF复合物在钙离子存在的条件下将因子X转换成因子fe。FVIIa-TF 复合物还将FIX转换成FIXa。反过来，因子DCa和)(a将FVII活化为FVIIa。与因子Va和磷脂质复合的因子 Xa(凝血酶原酶)将凝血素转换成凝血酶。凝血酶作用于纤维蛋白原，将其转换成纤维蛋 白，同时还进行其它活动，包括将因子V活化成因子Va，将因子FVIII活化为FVIIIa。在钙 存在的条件下，凝血酶还将因子XIII活化为能巩固纤维蛋白血块的因子Xllla。虽然在外源性凝固路径中，FIX被FVIIa/TF复合体活化成FIXa，在内源性凝固路 径中，FIXa由FXIa从FIX获得，FXIa本身是通过血液与一负电表面例如内皮下层的接触由 因子XII所活化。因此FVIIa，一种依赖于维生素K的糖蛋白，在导致血块形成的凝固机理中起着显 著的作用。在组织被损害引起出血后所释放的组织因子存在的条件下，即使没有因子VIII 或者IX，FVIIa也具有能够在局部起作用的优点。这就是许多年以来FVIIa被用来治疗某 些凝固失调的原因，这些凝固失调本身通过出血而显示出来。第一种方法是从血浆中获得FVIIa。然而，从血浆中制造FVIIa受到供源可获得性 的限制，且血浆的这一用途具有传播病原体的风险，例如传播朊病毒和病毒。这些问题已经 被诺和诺德药业(Novo Nordisk Pharmaceuticals)开发出的重组FVIIa(rFVIIa)所解决， 该重组FVIIa是结构上类似与血浆FVIIa的一种糖蛋白。rFVIIa的主要治疗适应症(在美国、欧洲和日本)涉及具有成熟抗-因子VIII抗 体的A型血友病患者和具有成熟抗-因子IX抗体的B型血友病患者的自发或手术出血的 治疗。在欧洲，其适应症还涉及对具有先天FVII缺陷的病人以及Glanzmarm血小板机能不全病人的用途。此外，许多出版物报道了 rFVIIa对先天凝血因子缺陷或者血小板机能不全病人 在外科手术过程中控制出血的功效。FVIIa的不断增长的广泛用途导致要更新方法以便(1)测量FVIIa的活性(2)确定FVIIa的浓度(3)测量被活化的FVII的含量用于检测FVII活性的最有名的方法是测量凝固时间、PTT(部分凝血活酶时间)、 aPTT (活化部分凝血激酶时间)、TEG (血栓弹性)和TGT (凝血酶生成测试)。这些方法使得 FVIIa活性的检测成为可能，但是迄今为止都不能直接检测样品中被活化的FVII的含量。市场上有用于FVIIa的免疫学检测的商用试剂盒(IMUBIND因子VII酶联免疫试 剂盒)，但是实施该技术的实验条件难于掌握。事实上这种试剂盒使用复杂，具有非常窄的 动态范围、极其有限的线性检测范围，最重要的是需要在4°C的温度下工作。其它用于检测FVIIa浓度的方法在文献中有描述，例如使用被截断了的重组 TF 来测量其蛋白水解活性(Staclot VIIa-rTF, Stago) (US 5，472，850，US 5,741,658， WO 1992/018870，US 5,750,358，US 5,741,658，US 5,472,850，EP 0 641 443)或者测量 FVIIa-抗凝血酶复合体的浓度(W0 03/004694)。然而，这些方法不非常精确且难于实施。 事实上，由于这些方法仅能同时在低FVIIa浓度下处理很少的样品，形成的血栓使得不能 正确的实施该方法。此外，对由FVIIa所产生的FXa的荧光或显色试验也被发现不适合用于测量FVIIa 浓度，因为它们不能将FVII的影响和FVIIa的影响区分开来。一些生物学家所使用的用来评价FVIIa治疗的功效的方法中，血栓弹力图有时候 被用到。该方法包括通过物理分析血栓的形成与时间的关系来测量全部血浆的物理性质。 根据从血栓弹力图中获得的图(称之为thromboelastogramme: )中提取出的参数，临床 医生能评价患者的凝固能力。尽管精确，该方法冗长，不适合日常重复分析，以及其需要在 取血后一个小时内进行因而难于多多样品进行分析。此外，该方法不能测量样品中的被活 化的FVII含量。测量被活化的FVII含量的最有名的方法包括分别测量FVII+FVIIa的浓度以及 FVIIa的浓度，以便从中推断出被活化的FVII含量(FVIIa浓度/FVII+FVIIa浓度的比率)。 尽管FVII+FVIIa浓度测量是准确的，但是直接的FVIIa浓度的测量仍然不精确和难于操作。因此，需要一种可用的方法，其能有效的容易的使用以测量样品中的被活化的 FVII含量，特别是样品中包含未被活化的因子VII和被活化的因子VII时。

发明内容
申请人:惊奇的发现使用缺少FVII以及缺少选自FVIII、FIX和FXI的至少一种其 它因子的血浆，使得以一种可靠的、可重复的易于实现的方式测量样品中的被活化的FVII 含量成为可能，特别是测量包含未被活化的因子VII以及被活化的因子VII的样品。在本发明的方法中所使用的实验条件因此也使得在样品中的被活化的FVII含量与凝血活酶生成试验(TGT)和获得的凝血酶生成图的某些参数特性之间建立关联成为可 能。这样的关联使得可能通过将所述样品的凝血酶生成图参数与那些从包含已知的 被活化的FVII的含量的组合物中获得的“标准”凝血酶生成图的参数比较而确定被测试样 品中的被活化的FVII含量。因此本发明涉及用于测量测试样品中的被活化的因子VII含量的方法，包括如下 步骤a)将所述测试样品和一种血浆混合，该血浆中缺少因子VII (FVII)和缺少至少一 种选自因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)以及因子XI (FXI)的其它因子，测试样品和血浆的 混合物的最终FVII+FVIIa浓度范围在IOpM至80pM之间，b)添加引发凝血酶生成反应的组分；c)通过对步骤b)的混合物进行凝血酶生成试验(TGT)获得凝血酶生成图；d)将步骤C)的凝血酶生成图的至少一个参数与标准凝血酶生成图的相应的参数 进行比较，该标准凝血酶生成图是基于已知被活化因子VII的含量的标准样品而建立的， 且每个标准样品之间的被活化因子VII的含量不相同；e)从步骤d)推断出测试样品中的被活化因子VII含量的测量结果。本发明的方法可选择的包含一另外的步骤f)，包括从步骤e)中确定的含量计算 出所述测试样品中的被活化的因子VII的浓度。优选的，标准凝血酶生成图是通过对一个包含下列物质的混合物进行凝血酶生成 试验而获得的(i)已知被活化的因子VII含量的标准样品，(ii)不含有FVII且不含有选自FVIII、FIX和FXI的至少一种其它因子的血浆， 标准样品+不含有FVII且不含有选自FVIII、FIX和FXI的至少一种其它因子的血浆的混 合物的最终浓度基本上等同于测试样品+不含有FVII且不含有选自FVIII、FIX和FXI的 至少一种其它因子的血浆的混合物的最终浓度，以及(iii)引发凝血酶生成反应的组分。有利的，当所述血浆中不含有FVII和FIV或者不含有FVII和FXI时，被比较的凝 血酶生成图参数选自于滞后时间、峰值时间和速度；当所述血浆中不含有FVII和FVIII时， 被比较的凝血酶生成图参数选自于滞后时间、峰值时间。优选的，测试样品+血浆和标准样品+血浆混合物使用相同的不含有FVII且不含 有至少一种选自FVIII、FIX和FXI中的其它因子的血浆。有利的，引发凝血酶生成的组分包含组织因子(TF)、磷脂质和Ca2+，所述组织因子 在样品+血浆+引发组分混合物中的最终浓度范围在I-IOpM之间，所述磷脂质在样品+血 浆+引发组分混合物中的最终浓度范围在0. 1-5 μ M之间，所述Ca2+在样品+血浆+引发组 分混合物中的最终浓度范围在14-18mM之间。有利的，被测量含量的被活化因子FVII源自于血浆(pFVI I a)、源自于重组 (rFVIIa)或者源自于转基因(TgFVIIa)。在本发明的一个特别具体方式中，测试样品是转基因哺乳动物的奶样品或者无血 清的细胞培养基样品。
本发明还涉及不含有FVII且不含有至少一种选自于FVIII、FIX和FXI的其他因 子的血浆用于测量测试样品中的被活化的FVII含量的用途。本发明的详细描述本发明的上下文中，“因子VII”或者“FVII”指的是对应于不能引发凝固的单链酶 原的未被活化的因子VII。“被活化的因子VII”或者“被活化的FVII”，或者FVIIa指的是单链蛋白(酶)，包 含一重链和一轻链，两者通过一双硫桥连接在一起，其由FVII (酶原)的断裂而获得的，并 且证明具有引发血液凝固的能力。“FVII+FVIIa”指的是目标样品中存在的FVII和FVIIa的浓度总和或者数量总 和。FVII和FVIIa的数量或者浓度总和能通过例如使用市售试剂盒例如斯达戈诊断公司的 asserachrom; vii :Ag(参考OOMl)进行免疫检测而进行测量。“被活化的因子VII含量”或者“FVIIa含量”指的是目标样品中的被活化的因 子VII (FVIIa)的数量或浓度分别与该相同的目标样品中的因子VII和被活化的因子 VII (FVII+FVIIa)的数量或浓度总和之间的比率。对于一个样品中只包含FVIIa，不含有 FVII，被活化的FVII含量将等于1(即100% )，对于其中包含的FVIIa和FVII同样多的样 品，该含量将等于0. 5(即50% )，对于仅包含FVII的样品(不包含FVIIa)，该含量将等于 0(艮P 0% )。“测试样品”指的是一样品中，包含FVII、被活化的FVII或者它们的混合物，但是 其被活化的FVII含量未知。有利的，测试样品是从血液或血浆纯化而来，或者源自于体液， 经纯化或者未经纯化，例如哺乳动物奶、培养基或者细胞勻浆。在一个特别的实施方式中，测试样品是哺乳动物的奶样品，特别是来自于在其奶 中产生FVII和/或FVIIa的转基因哺乳动物的奶样品。在另一个实施方式中，测试样品是无血清的细胞培养基。根据本发明的一个实施方式，要被测试的样品是一液体形式或者冻干形式的治疗 剂或非治疗剂样品，包含源自血浆的FVIIa(pFVIIa)、源自重组的FVIIa(rFVIIa)或者源自 转基因的FVIla(TgFVIla)、和FVII或者上述的混合物。“标准样品”指的是一种样品，其中被活化的FVII含量是已知的和/或选择的， 在一感兴趣的溶液中含有合适数量或浓度的国际标准FVII (人类血凝固因子VII浓缩物， NIBSC引用号97/592)或者国际标准被活化的FVII (人类血凝固因子VIIa浓缩物，NIBSC 引用89/688)，或者上述的混合物，以便获得期望含量的被活化的FVII。测试样品还可以是 从是从血液或血浆中获得的，或者源自于体液，经纯化或者未经纯化的，例如哺乳动物奶、 培养基或者细胞勻浆。本发明上下文中所使用的血浆来源于动物，优选来源于哺乳动物和优选的来源于 人。本发明的意图之中，术语“耗尽”或“缺少”指的是相同意思并可以替换使用，表示 耗尽目标溶液(例如血浆)中的一化合物(例如血液凝固因子)，直至后者的存在变得检测 不到。因此术语“缺少FVII且缺少至少一种选自FVIII、FIX或者FXI中的因子的血 浆”指的是当使用本领域技术人员所公知的检测方法检测它们的浓度时，这些因子FVII、FVIII、FIX或者FXI中的每个在血浆中各自的浓度低于它们的检测阈。检测方法的例 子可以是使用那些市售试剂盒或者试剂(例如ASSERACHROM: VII 斯达戈诊断公司 的 ASSERACHROM VII :Ag(参考 OOMl)或者 KORDIA 的因子 VII 的 ELISA 套装(参考 FVII-EIA))的方法。优选的，血浆中FVII的检测阈是大约lmUI/ml (0. 5ng/ml)，低于该浓度的FVII不 能被检测出。优选的，血浆中FVII的检测阈是大约10mUI/ml (lng/ml)，低于该浓度的FVII不能 被检测出。优选的，血浆中FIX的检测阈是大约0. 2mUI/ml (lng/ml)，低于该浓度的FIX不能 被检测出。优选的，血浆中FXI的检测阈是大约0. 5mUI/ml (2. 5ng/ml)，低于该浓度的FXI不 能被检测出。耗尽血浆中目标因子的技术包括本领域技术人员公知的所有技术。排除技术例如 特别是免疫耗竭、化学耗竭以及后者的组合。免疫耗竭包括使用特别针对溶液中所包含的一种抗原的抗体以便实质上耗尽所 述溶液中的目标抗原。用于进行免疫耗尽的抗体可以是多克隆的和/或单克隆的，源自于 单个的或不同的细胞克隆。使用的抗体能直接针对期望清除的抗原，或者针对与该抗原结 合的蛋白质。分别使用抗-FVII、抗-FIX或者抗-FXI抗体能够因此而获得耗尽了 FVII、FIX或 者FXI的血浆。使用抗-FVIII抗体或者针对凝血因子的抗体，一种在血液中传输FVIII的血浆蛋 白，能够因此获得缺乏FVIII的血浆。由于FVIII是一种Ca2+依赖因子，使用EDTA(乙二胺四乙酸)通过化学耗竭也能 获得耗尽了 FVIII的血浆。然后通过本领域技术人员公知的方法清除EDTA，例如通过透析清除。有利的，用于进行本发明的血浆是一种缺少因子VII以及缺少至少一种选自于 FVIII、FIX和FXI的其它因子的血浆。有利的，用于进行本发明的血浆是从自然缺少FVIII的A型血友病患者的血浆、从 自然缺少FIX的B型血友病患者的血浆、或者从表现缺少因子XI的病人的血浆中制备的， 然后通过免疫学或者化学方法例如上述的方法对这些自然缺少FVIII、FIX或者FXI的血浆 进行FVII耗尽。在本发明的另一实施方式中，使用的血浆是从正常血浆中制备的，先FVII耗尽， 然后接着耗尽FVIII和/或FIX和/或FXI。在本发明的意图内，“引发凝血酶生成反应的组分”或者“引发组分”指的是使得开 始从凝血酶原中生成凝血酶的不可缺少的组分。引发凝血酶生成反应的组分基本上包含足以引发凝血酶生成反应的浓度的钙离 子源(Ca2+)、磷脂试剂以及组织因子(TF)。本发明的上下文中合适的钙离子源对应的是钙离子的任一生物相容性源，例如 CaCl20钙离子源可以即时于其它引发凝血酶生成反应的组分一起添加到样品/血浆混合物中，或者以延迟的方式加入，例如在添加了其它引发凝血酶生成反应的组分之后加入。本发明的意图之内，足够浓度的钙离子指的是钙离子在样品+血浆+引发组分混 合物之中的最终浓度范围在14-18mM，特别的是等于16. 7mM。适合用于本发明的磷脂试剂可以是浓缩物或者冻干产品的形式，优选的由一混合 物组成，该混合物包含大部分的卵磷脂和磷脂酰丝氨酸或者仅包含卵磷脂和磷脂酰丝氨酸。本发明的意图之内，足够浓度的磷脂试剂指的是磷脂试剂在样品+血浆+引发组 分混合物之中的最终浓度范围在0. 1-5 μ Μ，特别是0. 5-2 μ Μ,以及更特别的是等于1 μ Μ。适合用于本发明的组织因子(TF)能够选自于任何天然的、血浆的、重组或转基因 组织因子、任何改性的组织因子包括任何被截断了的失去了其活化因子VII为因子VIIa功 能的组织因子，只要所述的改性组织因子保留了，甚至是部分保留了其用作因子VIIa的酶 活性的辅因子的能力，所组成的组。合适的改性组织因子可以例如是跨膜区被删除的例如 市售的斯达戈诊断公司的STACL0T试剂盒的组织因子(参考0(^81)。本发明的意图之内，足够浓度的组织因子指的是组织因子在样品+血浆+引发组 分混合物之中的最终浓度范围在1-ΙΟρΜ，特别是4-6ρΜ，以及更特别的是等于5ρΜ。本发明的上下文中，测试样品、标准样品、缺少FVII和至少一种选自与FVIII、FIX 或FXI的其它因子的血浆、和/或引发凝血酶生成反应的组分可以是液体或冻干形式的。当 它们是冻干形式时，这些化合物能够有利的在进行本发明的方法之前，放置在合适水溶剂 之中的悬浮液中，例如注射用纯化水中。因此申请人开发了一种基于特定实验条件的用于测量测试样品中被活化的因子 VII含量的方法，该特定实验条件使得能够克服由于测试样品中非被活化的FVII存在而导 致的不利条件。该方法的第一步包括将包含一未知被活化FVII含量的测试样品和一缺少FVII及 缺少FVIII和/或FIX和/或FXI的血浆混合，获得的混合物中的最终FVII+FVIIa浓度在 IO-SOpM的范围内。所使用的血浆的种类以及浓度范围的特定的性质组合使得实现根据本 发明测量被活化的FVII含量的方法成为可能。然后向测试样品+血浆混合物中添加引发凝血酶生成反应的组分，以引发断裂反 应，其导致血浆中包含的凝血酶原生成凝血酶。然后进行凝血酶生成试验。凝血酶生成试验(TGT)是本领域技术人员公知的试验(Thrombin generation assays :accruing clinical relevance,H. C Hemker,R. Al Dieri & S. Beguin,Curr. Opin. Hematol.，2004，11，170-5)，当目标样品与引发凝血酶生成反应的组分接触时，其使得能够 以连续的方式测量生成的凝血酶的数量以及生成该凝血酶所必须的时间。当目标样品(或者包含后者的溶液)与开始该反应的组分接触时，凝血酶生成试 验开始。该对应于凝血酶生成开始的开始时间被称为、。然后通过使用显示试剂而显示生成的凝血酶，优选的是通过使用荧光试剂，其被 凝血酶所降解而引起出现荧光化合物，或者通过使用显色试剂。有利的，荧光试剂或者显色 试剂与引发凝血酶生成反应的组分同时加入到样品+血浆混合物中。通过一测量装置例如荧光剂探测被新生成的凝血酶降解荧光试剂所获得的荧光。 优选的，使用的荧光剂具有记录装置或者描绘荧光随着时间变化的装置。通过荧光剂采集的数据使得能够建立荧光于时间的变化曲线，被称之为凝血酶生成图。从凝血酶生成图可以测量出四种推断参数-峰高，表达为凝血酶的nM，对应于反应过程中在时间tmax时产生的最大凝血酶浓 度；-滞后时间，表达为分，对应于凝血酶生成测试开始时(、)与凝血酶出现时之间的 过去的时间。-峰值时间，表达为分，对应于TGT开始(、)与对应于产生凝血酶最大的时间tmax 之间过去的时间；-速度，表达为形成的凝血酶nM/分，对应于峰高除以峰值时间tmax与滞后时间之 间的差值。有利的，通过用于测量凝血酶形成的装置可以直接获得这些参数。目标样品中的FVIIa含量越高，产生的凝血酶更快，峰值时间更短，速度更快。为了确定测试样品的被活化FVII含量，从包含已知被活化FVII含量的标准样品 中获得标准凝血酶生成图。如上所述为了测试样品，至少两种包含不同被活化的FVII含量 的标准样品与一缺少FVII和缺少至少一种选自FVIII、FIX和FXI的因子的血浆混合。然 后象标准样品+血浆混合物中加入引发凝血酶生成反应的组分以开始凝血酶生成测试以 及获得对应于每个标准样品的标准凝血酶生成图。 标准样品+血浆混合物中的FVII+FVIIa浓度在IOpM至80pM之间。优选的，标准样 品+血浆混合物中的FVII+FVIIa浓度基本上等于测试样品+血浆混合物中的FVII+FVIIa 浓度。有利的，与标准样品混合的血浆等同于与测试样品混合的血浆。根据获得的标准凝血酶生成图，在包含在每个标准样品中的被活化的FVII的含 量和从凝血酶生成图中推断出的一个参数之间进行插值。进行的插值可以是线性的、几何学的、立方的、多项式的、拉格朗日或者牛顿型的。有利的，进行插值对应于滞后时间的变化与标准样品中的被活化的FVII含量的 函数、峰值时间变化与标准样品中被活化的FVII含量的函数或者速度的变化与标准样品 中被活化的FVII含量的函数。测试样品中包含的被活化的FVII的含量是通过将从该测试样品的凝血酶生成图 中推断出的至少一个参数转换为标准凝血酶生成图中进行的一个对应的插值而确定的。如 果被转换的参数是滞后时间，所使用的插值将对应于滞后时间的变化与标准样品中被活化 的因子VII含量的函数。如果被转换的参数是峰值时间，所使用的插值将对应于峰值时间 的变化与标准样品中被活化的因子VII含量的函数。最后，如果被转换的参数是速度，所使 用的插值将对应于速度的变化与标准样品中被活化的因子VII含量的函数。从插值中确定的因子VII含量因此对应于测试样品中的被活化的因子VII含量。被发明的方法可以包括一另外步骤，包括从根据插值确定的被活化的因子VII含 量计算出测试样品中被活化的因子VII的浓度。在这一特定情况中，被活化的因子VII的 浓度通过下列公式给出FVIIa 浓度=FVIIa 含量 X (FVII+FVIIa 浓度)下列实施例阐述本发明，并不限制本发明的范围。


图 1 最终FVII+FVIIa在标准样品/血浆混合物中的浓度为50pM的条件下获得的标准 凝血酶生成图，血浆缺少FVII和FVIII，被活化的FVII的含量在0-100%的范围内(5pM组 织因子和1 μ M磷脂质)图 2 禾口 2a:滞后时间和峰值时间分别随着标准样品中被活化的FVII含量的变化，血浆缺少 FVII和FVIII，最终FVII+FVIIa浓度为50pM(5pM组织因子和1 μ M磷脂质)。图 3 最终FVII+FVIIa在标准样品/血浆混合物中的浓度为50pM的条件下获得的标准 凝血酶生成图，血浆缺少FVII和FIX(5pM组织因子和IyM磷脂质)。图 4、5 禾口 6:滞后时间、峰值时间和速度分别随着标准样品中被活化的FVII含量的变化，血浆 缺少FVII和FIX，最终FVII+FVIIa浓度为50pM(5pM组织因子和1 μ M磷脂质)。图 7 最终FVII+FVIIa在标准样品/血浆混合物中的浓度为50pM的条件下获得的标准 凝血酶生成图，血浆缺少FVII和FXI (5pM组织因子和1 μ M磷脂质)。图 8、9、10 和 11:滞后时间、峰值时间、峰高和速度分别随着标准样品中被活化的FVII含量的变 化，血浆缺少FVIII和FXI，最终FVII+FVIIa浓度为50pM(5pM组织因子和1 μ M磷脂质)。图12:最终FVII+FVIIa在标准样品/血浆混合物中的浓度为IOpM的条件下获得的标准 凝血酶生成图，血浆缺少FVII和Fill (5pM组织因子和1 μ M磷脂质)。图 13、14、15 和 16 滞后时间、峰值时间、峰高和速度分别随着标准样品中被活化的FVII含量的变 化，血浆缺少FVII和FIII，最终FVII+FVIIa浓度为IOpM(5pM组织因子和1 μ M磷脂质)。图17:最终FVII+FVIIa在标准样品/血浆混合物中的浓度为SOpM的条件下获得的标准 凝血酶生成图，血浆缺少FVII和Fill (5pM组织因子和1 μ M磷脂质)。图 18 和 19:滞后时间和峰值时间分别随着标准样品中被活化的FVII含量的变化，血浆缺少 FVII和FVIII，最终FVII+FVIIa浓度为80pM(5pM组织因子和1 μ M磷脂质)。
具体实施例方式实施例1 制备缺少FVII的血號使在兔子中产生的针对纯化的人类血浆FVII的多克隆抗体连接到CNBr-活化琼 脂糖(法玛西亚(Pharmacia))，然后将获得的2ml凝胶放置于柱中。用25ml的平衡缓冲液 (0. 15MNaCL，10mM柠檬酸盐，pH7. 4)对柱进行平衡。然后，6mL的人类血浆多次通过该柱。 在这些条件下，FVII被保留固定在柱上，回收洗脱液(缺少FVII的血浆)。用20mL的再生缓冲液(50mMNaCl ；0. IM甘氨酸，pH2. 4)洗脱被固定的FVII，从而再生柱，然后用20mL平衡 缓冲液(IOmM柠檬酸盐；0. 15MNaCl, pH7. 4)对柱进行再平衡。实施例2 制备缺少FVII和FVIII、FIX或者FXI的血浆使在兔子中产生的针对纯化的人类血浆FVII的多克隆抗体连接到CNBr-活化 琼脂糖(法玛西亚(Pharmacia))，然后将获得的2ml凝胶放置于柱中。用25ml的平衡缓 冲液(0. 15MNaCL，10mM柠檬酸盐，pH7. 4)对柱进行平衡。然后，6mL的从斯达戈诊断公司 (Diagnostica Stago)获得的市售的已经耗尽FVIII、FIX或者FXI的血浆数次通过柱。在 这些条件下，FVII被保留固定在柱上，回收洗脱液(缺少FVII和FVIII、FIX或者FXI的血 浆)。用20mL的再生缓冲液(50mMNaCl ；0. IM甘氨酸，pH2. 4)洗脱被固定的FVII，从而再 生柱，然后用20mL平衡缓冲液(IOmM柠檬酸盐；0. 15MnaCl, pH7. 4)对柱进行再平衡。实施例3 从缺少FVII和FVIII的血浆制备标准凝血酶牛成图，FVII+FVIIa的浓 度为50dM取得NIBSC供应的国际标准FVII (SI-FVII)和/或同样是由NIBSC供应的 FVIIa(SI-FVIIa)的足量体积样品，以便获得包含已知被活化的FVII含量的标准样品，将 其加入到80 μ L的缺少FVII和FVIII的血浆中(缺少FVIII的血浆是从斯达戈诊断试剂 公司获得，或者是A型血友病患者血浆，然后对其如实施例2中那样进行FVII耗尽)，以便 获得包含0%至100%之间的固定的被活化的FVII含量的混合物，包含的FVII+FVIIa浓度 在IOpM至SOpM之间。向包含血浆和样品的混合物中加入20 μ L的引发凝血酶生成反应的 因子(Ca2+，磷脂质和TF)，最终浓度为5pMTF、l μ M的磷脂质、(斯达戈诊断试剂公司86195 试剂以1 4稀释)和16. 7mM Ca2+、和20 μ L的凝血酶特异性荧光试剂(斯达戈诊断试剂 公司86197Fluca试剂盒试剂)。对在0%至100%之间的固定的已知被活化FVII含量建立TGT标准曲线(标准凝 血酶生成图)，以便获得提供各种参数(滞后时间、峰高、峰值时间和速度)的标准凝血酶 生成图。使用装备有用于产生凝血酶生成图软件(Thrombinoscope BV)的用于测量凝血酶 形成时间(Fluoroskan-Thermo Electron)的荧光测定装置建立凝血酶生成图，激发波长 390nm，传输波长460nm。图1所示是获得的标准凝血酶生成图，其是在50pM的最终FVII+FVIIa在血浆/ 样品混合物中以及在0-100%之间的可变的被活化的FVII含量的条件下获得的。观察到滞 后时间和峰时的凝血酶生成时间随着被活化的FVII含量的增加而降低。对于100%的被活 化因子含量，峰值时间到达预计为14分钟的极限。注意到未被添加FVII或者FVIIa的缺 少FVII和FVIII的血浆不引起凝血酶生成。图2和加分别表明滞后时间和峰值时间随着样品中的被活化的FVII含量而变 化。获得的结果表明能够在样品中被活化的FVII含量和从50pM的FVII+FVIIa在血 浆/样品的混合物中的浓度的凝血酶生成图中推断出的各种参数之间建立关联。实施例4 从缺少FVII和FVIX的血浆制备用于50pM的FVII+FVIIa浓度的标准 凝血酶生成图重复实施例3中的实验，但使用的是斯达戈诊断试剂公司的缺少FIX的反应性血 浆，然后根据实施例1和2的步骤对其进行FVII耗尽。
图3所示是50pM的FVII+FVIIa在血浆/样品的混合物中获得的凝血酶生成图， 所述血浆缺少FVII和FIX。观察到滞后时间和峰时的凝血酶生成时间随着被活化的FVII 含量的增加而降低。对于100%的被活化FVII含量，峰值时间到达预计为16分钟的极限。 注意到未被添加FVII或者FVIIa的缺少FVII和FVIX的血浆不引起凝血酶生成。图4、5和6分别表明滞后时间、峰值时间和速度随着样品中被活化的FVII含量而 变化。获得的结果表明能够在样品中被活化的FVII含量和从50pM的FVII+FVIIa在血 浆/样品的混合物获得的凝血酶生成图中推断出的各种参数之间建立关联，所述血浆缺少 FVII 禾口 FIX。实施例5 从缺少FVII和FXI的血浆制备用于50dM的FVII+FVIIa浓度的标准凝 血酶牛成图重复实施例3中的实验，但使用的是斯达戈诊断试剂公司的缺少FXI的反应性血 浆，然后根据实施例1和2的步骤对其进行FVII耗尽。图7所示是50pM的FVII+FVIIa在血浆/样品的混合物中获得的凝血酶生成图， 所述血浆缺少FVII和FXI。观察到滞后时间和峰时的凝血酶生成时间随着被活化的FVII 含量的增加而降低。对于100%的被活化FVII含量，峰值时间到达预计为12分钟的极限。 注意到未被添加FVII或者FVIIa的缺少FVII和FXI的血浆不引起凝血酶生成。图8、9、10和11分别表明滞后时间、峰值时间、峰高和速度随着样品中被活化的 FVII含量而变化。获得的结果表明能够在样品中被活化的FVII含量和从50pM的FVII+FVIIa在血 浆/样品的混合物获得的凝血酶生成图中推断出的各种参数之间建立关联，所述血浆缺少 FVII 禾口 FXL·实施例6 从缺少FVII和FVIII的血浆制备用于IOpM的FVII+FVIIa浓度的标准 凝血酶生成图重复实施例3中的实验，但是使用IOpM的最终FVII+FVIIa浓度。图12所示是IOpM的FVII+FVIIa在血浆/样品的混合物中获得的凝血酶生成图， 所述血浆缺少FVII和FVIII。观察到滞后时间和峰时的凝血酶生成时间随着被活化的FVII 含量的增加而降低。对于100%的被活化FVII含量，峰值时间到达预计为21分钟的极限。 注意到未被添加FVII或者FVIIa的缺少FVII和FVIII的血浆不引起凝血酶生成。图13、14、15和16分别表明滞后时间、峰值时间、峰高和速度随着样品中被活化的 FVII含量而变化。获得的结果表明能够在被活化的FVII含量和从IOpM的FVII+FVIIa在 血浆/样品的混合物获得的凝血酶生成图中推断出的各种参数之间建立关联，所述血浆缺 少 FVII 和 FVIII。实施例7 从缺少FVII和FVIII的血浆制备用于80pM的FVII+FVIIa浓度的标准 凝血酶生成图重复实施例3中的实验，但是使用80pM的最终FVII+FVIIa浓度。图17所示是SOpM的FVII+FVIIa在血浆/样品的混合物中获得的凝血酶生成图， 所述血浆缺少FVII和FVIII。观察到峰时的凝血酶生成时间随着被活化的FVII含量的增 加而降低。对于100%的被活化FVII含量，峰值时间到达预计为12分钟的极限。注意到未被添加FVII或者FVIIa的缺少FVII和FVIII的血浆不引起凝血酶生成。图18和19分别表明滞后时间和峰值时间随着样品中被活化的FVII的含量而变 化。获得的结果表明能够在样品中被活化的FVII含量和从80pM的FVII+FVIIa在血 浆/样品的混合物获得的凝血酶生成图中推断出的各种参数之间建立关联，所述血浆缺少 FVII 和 FVIII。^MM 8 句,含FVII的令,奶样品中的被活化FVII含量的测丨量要测试的样品的被活化的FVII含量已知，其FVII+FVIIa浓度是500pM。将8 μ L体积的该要测试的样品与72 μ L的如前所述的缺少FVII和FVIII的血浆 混合。因此获得用于测试的反应混合物，其体积是80yL，FVII+FVIIa浓度是50ρΜ。然后， 加入20 μ 1的引发凝血酶生成反应的组分(磷脂质和TF)，最终浓度为5ρΜ的TF、1 μ M的磷 脂质(斯达戈诊断试剂公司86195试剂以1 4稀释)，和加入20 μ 1的凝血酶特异性钙质 荧光试剂(最终浓度为16. 7mM Ca2+)(斯达戈诊断试剂公司86197 Fluca试剂盒试剂)。进行TGT以获得凝血酶生成图以及对应的各种参数滞后时间和峰值时间。同时，混合FVII和FVIIa样品(NIBSC供应的国际标准FVII和FVIIa)以获得标 准样品，其被活化的FVII含量已知，并且在0%至100%之间。这些标准样品与如上所述 的缺少FVII和FVIII的血浆混合，以获得FVII+FVIIa浓度为50pM。然后，向样品/血浆 混合物中加入引发凝血酶生成反应的组分(磷脂质和TF)，以获得最终浓度为5pM的TF和 ΙμΜ的磷脂质(斯达戈诊断试剂公司86195试剂以1 4稀释)。最后，向前述混合物中 加入20 μ 1的凝血酶特异性钙质荧光试剂(最终浓度为16. 7mM Ca2+)(斯达戈诊断试剂公 司86197 Fluka试剂盒试剂)。测量标准凝血酶生成图的参数以绘出每个参数与被活化的 FVII含量的log值的标准曲线(参见图1和加以及表1)。从包含要被测试的样品的混合物的凝血酶生成物中获得的参数值被转移成各种 标准曲线，使得能够推断出要被测试的样品中的被活化的FVII含量的测量值。获得的滞后 时间为6分钟30秒，峰值时间为18分钟，通过转移这些值到各种标准曲线，推断出样品中 的被活化的FVII含量的测量值等于20%。重复实施例3中的实验，但是用包含的人类血清白蛋白的Owren-Koller缓冲 液(0K缓冲液-1% HSA)或者包含兔奶的OK缓冲液-1% HSA预先稀释包含已知被活化的 FVII含量的标准样品。图20所示是获得的标准凝血酶生成图，其是在50pM的最终FVII+FVIIa在血浆/ 样品混合物中以及在0-100%之间的被活化的FVII含量的条件下获得的。观察到预先以 OK缓冲液-1 % HSA稀释的样品和预先以包含兔奶的OK缓冲液-1 % HSA稀释的样品的凝血 酶生成图完美重叠，这能推断出兔奶对TGT没有影响。注意到未被添加FVII或者FVIIa的 缺少FVII和FVIII的血浆不引起凝血酶生成。图21、22和23分别为凝血酶生成图、滞后时间和峰值时间随着已知固定的在0% 至100%之间的被活化FVII含量的包含兔奶的Tp OK-I % HSA预先稀释样品中的被活化的 FVII含量的变化图。获得的结果证明，跟实施例3 —样，能够在包含兔奶的样品中的被活化的FVII含量和FVII+FVIIa在血浆/样品的混合物中的浓度为50pM的凝血酶生成图中推断出的各种 参数之间建立关联。
权利要求
1.用于检测测试样品中被活化的因子VII的含量的方法，包括下列步骤a)将所述测试样品和一种血浆混合，该血浆中缺少因子VII(FVII)且缺少至少一种选 自因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)以及因子XI (FXI)的其它因子，测试样品和血浆的混合 物的最终FVII+FVIIa浓度范围在IOpM至80pM之间；b)添加引发凝血酶生成反应的组分；c)通过对步骤b)的混合物进行凝血酶生成试验(TGT)获得凝血酶生成图；d)将步骤c)的凝血酶生成图的至少一个参数与标准凝血酶生成图的相应的参数进行 比较，该标准凝血酶生成图是基于标准样品而建立的，标准样品中被活化因子VII的含量 是已知的，且每个标准样品之间的被活化因子VII的含量不相同；e)从步骤d)推断出测试样品中的被活化因子VII含量的测量结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述标准凝血酶生成图中的每一个是通过对包含 下列组分的混合物进行凝血酶生成试验而获得的(i)已知被活化的因子VII含量的标准样品；(ii)一种缺少FVII且缺少至少一种选自FVIII、FIX和FXI的其它因子的血浆，标准 样品+血浆混合物中的最终FVII+FVIIa浓度基本上等于测试样品+血浆混合物中的最终 FVII+FVIIa浓度；以及(iii)引发凝血酶生成反应的组分。
3.根据权利要求1-2中任一所述的方法，其中，步骤d)中，所述被比较的凝血酶生成图 参数选自于滞后时间、峰值时间和速度。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述血浆缺少FVII和FIX，或者缺少FVII和FXI。
5.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其中，步骤d)中，所述被比较的凝血酶生成图 参数选自于滞后时间和峰值时间。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述血浆缺少FVII和FVIII。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其中，测试样品+血浆和标准样品+血浆混合 物是使用相同的缺少FVII且缺少至少一种选自FVIII、FIX和FXI的其它因子的血浆而获 得的。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其中，所述引发凝血酶生成反应的组分包含 组织因子(TF)、磷脂质和Ca2+，所述组织因子在样品+血浆+引发组分的混合物中的最终浓 度范围在I-IOpM之间，所述磷脂质在样品+血浆+引发组分的混合物中的最终浓度范围在 0. 1-5 μ M之间，所述Ca2+在样品+血浆+引发组分的混合物中的最终浓度范围在14-18mM 之间。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其中，测试样品是转基因哺乳动物的奶样品 或者无血清的细胞培养基样品。
10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其中，被测量含量的被活化因子FVII源自于 血浆(pFVIIa)、源自于重组(rFVIIa)或者源自于转基因(TgFVIIa)。
11.根据权利要求1-10中任一所述的方法，包含一另外的步骤f)，步骤f)包括根据步 骤e)中确定的含量计算出所述测试样品中的被活化的因子VII的浓度。
12.缺少FVII且缺少至少一种选自于FVIII、FIX和FXI的其他因子的血浆用于测量 测试样品中的被活化的FVII含量的用途。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测测试样品中活化因子VII含量的方法，包括下列步骤a)将所述测试样品和一种血浆混合，该血浆中缺少因子VII(FVII)且缺少至少一种选自因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)以及因子XI(FXI)的其它因子，测试样品和血浆的混合物的最终FVII+FVIIa浓度范围在10pM至80pM之间；b)添加引发凝血酶生成反应的组分；c)通过对步骤b)的混合物进行凝血酶生成试验(TGT)获得凝血酶生成图；d)将步骤c)的凝血酶生成图的至少一个参数与标准凝血酶生成图的相应的参数进行比较，该标准凝血酶生成图是基于标准样品而建立的，标准样品中被活化因子VII的含量是已知的，且每个标准样品之间的被活化因子VII的含量不相同；e)从步骤d)推断出测试样品中活化因子VII含量的测量结果。
文档编号G01N33/86GK102084254SQ200980126069
公开日2011年6月1日 申请日期2009年6月29日 优先权日2008年7月2日
发明者克劳丁·马聚里耶, 多米尼克·格瑞尼尔, 莉西安·希尔伯特 申请人:Lfb生物科技公司