糖链识别受体的新用途的制作方法

专利名称：糖链识别受体的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为糖链识别受体而已知的巨噬细胞可诱导的C型凝集素(Mincle ； Macrophage inducible C-type lectin)的新用途。详细而言，本发明涉及通过抑制 Mincle的表达或功能(与由非稳态死细胞释放的蛋白或Fc受体共通、亚单元(FcRy)的相互作用)而进行的炎症反应的抑制；以Mincle的表达或功能为指标的炎症反应的调节物质、特别是具有抗炎作用的物质的筛选方法；以及以与由死细胞释放的Mincle发生相互作用的蛋白为指标的非稳态细胞死亡的诊断。
背景技术：
在生理学的程序性细胞死亡中，趋于死亡的细胞并未诱发炎症、而是迅速被吞噬细胞吞噬并消化(非专利文献1)，相对于此，在由放射线照射或组织损伤等非感染性刺激引起的过剩或非稳态的细胞死亡中，诱发嗜中性粒细胞在组织中的一过性浸润(非专利文献2)。细胞识别该过剩或非稳态的细胞死亡、并作出适当响应的分子机理尚未充分明了。有报道称先天性免疫受体的Toll样受体(TLR)家族识别透明质酸 (hyaluronan)、热休克蛋白(HSI3s)、尿酸、纤连蛋白、心磷脂以及核小体和核内低分子核糖核蛋白(snRNPs)等DNA/RNA-蛋白复合体等由死细胞释放的自身配体(非专利文献3)。研究显示在这些TLR-自身配体相互作用中，有几种与炎症性疾病有关。虽然C型凝集素是另一家族而非TLR家族的受体，但其能够参与死细胞的感知。这些受体作为病原体糖链的模式识别受体(PRR)，在免疫中具有明确的作用。并且，最近的证据提示这些受体还能够识别蛋白、脂类、无机质等配体。除了发挥PRR的作用以外，在骨髓性细胞中表达的C型凝集素中，有几种凝集素还发挥死细胞的受体的作用(非专利文献4)。 其中大多数是促进死细胞的清除的吞噬细胞的受体。在C型凝集素受体中，Mincle(还作为(16(3如或(1608€9而已知)是在巨噬细胞中表达的2型跨膜C型凝集素受体。以前的报道显示在几种刺激和细胞胁迫时，Mincle 的转录上升，并通过转录因子NF-IL6(C/EBPi3)来调节表达(专利文献1、非专利文献5)， 但Mincle的生理学功能或其生理配体尚不清楚。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特开2001-112482公报非专利文献非专利文献1 J Clin Invest 108，957-62 (2001)非专利文献2 :0ncogene 20，7085-95 (2001)非专利文献3:Nat Rev Immunol 6，823-35 (2006)非专利文献4:Nat Immunol 7，1258-65 (2006)非专利文献5 :J Immunol 163,5039-48(1999)

发明内容
发明所要解决的课题本发明的目的在于鉴定识别未被程序化的过剩或非稳态的细胞死亡、并与诱发炎症响应的机理有关的新型分子、特别是识别由死细胞释放的自身配体的受体分子；提供通过调节由该配体-受体相互作用介导的信号传递而进行的新的炎症反应的调节方法。本发明的另一目的在于鉴定Mincle的生理性配体，阐明其生理学功能。解决课题的方法本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现Mincle选择性地与 FcRy缔合，激活巨噬细胞，以产生炎症性细胞因子/趋化因子；该受体识别由死细胞释放的、作为核内低分子核糖核蛋白的成分的130kDa蛋白(SAP130;也称作“Sf;3b3”)。进一步发现在通过放射线照射诱导了胸腺细胞死亡的小鼠中，通过给予抗Mincle抗体，嗜中性粒细胞在胸腺中的浸润被抑制，确认到体内的由Mincle抑制产生的抗炎效果。本发明人等根据上述知识进一步反复研究，结果完成了本发明。S卩，本发明如下所示。[1]抗炎药，其中含有抑制Mincle的表达、或者Mincle与SAP130或FcR γ的相互作用的物质。[2] [1]所述的药物，其中，抑制Mincle与SAP130的相互作用的物质是抗Mincle 抗体。[3] [2]所述的药物，其中，抗体识别SEQ ID NO 2所示的人Mincle的氨基酸序列中氨基酸编号146 150所示的氨基酸序列或其他哺乳动物的直系同源(orthologue)中的对应的氨基酸序列。[4] [1]所述的药物，其中抑制Mincle与SAP130的相互作用的物质是包含SEQ ID NO 2所示的人Mincle的氨基酸序列中氨基酸编号146 150所示的氨基酸序列或其他哺乳动物的直系同源中的对应的氨基酸序列的肽。[5] [1]所述的药物，其中，抑制Mincle与SAP130的相互作用的物质是抗SAP130 抗体。[6] [1]所述的药物，其中，抑制Mincle的表达的物质是抗Mincle基因的反义核酸、核酶或siRNA。[7] [1]所述的药物，其中，抑制Mincle与FcR γ的相互作用的物质是抗Mincle和 /或FcR γ抗体。[8] [1]所述的药物，其中，抑制Mincle与FcR γ的相互作用的物质与Mincle的跨膜结构域中包含保守精氨酸残基的位点结合。[9] [1] [8]中任一项所述的药物，该药物用于炎症性疾病的预防和/或治疗。[10]调节炎症反应的物质的筛选方法，其特征在于在受试物质的存在下和不存在下，使Mincle或包含其胞外区的片段与SAP130接触，比较两种条件下Mincle或其片段与SAP130的相互作用的程度。[11]调节炎症反应的物质的筛选方法，其特征在于在受试物质的存在下和不存在下，测定、比较表达Mincle或包含其胞外区和跨膜区的片段和FcR γ的细胞中Mincle或其片段与FcR γ的相互作用的程度。
[12] [11]所述的方法，该方法以由Mincle和FcRy介导的信号传递路径的活化为指标，比较Mincle或其片段与FcRy的相互作用的程度。[13] [12]所述的方法，该方法以启动子调控下的基因的表达为指标，所述启动子包含通过由Mincle和FcRy介导的信号传递而活化的转录因子所能结合的核苷酸序列。[14] [11] [13]中任一项所述的方法，其特征在于进一步使SAP130共存。[15]调节炎症反应的物质的筛选方法，其特征在于在受试物质的存在下和不存在下，测定、比较产生Mincle的细胞中的该蛋白或编码该蛋白的mRNA的量。[16] [15]所述的方法，其特征在于进一步使SAP130共存。[17] [10] [16]中任一项所述的方法，该方法用于选择具有抗炎作用的物质。[18]非稳态细胞死亡的检测方法，其特征在于测定从受试动物采集的试样中的 SAP 130 量。发明效果通过抑制Mincle的表达、或Mincle与SAP130或FcR γ的相互作用，可以阻断 FcRy依赖性信号传递，抑制被非稳态细胞死亡刺激的炎症反应。此外，以给Mincle与 SAP130或FcRY的相互作用带来的效果为指标，可以选择具有调节炎症反应的作用的物质。或者，以向细胞外释放SAP130为指标，可以检测非稳态细胞死亡。


图1 (a)利用流式细胞术筛选抗Mincle单克隆抗体。用大鼠IgG(对照)或杂交瘤上清和抗大鼠IgG-PE将表达Mincle-IRES-GFP的2B4细胞染色。1B6、4A9和6E2抗体的浓度分别为2.3、1. 1和0.05yg/ml。(b)结合竞争。在0 μ g/ml (细黑)、1 μ g/ml (灰)和 10 μ g/ml (粗黑)IB6 (上)和4A9 (下)的存在下，用1 μ g/ml 1B6-生物素(左)和4A9-生物素(右)将Mincle转染子染色，接着进行链霉亲和素-APC染色。(c)肽表位作图。合成包含Mincle的胞外结构域(长度为13a. a、重复11a. a.)的生物素化肽。各肽以0. 5nM包被在包被有链霉亲和素的微量培养板上。用BSA封闭后，分别使用rlgG、抗Mincle单克隆抗体和抗大鼠IgG-HRP作为1次抗体和2次抗体。分别显示推定的表位序列(1B6的表位序列为VEGQW、而4A9的表位序列为FWD)。(d)胞外结构域的3-D结构的分子模型。分别显示VEGQW模体和FWD模体。推定上的结合有甘露糖的EPN模体以黑色显示。(e)蛋白质印迹法。将来自转染了 2B4和Mincle的2B4细胞的溶解产物用抗Mincle单克隆抗体和抗大鼠IgG-HRP进行印迹。(f)刺激活性。以10 μ g/ml包被抗Mincle单克隆抗体，刺激表达 NFAT-GFP, Mincle和FcR γ的2Β4细胞达18小时，通过FACS进行分析。图2 (a)Mincle的跨膜区序列的比对。将小鼠、大鼠和人的Mincle的氨基酸序列排比。显示所保守的精氨酸残基。(b)Mincle与FcR γ结合。将细胞和带有Flag-tag &DAP12、DAP10*FcRy —同用小鼠Mincle转染。用抗Flag将溶解产物免疫沉淀，再用抗 Mincle单克隆抗体(1B6)和抗Flag进行印迹。全溶解产物也用抗Mincle进行印迹。(c) 在腹膜巨噬细胞中Mincle与FcR γ结合。用0. 1 μ g/ml的LPS刺激由巯基乙酸诱发的腹膜巨噬细胞达18小时，再用抗Mincle多克隆抗体将细胞溶解产物免疫沉淀，用抗FcR γ和抗 Mincle进行印迹。(d)Mincle的R42对于与FcR γ的结合是重要的。将四31~细胞和？^^ 一同用带有Flag-tag的Mincle野生型和Mincle R42I转染。用抗FcR γ (上面板(panel))或抗Flag(下面板)将溶解产物免疫沉淀，以所示抗体进行印迹。(e)Mincle的R42对于信号传递能力是重要的。将2B4 T细胞和FcRy —同用带有Flag-tag的Mincle野生型和 Mincle R42I转染。用包被在板上的抗Flag刺激细胞，利用ELISA测定IL-2产生。数据为 3次独立实验的代表例。图3 (a)在Mincle连接时TNF α和ΜΙΡ-2的产生。用包被在板上的大鼠 IgGKrIgGl)或抗Mincle单克隆抗体(6Ε2)刺激由巯基乙酸诱发的腹膜巨噬细胞达18小时，通过ELISA确定培养上清中的细胞因子产生。利用其他抗Mincle单克隆抗体克隆的 1Β6和4Α9也得到了同样的结果。(b)Mincle诱导性活化是FcR γ依赖性的。用包被在板上的抗Mincle单克隆抗体(6E2)或100 μ g/ml的酵母聚糖刺激由巯基乙酸诱发的来自野生型、FcR y +和MyD88+小鼠的腹膜巨噬细胞，通过ELISA确定MIP-2产生。(c)在Mincle 交联时Syk和Erk的活化。用抗Mincle和驴抗大鼠抗体刺激由巯基乙酸诱发的巨噬细胞达所示的时间。用所示抗体将细胞溶解产物进行印迹。(d)由Mincle介导的FcRy依赖性酪氨酸磷酸化。以(c)的方式刺激由巯基乙酸诱发的来自FcyRI/III-缺损小鼠和 FcRy-缺损小鼠的巨噬细胞达5分钟，用抗磷酸酪氨酸(pY)和抗phospho-Erk进行印迹。 (e)用包被在板上的抗Mincle单克隆抗体(6E2)或lng/ml的LPS刺激由巯基乙酸诱发的来自野生型(白)、FcRY +(灰)和CARD9+(黑)小鼠的腹膜巨噬细胞。18小时后，通过 ELISA确定MIP-2产生。(f-g)BMM的Mincle介导性活化。用10ng/ml的LPS处理来自野生型、FcR y +和MyD88"_小鼠的BMM达18小时，然后清洗，用30 μ g/ml的固定化抗IgGU 抗Mincle单克隆抗体(1B6)或10ng/ml的LPS刺激达6小时，通过ELISA确定MIP-2产生。 以⑷的方式刺激相同的细胞，分别以抗phospho-Syk、抗Syk和抗Mincle-生物素进行印迹。图4 在不刺激的情况下放置来自骨髓的巨噬细胞(左面板)、或者用lng/ml的 LPS刺激达18小时。用生物素化大鼠IgGl-bio(rlgG)和生物素化抗Mincle (1B6)以及链霉亲和素-APC(右面板)将细胞染色。图5 (a)通过固定化抗Mincle活化NFAT-GFP。将表达NFAT-GFP的2B4细胞用 FcRy和/或Mincle转染。用10 μ g/ml的包被在板上的抗rlgGl (虚线)或抗Mincle (实线)刺激细胞达18小时，利用流式细胞术分析GFP表达。(b)死细胞通过Mincle活化 NFAT-GFP。不交换培养基且在10 μ g/ml大鼠IgGl (rlgG)、抗Mincle克隆1B6 (1B6)或抗 Mincle克隆4A9(4A9)存在下或不存在下，培养表达Mincle和FcR γ的NFAT报道细胞达所示的时间。在重复两次的试验中，按所示时间通过流式细胞术分析GFP表达。数据显示3 次独立实验的代表例。(c)培养中的GFP+细胞和死细胞。用碘化丙啶将培养第2天的(b) 的细胞染色，用荧光显微镜(BZ-9000，Keyence)进行分析。典型的合并图像(显示DIC、 GFP和碘化丙啶)。(d)通过依托泊甙处理而产生的死细胞诱导Mincle介导性NFAT活化。 用1 μ g/ml的依托泊甙处理5 X IO4个2B4细胞达4小时以诱导细胞死亡，之后将其添加到 5X104个报道细胞中。M小时后，通过ELISA确定IL-2产生。数据显示3次实验的各自的代表例。(e)并不是Mincle的EPN模体、而是VEGQW序列对于死细胞诱导性的活化重要。 使 Mincle 野生型(WT)、Mincle E169Q/N171D (EPN_>QPD)以及 Mincle AVEGQff(AVEGQff) 和FcR γ —同在NFAT-GFP报道细胞中表达。以(b)的方式处理细胞，利用流式细胞术确定 GFP表达。
图 6 (a)Mincle、hIgGl Fc(Ig)禾Π hlgGl Fc-Mincle 融合蛋白(Ig-Mincle)的模式性表示。TM、跨膜。CLD、C-型凝集素结构域。(b) Ig-Mincle选择性地识别死细胞。用 10 μ M的地塞米松处理胸腺细胞达4小时，之后用Ig或Ig-Mincle以及APC-标记的抗hlgG 染色。还用膜联蛋白V-FITC(AnV)和碘化丙啶(PI)将细胞染色。(c)pl30与Mincle特异性地发挥相互作用。溶解2B4死细胞，然后用游离(-)、Ig-结合(Ig)和Ig-Mincle-结合 (Ig-Mincle)蛋白G kpharose将其拉下(pull down)，通过银染色进行分析。(d)确定pl30 为SAP130。利用质谱法分析独立的10肽的序列(左)。括号内显示各肽在SAP130中的位置(右)。(e)Mincle结合蛋白的蛋白质印迹。利用所示的kpharose珠粒拉下2B4死细胞溶解产物，以抗SAP130、抗DDB1、抗HMGBl和抗hlgG-HRP进行印迹。箭头显示Ig-Mincle 和Ig。(f)Mincle与来自活细胞的SAP130结合。用所示珠粒拉下2B4活(L)细胞或死(D) 细胞，以所示抗体进行印迹。(g)SAP130可由死细胞分泌。培养2B4细胞1天(活细胞)或 4天(死细胞)，回收培养上清。用抗_SAP130(左面板)和抗组蛋白Hl (右面板)将新鲜培养基(_)、第1天的上清(L)和第4天的上清(D)免疫沉淀。用抗SAP和抗组蛋白对全溶解产物和免疫沉淀物进行印迹。(h)在Fas介在性细胞死亡中SAP130的释放。用亮氨酸拉链化的Fas配体刺激表达Fas的2B4达所示时间。用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)将细胞染色，再利用流式细胞术进行分析(上面板)。收集来自处理细胞的上清，以(g)的方式进行分析(下面板)。图7 :(a)使用蛋白G、Ig_蛋白G和Ig-Mincle-蛋白G S印harose柱，连续纯化与 Mincle发生相互作用的蛋白。通过SDS-PAGE分离已洗脱的蛋白，将其转移到PVDF上，用胶体金液染色。还利用没有细胞溶解产物的Ig-Mincle-蛋白G作为对照。箭头显示只用带有细胞溶解产物的Ig-Mincle-蛋白G检测的蛋白。(b)切出、制备130_kDa蛋白(pl30)。 通过MALDI-T0F/MS (基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)分析已消化的肽。(c)确定 ρ 130为SAP 130。使来自肽的序列重合在SAP 130的全体氨基酸序列上。图8 (a) SAP130-V5在巨噬细胞中诱导MIP-2产生。将带有V5_tag的SAP130转染到细胞中。将细胞溶解产物应用到抗V5琼脂糖柱中，用V5肽洗脱结合蛋白。在用抗V5包被的板上，用带有重组V5-tag的SAP130刺激由巯基乙酸诱发的腹膜巨噬细胞达 18小时。通过ELISA确定培养上清中的MIP-2浓度。(b) SAP130-V5通过Mincle诱导细胞活化。在用抗V5包被的板上，在lOyg/ml的抗MinCle(lB6)的存在下或不存在下，用带有重组V5-tag的SAP 130刺激表达单独的FcR γ或Mincle和FcR γ两者的NFAT报道细胞达 18小时。通过ELISA确定培养上清中的IL-2浓度。(c)在杆状病毒中表达的SAP130的功能分析。使用Q-S印harose和TALON柱，从Sf9细胞中纯化带有HN-tag的SAPl300用 SDS-PAGE分离纯化蛋白，通过银染色(泳道1)和抗SAP130印迹进行确认。用0. 5 μ g/ml 的带有重组HN-tag的SAP130(SAP130-HN)和lng/ml的LPS刺激由巯基乙酸诱发的巨噬细胞达6小时，通过ELISA确定MIP-2产生(右面板)。图9 (a)来自未处理小鼠和I-Gy照射(Irradiation)小鼠(Y细胞，MDS Nordion)的胸腺的TUNEL染色。显示照射后M小时的皮质区。(b)全身照射时细胞充实度的变化。对B6小鼠进行IGy放射线照射，照射后于所示日期确定全胸腺细胞(左)和 ⑶llb+Grlhigh嗜中性粒细胞的百分比(右)。(c)通过全身照射急速诱导Mincle。对B6 小鼠进行IGy放射线照射，照射后在所示期间从胸腺中提取总RNA。对于Mincle，进行实时PCR分析。还以TLR2和FcR γ作为炎症性细胞浸润的指标进行分析。(d_f)抗Mincle抑制照射后的嗜中性粒细胞的浸润。对小鼠静脉内给予0.5mg的大鼠IgG或抗Mincle (克隆 1B6或4A9)。1小时后，对相同的小鼠进行Y射线照射(IGy)，然后在第12小时分析胸腺细胞的绝对数目和细胞充实度。对于⑶lib和Grl分析胸腺细胞。显示⑶llb+Grlhigh嗜中性粒细胞的绝对数目(e)。通过ELISA确定来自胸腺巨噬细胞的MIP-2产生(f)。各组至少包含3只小鼠。*、p<0. 05。图10 (a)通过给予地塞米松(Dex)而引起的DP胸腺细胞死亡。对各小鼠的腹腔膜内给予100 μ g Dex0给药后第M小时计数胸腺细胞，分析⑶4和⑶8的表达。(b)抗 Mincle对Dex诱导性嗜中性粒细胞浸润的效果。在给予Dex的1小时前，静脉内给予500 μ g 大鼠IgG或抗Mincle (1B6)。给予Dex后第24小时用抗Grl和抗CDllb将胸腺细胞染色。 数字显示包围胸腺的细胞的百分比。如图9d所示，在未处理的胸腺中相同集团的百分比低于 0. 03%。图11 (a-b)对B6小鼠静脉内给予500 μ g抗Mincle (1B6)。1小时后向腹腔膜内注入IOyg LPS，在第20小时收集腹膜细胞，进行分析。显示腹膜细胞中的嗜中性粒细胞的百分比(a)和绝对数目(b)。各组至少包含4只小鼠。图12 (a)用5_氯甲基二乙酸荧光素(CMFDA)标记进行了地塞米松处理的胸腺细胞。用4小时将已标记的胸腺细胞加入到由巯基乙酸诱发的腹膜巨噬细胞中，用荧光显微镜进行分析。箭头显示被巨噬细胞吞噬的标记胸腺细胞。(b)对于由巯基乙酸诱发的腹膜巨噬细胞，在未处理的情况下放置(None)、或者用0. 1 μ g/ml的LPS处理(LPS)达8小时以诱导Mincle。然后，在抗体的存在下或不存在下，以所示的方式加入标记的胸腺细胞。4小时后，用胰蛋白酶-EDTA回收细胞，利用流式细胞术确定在被包围的CDllb+集团内包含胸腺细胞的巨噬细胞的百分比。图13 (a)剪接因子北亚单元(SF3b)蛋白的模式性表示。U2 snRNP复合体由 SF3b、SF3a、Sm、U2A，和 U2B，构成。SAP49、SAP130、SAP145、SAP155 和 snRNA 形成 SF3b。在种间良好地保守U2 snRNA内的GUAGUA序列，与内含子内的分岐点周围的序列形成对。(b) 图4a中记载的样品用Ig-Mincle和蛋白G Sepharose拉下，用抗U2 snRNP复合体蛋白的抗SAP49、抗SAP145和抗SAP155等抗体进行印迹。
具体实施例方式本发明中的“Mincle”、“SAP130”和"FcRy”分别是指包含与 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列同源或实质上同源的氨基酸序列的蛋白。本说明书中，按照肽标记的惯例，蛋白和肽的左端记作N末端(氨基末端)、右端记作C末端(羧基末端)。上述蛋白可以是利用自身公知的蛋白分离纯化技术从人或其他恒温动物(例如， 豚鼠、大鼠、小鼠、鸡、兔、狗、猪、绵羊、牛、猴等)的细胞[例如，肝细胞、脾细胞、神经细胞、 神经胶质细胞、胰脏β细胞、骨髓细胞、系膜细胞、郎格罕细胞、表皮细胞、上皮细胞、杯细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如，巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞或间质细胞、或这些细胞的前体细胞、干细胞或癌细胞等]或这些细胞所存在的所有组织[例如，脑、脑的各部位(例如，嗅球、扁桃核、大脑基底球、海马、丘脑、下丘脑、大脑皮质、延髓、 小脑)、脊髓、下垂体、胃、胰脏、肾脏、肝脏、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉 (例如，平滑肌、骨骼肌)、肺、消化道(例如，大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾脏、颂下腺、外周血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、脂肪组织(例如，白色脂肪组织、褐色脂肪组织)等]等中分离、纯化的蛋白。作为“与SEQ ID NO :n(n = 2、4或6)所示的氨基酸序列实质上同源的氨基酸序列”，可以列举与SEQ ID NO :η所示的氨基酸序列具有约60%以上、优选约70%以上、更优选约80%以上、进一步优选约90%以上、特别优选约95%以上、最优选约97%以上的相似性的氨基酸序列等。这里，“相似性”是指，当采用该技术领域中公知的数学算法比对2个氨基酸序列时，在最佳比对(优选该算法是为了最佳的比对可以考虑向序列的一方或两方中导入缺口)中相同氨基酸和类似氨基酸残基相对于重叠的总氨基酸残基的比例(％ )。“类似氨基酸”是指在理化性质上类似的氨基酸，例如有芳香族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、Leu、lie、Val)、极性氨基酸(Gin、Asn)、碱性氨基酸(Lys, Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、具有羟基的氨基酸(Ser、Thr)、侧链小的氨基酸(Gly、Ala、kr、Ilir、Met) 等分类为同一组的氨基酸。预测利用这样的类似氨基酸进行的取代不会使蛋白表现型发生变化(即是保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代的具体例子在该技术领域众所周知，记载在各种文献中(例如参照 Bowie 等人，Science, 247 1306-1310 (1990))。本说明书中的氨基酸序列的相似性，可以采用同源性计算算法NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)，利用以下条件(期待值(expectancy) = 10 ；允许缺口 ；矩阵(matrix)= BL0SUM62 ；过滤(filtering) = OFF)进行计算。作为用于确定氨基酸序列的相似性的其他算法，例如有Karlin 等人，Proc. Natl. Acad. ki.USA，90 :5873-5877(1993)中记载的算法 [该算法被整合到NBLAST和XBLAST程序 0版)中(Altschul 等人，Nucleic Acids Res.， 25 :3389-3402(1997))] ；Needleman 等人，J. Mol. Biol. ,48 :444-453(1970)中记载的算法 [该算法被整合至Ij GCG软件包中的GAP程序中]；Myers和Miller，CABI0S，4 :11-17(1988) 中记载的算法[该算法被整合到CGC序列比对软件包的一部分即ALIGN程序O. 0版)中]； Pearson 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 :2444-2448(1988)中记载的算法[该算法被整合到GCG软件包中的FASTA程序中]等，这些公式也同样可以优选使用。更优选与SEQ ID NO m所示的氨基酸序列实质上同源的氨基酸序列为与SEQ ID NO :n所示的氨基酸序列具有约60%以上、优选约70%以上、更优选约80%以上、进一步优选约90%以上、特别优选约95%以上、最优选约97%以上的同源性的氨基酸序列。“包含与SEQ ID NO :n所示的氨基酸序列同源或实质上同源的氨基酸序列的蛋白” 是指，包含与SEQ ID NO :n所示的氨基酸序列实质上同源的氨基酸序列、并且与包含SEQ ID NO :n所示的氨基酸序列的蛋白具有实质上同质的活性的蛋白。这里所说的“活性”，当为Mincle时，是指与SAP 130发生相互作用，经由FcR γ 诱导炎症性细胞因子等的产生的活性、输送嗜中性粒细胞的活性；当为SAP130时，是指与 Mincle发生相互作用以激活Mincle的能力；当为FcRy时，是指与Mincle共轭以诱导炎症性细胞因子等的产生的活性、输送嗜中性粒细胞的活性。此外，“实质上同质”是指，例如从生理学或药理学的角度来看，其性质定性为相同。因此，该活性优选为同等，但上述活性的程度(例如，约0. 01 约100倍、优选约0. 1 约10倍、更优选0. 5 2倍)或蛋白的
分子量等量的要素可以不同。Mincle与SAP130以及Mincle与FcR γ的相互作用、嗜中性粒细胞的输送活性，可以按照自身公知的方法进行，例如按照后述实施例所述的方法等进行。此外，本发明的Mincle中还包括含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中1个或 2个以上(例如，1 30个左右、优选1 10个左右、更优选1 数(5、4、3或2)个)的氨基酸被取代、缺失、插入或添加(或者将它们组合起来)而得到的氨基酸序列的蛋白等所谓突变蛋白。如上所述，当氨基酸序列被插入、缺失或取代时，对其插入、缺失或取代的位置没有特别限定，只要保持与SAP130和FcRY发生相互作用的能力即可。同样，本发明的SAP130中还包括含有SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列中1个或 2个以上(例如，1 50个左右、优选1 30个左右、更优选1 10个左右、进一步优选 1 数(5、4、3或幻个)的氨基酸被取代、缺失、插入或添加(或者将它们组合起来)而得到的氨基酸序列的蛋白。本发明的FcRY中还包括含有SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列中1个或2个以上(例如，1 30个左右、优选1 10个左右、更优选1 数(5、4、3或2) 个)的氨基酸被取代、缺失、插入或添加(或者将它们组合起来)而得到的氨基酸序列的蛋白。本发明中的Mincle、SAP130和FcRy蛋白的其他优选例子有各种剪接变体 (例如，当为Mincle时，有在GeneCards (注册商标)的选择性剪接数据库(Alternative Splicing Database, ASD)中作为与 CLEC4E 相关的 Supplice Patterns (SP) 1 SP5 注册的人Mincle的剪接变体等；当为SAP130时，有在ASD中作为与SF3B3相关的SPl SP13注册的人SAP130的剪接变体等；当为FcRY时，有在ASD中作为与FCERlG相关的 SPl SP2注册的人SAP130的剪接变体等)或其他哺乳动物中的它们的直系同源(例如，当为Mincle时，有在GenBank中作为RefSeq No. NP_064332注册的小鼠直系同源、作为RefSeq No. ΝΡ_001005897注册的大鼠直系同源、作为RefSeq No. XP_001135204注册的黑猩猩直系同源、作为RefSeq No. XP_854311注册的狗直系同源等；当为SAP130时，有在 GenBank 中作为 RefSeq No. NP_598714 注册的小鼠直系同源、作为 RefSeq No. XP_214697 注册的大鼠直系同源、作为RefSeq No. XP_511081注册的黑猩猩直系同源、作为RefSeq No. XP_536791注册的狗直系同源、作为RefSeq No. XP_001232348注册的鸡直系同源等；当为FcRy时，有在GenBank中作为RefSeq No. NP_034315注册的小鼠直系同源、作为RefSeq No. NP_001003171注册的狗直系同源等)、以及它们的天然等位基因突变体或多态性等。本发明中，“抑制Mincle与SAP130的相互作用的物质”可以是抑制通过SAP130的刺激而将Mincle活化、并与FcR γ共轭来传递信号的所有物质，优选列举抑制Mincle与 SAP 130的结合的物质。具体而言，抑制Mincle与SAP130的结合的物质有例如抗Mincle或SAP130蛋白的抗体。该抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。这些抗体可以按照自身公知的抗体或抗血清的制备方法来制备。对抗体的同种型没有特别限定，优选IgG、IgM或IgA，特别优选IgG。此外，该抗体只要是至少具有用于特异性识别靶抗原并与其结合的互补性决定区(⑶幻的抗体即可，没有特别限定，除完全抗体分子外，例如还可以是Fab、Fab，、F(ab，)2等片段；SCFV、SCFV-FC、微型抗体(minibody)、双抗体(diabody)等通过基因工程制作的共轭分子；或用聚乙二醇(PEG)等具有蛋白稳定化作用的分子等修饰的它们的衍生物等。由于Mincle是一次跨膜型细胞表面受体，因此优选本发明中的抗Mincle抗体是识别Mincle的胞外区的抗体。如后述实施例中所示，当为人Mincle时，对于与SAP130的相互作用重要的Mincle的区包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中氨基酸编号146 150 所示的VEGQW(SEQ ID NO :7)(在其他哺乳动物的直系同源中，与其对应的氨基酸序列)。因此，优选本发明中的抗Mincle抗体为识别该区的抗体。这样的抗体可以如下获得利用固相合成法等周知的肽合成法合成包含该区的氨基酸序列的寡肽，使其与适当的载体蛋白结合，再以得到的结合产物作为免疫原，对动物进行免疫、或者实施使用了淋巴细胞等的体外免疫，从而可以获得上述抗体。但是，即使本发明中的抗Mincle抗体是识别对于与SAP130 的相互作用重要的区以外的抗体，但只要通过结合该抗体能够抑制SAP130与Mincle结合以将其活化，就同样可以优选使用。另一方面，由于SAP130被从死细胞中释放到细胞外，因此本发明中的抗SAP130抗体可以是识别SAP130的任一区的抗体，优选列举下述抗体识别对于与Mincle的相互作用重要的Mincle的区、特别是下述区的抗体，所述区参与与包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中氨基酸编号146 150所示的VEGQW(SEQ ID NO 7)或其他哺乳动物的直系同源中对应的氨基酸序列的区的结合。在优选的一实施方案中，抗Mincle或SAP130蛋白的抗体被用作以人为给药对象的药品，因此该抗体(优选单克隆抗体)是对人给药时显示出抗原性的危险性降低的抗体， 具体而言，有完全人抗体、人源化抗体、小鼠-人嵌合抗体等，特别优选为完全人抗体。人源化抗体和嵌合抗体可以按照常规方法，通过基因工程进行制作。此外，完全人抗体还可以利用人-人(或小鼠)杂交瘤来制备，但为了稳定且低成本地提供大量的抗体，优选利用产生人抗体的小鼠或噬菌体展示法来制备。抑制Mincle与SAP130的结合的其他物质的例子有包含与参与Mincle与SAP130 的结合的区的氨基酸序列同源或实质上同源的氨基酸序列的肽。这里，“实质上同源的氨基酸序列”是指，在参与与SAP130的结合的区的氨基酸序列中有1 3个、优选1 2个氨基酸被取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，该序列保持与SAP130的结合能力。具体而言，作为Mincle的参与与SAP130的结合的区的氨基酸序列，有上述SEQ ID N0:2所示的人Mincle的氨基酸序列中氨基酸编号146 150所示的VEGQW(SEQ ID NO :7)、或其他哺乳动物的直系同源中的该序列所对应的氨基酸序列。对该肽的长度没有特别限定，但考虑到分子量的大小、容易合成、抗原性的问题等，该肽的长度为5 50氨基酸左右、优选5 30 氨基酸左右、更优选5 15氨基酸左右。该肽可以包含不参与与SAP130结合的氨基酸序列，例如在不会对参与该结合的氨基酸序列与SAP130的相互作用产生不良影响的范围内， 可以将设计成改善肽的理化性质(例如，疏水性、等电点、热稳定性、PH稳定性、对酶的稳定性等)的氨基酸序列添加在参与该结合的氨基酸序列的N末端和/或C末端。本发明中的抑制Mincle与SAP130的相互作用的物质并不限于上述的抗Mincle 抗体或SAP130结合性肽，只要直接或间接地抑制Mincle与SAP130的相互作用，可以是低分子化合物等其他物质。这样的物质例如可以利用后述的本发明的筛选方法(I)或(III) 而获得。
本发明中，“抑制Mincle的表达的物质”可以是在Mincle基因的转录水平、转录后调节的水平、翻译成蛋白的水平、翻译后修饰的水平等所有阶段发挥作用的物质。因此，抑制Mincle蛋白的表达的物质包括例如抑制Mincle基因的转录的物质、抑制由初期转录产物加工成mRNA的物质、抑制向细胞质中输送mRNA的物质、促进mRNA的分解的物质、抑制由 mRNA翻译成蛋白的物质、抑制Mincle多肽的翻译后修饰的物质等。作为能够特异性抑制由Mincle的mRNA翻译成蛋白的物质，优选列举包含与这些 mRNA的核苷酸序列互补或实质上互补的核苷酸序列或其一部分的核酸。与Mincle mRNA的核苷酸序列实质上互补的核苷酸序列是指，在哺乳动物细胞内的生理条件下，与该mRNA的靶序列结合并能够抑制其翻译的程度的具有互补性的核苷酸序列，具体而言，例如就与和该mRNA的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列(即mRNA的互补链的核苷酸序列)重叠的区而言，具有约80%以上、优选约90%以上、更优选约95%以上、 最优选约97%以上的相似性的核苷酸序列。本发明中的“核苷酸序列的相似性”，可以使用同源性算法NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)，利用以下条件(期待值=10 ；允许缺口 ；过滤=0N;匹配分值(match score) = 1 ；错配分值 (mismatch score) = -3)来计算。更具体而言，作为与Mincle mRNA的核苷酸序列互补或实质上互补的核苷酸序列， 可以列举(a) SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列或(b)在严格的条件下与该核苷酸序列杂交的核苷酸序列、且与编码下述蛋白的序列互补或实质上互补的核苷酸序列，所述蛋白与包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白具有实质上同质的活性。这里，“实质上同质的活性”与上述同义。“严格的条件下，，是指，例如 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6. 3. 1-6. 3. 6，1999中所述的条件，例如在6XSSC(氯化钠/枸橼酸钠)/45°C 下杂交、然后在0.2XSSC/0. 1% SDS/50 65°C下清洗一次以上等，但本领域技术人员可以适当选择给予与其同等的严格度的杂交条件。Mincle mRNA优选为包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的人Mincle mRNA (RefSeq Accession No. NM_014358)、或其他哺乳动物中的它们的直系同源(例如，在GenBank中作为Ref^eq No. ΝΜ_019948注册的小鼠直系同源、作为RefSeq No. NM_001005897注册的大鼠直系同源、作为RefSeq No. ΧΜ_001135204注册的黑猩猩直系同源、作为RefSeq No. XM_849218注册的狗直系同源等)、以及它们的天然等位基因突变体、基因多态性。“与Mincle mRNA的核苷酸序列互补或实质上互补的核苷酸序列的一部分”，只要是能够特异性地与Mincle mRNA结合、并且能够抑制由该mRNA翻译成蛋白的核苷酸序列即可，对其长度或位置没有特别限定，但从序列特异性的角度考虑，至少包含10碱基以上、优选约15碱基以上、更优选约20碱基以上的与靶序列互补或实质上互补的部分。具体而言，作为包含与Mincle mRNA的核苷酸序列互补或实质上互补的核苷酸序列或其一部分的核酸，优选例示以下(a) (c)中的任一种核酸。(a)抗 Mincle mRNA 的反义核酸(b)抗 Mincle mRNA 的 siRNA
(c)能够生成抗Mincle mRNA的siRNA的核酸本发明中的“抗Mincle mRNA的反义核酸”是指，包含与该mRNA的核苷酸序列互补或实质上互补的核苷酸序列或其一部分的核酸，并且是具有与靶mRNA形成特异性的且稳定的双链并结合、从而抑制蛋白合成的功能的核酸。反义核酸可以是双链DNA、单链DNA、 双链RNA、单链RNA、DNAiRNA杂种，也可以是进一步添加有公知的修饰的核酸。这里，“核酸”不仅含有嘌呤和嘧啶碱基，还可以包含具有被修饰的其他杂环型碱基的核酸。当反义核酸为DNA时，由靶RNA和反义DNA形成的RNA:DNA杂种可以被内源性RNase H识别，引起靶RNA的选择性分解。因此，当为指向由RNase H引起的分解的反义DNA时，靶序列不仅是 mRNA中的序列，还可以是CPSF5或CPSF6基因的初期翻译产物中的内含子区的序列。并且，本发明的反义核酸可以是与作为双链DNA的Mincle基因结合形成三股链 (三链体)、并能够抑制向RNA转录的核酸(反基因)。本发明的反义核酸的靶区，只要是通过该反义核酸杂交，结果抑制翻译成Mincle 蛋白的靶区即可，对其长度没有特别限定，短则约10碱基左右，长则为mRNA或初期转录产物的全序列。考虑到容易合成或抗原性、细胞内移动性的问题等，优选包含约10 约40碱基、特别是约15 约30碱基的寡核苷酸，但并不限于此。构成反义核酸的核苷酸分子可以是天然型的DNA或RNA，但为了提高稳定性(化学稳定性和/或对酶的稳定性)或比活性(与RNA的亲和性)，可以包含各种化学修饰。 例如，为了防止由核酸酶等引起的分解，可以将构成反义核酸的各核苷酸的磷酸残基(磷酸酯基)取代成例如硫代磷酸酯(PS)、磷酸甲酯、二硫代磷酸酯等化学修饰磷酸残基。此外，还可以将各核苷酸的糖(核糖)的2’位的羟基取代成-0R(R表示例如CH3(2’ -O-Me), CH2CH2OCH3(2‘ -0-Μ0Ε)、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2C0NHCH3> CH2CH2CN 等)。并且，可以对碱基部分(嘧啶、嘌呤)进行化学修饰，例如向嘧啶碱基的5位导入甲基或阳离子性官能基、或者将2位的羰基取代成硫羰基等。RNA的糖部分的结构由C2’-end0(S型)和C3’-end0 (N型)两者支配，在单链RNA 中两者平衡存在，但若形成双链，则被固定为N型。因此，为了赋予靶RNA强结合能力，还可以优选使用通过交联2’氧和4’碳而使糖部分的结构固定为N型的RNA衍生物、即BNA(LNA) (Imanishi, T.等人，Chem. Commun. , 1653-9, 2002 ； Jepsen, J. S.等人，Oligonucleotides, 14,130-46,2004)或 ENA (Morita，K.等人，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21,2003)。本发明的反义寡核苷酸可以如下制备根据Mincle cDNA序列或基因组DNA序列确定靶序列，再使用市售的DNA/RNA自动合成仪(Applied Biosystems社、Beckman社等) 合成与其互补的序列，即可制得。本说明书中，包含与Mincle mRNA互补的寡RNA及其互补链的双链RNA、所谓的 siRNA也定义为包含在含有与Mincle mRNA的核苷酸序列互补或实质上互补的核苷酸序列或其一部分的核酸中。可以根据靶mRNA的核苷酸序列信息，使用市售软件(例如RNAi Designer ；Invitrogen)来适当设计siRNA。构成siRNA的核苷酸分子也可以接受与上述反义核酸的情形相同的修饰，以提高稳定性、比活性等。但是，当为siRNA时，若用修饰型取代天然型RNA中的所有核苷酸分子，则有时会失去RNAi活性，所以必需导入RISC复合体可以发挥作用的最小限度的修饰核苷。
siRNA可以如下制备使用DNA/RNA自动合成机分别合成mRNA上的靶序列的正义链和反义链，使之在适当的退火缓冲液中、约90 约95°C下变性约1分钟左右，之后使之在约30 约70°C下退火约1 约8小时，即可制得。另外，通过合成作为siRNA的前体的短发夹状RNA(shRNA)，之后用切酶(dicer)将其切断，也可以制备siRNA。作为设计成能够在体内生成抗Mincle mRNA的siRNA的核酸，可以列举上述 shRNA或构建成表达siRNA的表达载体等。shRNA可以如下制备将能够形成适当的环结构的长度(例如15 25碱基左右)的间隔序列插入mRNA上的靶序列的正义链和反义链之间，连接成核苷酸序列，设计包含该核苷酸序列的寡RNA，再使用DNA/RNA自动合成机合成该寡RNA，即可制得。至于包含shRNA的表达盒的表达载体，利用常规方法制作编码上述 shRNA的双链DNA后，将其插入适当的表达载体中，即可制得。作为shRNA的表达载体，可以使用U6或Hl等具有Pol III系启动子的表达载体。此时，在导入有该表达载体的动物细胞内，所转录的shRNA通过自身形成环，之后通过内源性切酶(dicer)等进行加工，从而形成成熟siRNA。包含与Mincle mRNA的核苷酸序列互补或实质上互补的核苷酸序列或其一部分的核酸的其他优选例子有在编码区内部能够特异性切断该mRNA的核酶。在本说明书中，核酶只要具有序列特异性核酸切断活性即可，可以以还包含DNA的概念使用。作为核酶，通用性最高的有类病毒或拟病毒等在感染性RNA中可见的自我剪接RNA，已知有锤头型或发夹型等。包含与Mincle mRNA的核苷酸序列互补或实质上互补的核苷酸序列或其一部分的核酸可以以脂质体、微球这样的特殊形态供与，或者以添加有多聚赖氨酸这样的聚阳离子体、脂质(例如，磷脂、胆固醇等)等疏水性物质的形态提供。本发明中的抑制Mincle的表达的物质，并不限于上述的反义核酸、siRNA、核酶等，只要直接或间接地抑制Mincle的表达，可以是低分子化合物等其他物质。这样的物质例如可以利用后述的本发明的筛选方法(IV)而获得。本发明中，“抑制Mincle与FcRy的相互作用的物质”可以是能够抑制被活化的 Mincle与FcR γ共役来传递信号的任何物质，优选列举抑制Mincle与FcR γ的缔合的物质。具体而言，抑制Mincle与FcR γ的缔合的物质有例如抗Mincle和/或FcR γ的抗体。抗Mincle或FcR γ的抗体各自通过与Mincle或FcR γ结合，立体抑制与伙伴分子 (partner molecule)的缔合，或者，通过带来结构变化，能够降低与伙伴缔合的能力。此外， 识别Mincle和FcR γ的双特异性抗体，其也通过与两抗原分子结合，使它们无法接近到能够发生相互作用的程度时，可以阻断由FcRY介导的信号传递，因此同样可以优选使用。对这些抗体所识别的Mincle和FcRy的区没有特别限定，优选为胞外区。抗Mincle和/或FcR γ的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。这些抗体可以按照自身公知的抗体或抗血清的制备方法来制备。对抗体的同种型没有特别限定， 优选IgG、IgM或IgA，特别优选IgG。此外，该抗体只要是至少具有用于特异性识别并结合靶抗原的互补性决定区(CDR)的抗体即可，没有特别限定，可以使用与上述相同的各种形态的抗体。在一优选实施方案中，这些抗体被用作以人为给药对象的药品，因此该抗体优选
14为完全人抗体、人源化抗体、小鼠-人嵌合抗体等，特别优选为完全人抗体。本发明中的抑制Mincle与FcRy的相互作用的物质，并不限于上述的抗Mincle 和/或FcRy的抗体，只要直接或间接地抑制Mincle与FcR γ的相互作用，可以是低分子化合物等其他物质。这样的物质可以利用例如后述的本发明的筛选方法(II)或(III)而获得。如后述实施例所示，在Mincle与FcR γ的缔合中，Mincle的跨膜结构域中的、在哺乳动物种间保存良好的精氨酸残基(SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中氨基酸编号41所示的氨基酸)是重要的。因此，能够特异性地与Mincle的包含该精氨酸残基的跨膜区结合的物质能够有效抑制Mincle与FcR γ的相互作用。以跨膜区为靶向时要求疏水性，所以使用脂溶性低分子化合物非常有利。抑制Mincle的表达或Mincle与SAP130或FcR γ的相互作用的物质可以阻断 FcRy依赖性的信号传递，抑制被非稳态细胞死亡刺激的炎症反应。因此，含有抑制Mincle 的表达或Mincle与SAP130或FcR γ的相互作用的物质的药物，例如可以作为抗炎药，用作各种炎症性疾病(例如，克罗恩病(Crohn disease)、类风湿性关节炎、贝塞特氏症(眼症状)、溃疡性大肠炎、强直性脊椎炎、干癣(还包括干癣性关节炎)、HIV感染症、多发性骨髓瘤、充血性心力衰竭、GVHD、巨细胞动脉炎(GCA)、风湿性多肌痛(PMR)、色素性紫癜性苔癣样皮炎、肉状瘤病、韦格氏肉芽肿、脓皮症、贝塞特氏症、TNF受体相关周期性综合征 (TRAPS)、SAPHO综合征、多发性大动脉炎、肌炎、斯蒂尔病、结节性动脉周围炎(PN)、复发性多软骨炎、硬皮症多发性肌炎、噬血细胞综合征、天疱疮、川崎病特应性皮炎)的预防和/或治疗药等。(1)含有抗体、低分子化合物等的药物含有抗阻11(；16、54 130或？^ ￥的抗体、或者抑制Mincle的表达或Mincle与 SAP130或FcRY的相互作用的低分子化合物的药物，其毒性低，可以直接以液剂的形式、或者以适当剂型的药物组合物的形式，对人或其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、 牛、猫、狗、猴等)进行口服或胃肠外(例如，血管内给药、皮下给药等)给药。作为用于给药的药物组合物，可以是含有上述抗体或低分子化合物或其盐和药理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。这样的药物组合物以适合口服或胃肠外给药的剂型提供。作为用于胃肠外给药的组合物，例如使用注射剂、栓剂等，注射剂可以包含静脉注射齐 、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂型。这样的注射剂可以按照公知的方法进行制备。作为注射剂的制备方法，例如通过将上述本发明的抗体或低分子化合物或其盐在通常注射剂所使用的无菌水性液或油性液中溶解、悬浮或乳化，即可制备。作为注射用水性液，例如使用生理盐水、含有葡萄糖或其他辅剂的等渗溶液等，还可以和适当的助溶剂、例如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨酯80、HC0-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加成物)]等结合使用。作为油性液，例如使用芝麻油、大豆油等，还可以结合使用苯甲酸苄酯、苄醇等作为助溶剂。已制备的注射液优选填充在适当的安瓿中。用于直肠给药的栓剂可以通过将上述抗体或其盐混合在通常的栓剂用基质中来制备。作为用于口服给药的组合物，有固体或液体的剂型，具体可以列举片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、悬浮剂等。 这样的组合物按照公知方法制备，可以含有制剂领域中通常使用的载体、稀释剂或赋形剂。 作为片剂用的载体、赋形剂，例如使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁。上述胃肠外用或口服用药物组合物，优选制成适于活性成分的给药量的给药单位的剂型。这样的给药单位的剂型例如有片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂。优选每给药单位剂型通常含有5 500mg抗体或低分子化合物，特别是当为注射剂时，含有5 IOOmg ；当为其他剂型时，含有10 250mg。含有上述抗体或低分子化合物或其盐的上述药物的给药量根据给药对象、对象疾病、症状、给药途径等而不同，例如用于治疗、预防成人的类风湿性关节炎时，抗体或低分子化合物以1次量计，通常为0. 01 20mg/kg体重左右、优选0. 1 10mg/kg体重左右、进一步优选0. 1 5mg/kg体重左右，按照1日1 5次左右、优选1日1 3次左右，通过静脉注射进行给药。在其他的胃肠外给药和口服给药的情况下，也可以根据这个量进行给药。症状特别严重时，根据其症状可以加量。上述各组合物中，只要通过与上述抗体或低分子化合物混合不会发生不良的相互作用，可以含有其他药物。能够与上述抗体或低分子化合物结合使用的药物例如有抗菌药、抗真菌药、非留体抗炎药、留体药物、抗凝血药、血小板凝集抑制剂、溶栓药、免疫调节剂、抗原虫药、抗生素、抗病毒药、镇咳·祛痰药、镇静剂、麻醉剂、抗溃疡药、心律不齐治疗药、降压利尿药、安神药、抗精神病药、抗肿瘤药、抗高脂血症药、肌松药、抗癫痫药、抗抑郁药、抗过敏药、强心剂、心律不齐治疗药、血管扩张药、血管收缩药、降压利尿药、糖尿病治疗药、麻醉药品拮抗剂、维生素类药、维生素类衍生物、关节炎治疗药、抗风湿药、抗哮喘药、尿频·尿失禁治疗药、特应性皮炎治疗药、特应性性鼻炎治疗药、升压药、蛋白分解剂、蛋白分解酶抑制剂、抗SIDS药、抗菌防腐药(antis印tic drugs)、抗感染性休克药(antis印tic shock drugs)、内毒素拮抗剂或抗体、信号传递抑制剂、炎症性介质作用抑制药、炎症性介质作用抑制抗体、炎症性介质产生抑制药、抗炎性介质作用抑制药、抗炎性介质作用抑制抗体、抗炎性介质产生抑制药、α 1肾上腺素能激动剂等。上述抗体或低分子化合物与上述其他药物可以同时或在不同时间给予患者。(2)含有反义核酸、SiRNA、核酶等核酸的药物含有抗Mincle mRNA的反义核酸、siRNA、核酶以及编码它们的核酸的药物毒性低， 可以直接以液剂的形式、或者以适当剂型的药物组合物的形式，对人或非人哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)进行口服或胃肠外(例如，血管内给药、皮下给药等)给药。使用这些核酸作为上述的抗炎药、炎症性疾病的预防 治疗药等时，可以按照自身公知的方法制成制剂后给药。即，可以将本发明的核酸单独制成制剂，或者以可以发挥作用的方式将其插入逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体等适当的哺乳动物细胞用表达载体中，之后按照常规方法制成制剂。该核酸可以直接或者与用于促进吸收的辅助剂一起，通过基因枪或水凝胶导管这样的导管进行给药。或者，还可以将其制成气溶胶，以吸入剂的形式对气管内进行局部给药。并且，为了改善体内药动学、延长半衰期、改善细胞内摄入效率，可以将上述核酸单独或者与脂质体等载体一同制成制剂(注射剂)，对静脉、皮下等进行给药。
本发明的核酸，可以将其自身给药，或者可以以适当的药物组合物的形式给药。作为用于给药的药物组合物，可以是含有本发明的核酸和药理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。这样的药物组合物以适合口服或胃肠外给药的剂型的形式提供。作为用于胃肠外给药的组合物，例如使用注射剂、栓剂等，注射剂可以包含静脉注射齐 、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂型。这样的注射剂可以按照公知的方法制备。用于直肠给药的栓剂可以通过将上述核酸混合在通常的栓剂用基质中来制备。作为用于口服给药的组合物，可以列举固体或液体的剂型，具体有片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软胶囊)、糖浆剂、乳剂、悬浮剂等。这样的组合物按照公知方法制备，可以含有制剂领域中通常使用的载体、稀释剂或赋形剂。作为片剂用的载体、赋形剂，例如使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁。上述胃肠外用或口服用药物组合物，优选制成适合活性成分的给药量的给药单位的剂型。这样的给药单位的剂型有例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂。例如， 优选每给药单位剂型通常含有5 500mg本发明的核酸，特别是当为注射剂时，含有5 IOOmg ；当为其他剂型时，含有10 250mg。含有本发明的核酸的上述药物的给药量根据给药对象、对象疾病、症状、给药途径等而不同，例如用于治疗、预防成人的类风湿性关节炎时，本发明的核酸以1次量计，通常为0. 01 20mg/kg体重左右、优选0. 1 10mg/kg体重左右、进一步优选0. 1 5mg/kg体重左右，按照1日1 5次左右、优选1日1 3次左右，通过静脉注射进行给药。在其他的胃肠外给药和口服给药的情况下，也可以根据这个量进行给药。症状特别严重时，根据其症状可以加量。需要说明的是，上述各组合物中只要通过与本发明的核酸混合不会产生不良的相互作用，就可以含有其他药物。作为其他药物，同样例示作为能够与上述抗体或低分子化合物结合使用的药物而列举的药物。如上所述，Mincle识别由死细胞释放的SAP130并将其活化，之后与FcRy发生相互作用以诱导炎症性细胞因子等的产生，此外，Mincle还具有使嗜中性粒细胞浸润的作用。 因此，抑制Mincle的表达或Mincle与SAP130或FcR γ的相互作用的物质作为抗炎药，可用于各种炎症性疾病的预防、治疗。另一方面，使Mincle的表达或Mincle与SAP130或FcR γ 的相互作用增强的物质以适当的水平促进嗜中性粒细胞在损伤或病原体感染的组织中的浸润，能够促进组织修复，因此可用作组织损伤或感染症的治疗药。因此，本发明还提供调节炎症反应的物质的筛选方法，该筛选方法通过选择调节 Mincle的表达、或者Mincle与3々 130或？^ ￥的相互作用的物质来进行。(I)调节Mincle与SAP130的相互作用的物质的筛选方法本发明提供调节炎症反应的物质的筛选方法，其特征在于在受试物质的存在下和不存在下，使Mincle或包含其胞外区的片段与SAP130接触，比较两种条件下Mincle或其片段与SAP130的相互作用的程度。本筛选方法中使用的Mincle和SAP130蛋白，如上述关于本发明的药物的说明中所记载。Mincle可以使用其全长，也可以使用包含其胞外区(SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中，包含氨基酸编号45 219所示的氨基酸序列的区)的片段。至于SAP130蛋白，只要包含参与与Mincle的结合和Mincle的活化的区即可，也可以使用其片段。以下，只要没有特别说明，则言及Mincle和SAP130时，以包含上述功能性片段的意义使用。关于Mincle和SAP130蛋白，可以适当组合自身公知的蛋白分离纯化技术，由产生上述该蛋白的细胞或组织获得。或者，使用根据上述的它们的核苷酸序列信息制作的探针或引物，从由产生该蛋白的细胞或组织制备的RNA、cDNA、cDNA文库等克隆编码该蛋白的核酸，将其插入适当的表达载体中，再导入宿主细胞中，并培养转化细胞，利用自身公知的方法回收得到的重组蛋白，从而也可以获得这些蛋白。并且，还可以根据上述这些蛋白的氨基酸序列信息，利用公知的肽合成方法进行化学合成。更具体而言，本筛选方法包括下述步骤(a)、(b)和(C)(a)使受试物质与Mincle和SAP130接触的步骤；(b)测定接触了受试物质的Mincle与SAP130的结合活性，将该活性与没有接触受试物质的对照Mincle与SAP130的结合活性进行比较的步骤；以及(c)根据上述(b)的比较结果，选择调节Mincle与SAP130的结合活性的受试物质的步骤。在步骤(a)中，作为受试物质，可以是任何公知物质和新物质，例如有核酸、糖类、脂质、蛋白、肽、有机低分子化合物、利用组合化学技术制作的化合物文库、利用固相合成或噬菌体展示法制作的随机多肽文库、或来自微生物、动植物、海洋生物等的天然成分寸。在步骤(a)中，受试物质与Mincle和SAP130接触。步骤(a)中，对接触方法没有特别限定，例如有下述方法在25 37°C的生理条件下，以预定的浓度混合Mincle和 SAP130，之后添加受试物质的方法；将SAP130固定在固相上，之后在受试物质的存在下使其与Mincle结合的方法；或者，向表达Mincle的细胞的培养液中添加受试物质和SAP130 的方法等。所添加的受试物质的浓度根据化合物种类(溶解度、毒性等)而不同，例如在约 0. InM 约IOOnM的范围内适当选择。培养时间例如为约10分钟 约M小时。在步骤(b)中，Mincle与SAP130的结合活性可以利用以下例子中列举的方法进行测定。b-Ι)使用抗Mincle抗体或抗SAP130抗体进行免疫沉淀，以免疫沉淀中未使用的抗体进行蛋白质印迹，测定Mincle与SAP130的结合量的方法。b-2)使Mincle或SAP130中的任一者以与聚组氨酸或GST等标志的融合蛋白的形式表达、或生物素化，由于聚组氨酸与镍结合、GST与谷胱甘肽结合、而生物素与抗生物素蛋白结合，所以利用它们来回收结合体，通过与b-Ι)相同的蛋白质印迹测定结合量的方法。b-3)表面等离子共振法(Biacore)。b-4)利用流式细胞仪测定荧光标志的Mincle与SAP130表达细胞的结合的方法。在步骤(b)中，例如在受试物质的存在下、不存在下，根据Mincle与SAP130的结合量是否存在显著差异，进行结合活性的比较。在步骤(c)中，选择使Mincle与SAP130的结合活性降低或增大的受试物质。使该结合活性降低的受试物质作为抗炎性物质、特别是炎症性疾病的预防·治疗药的候选是有效的。此外，其作为免疫调节剂或研究用试剂也有效。另一方面，使该结合活性增大的受试物质作为组织损伤或感染症的治疗药的候选是有效的。
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(II)调节Mincle与FcRy的相互作用的物质的筛选方法本发明还提供调节炎症反应的物质的筛选方法，其特征在于在受试物质的存在下和不存在下，测定、比较细胞中的Mincle或其片段与FcR γ的相互作用的程度，所述细胞表达Mincle或包含其胞外区和跨膜区的片段和FcR γ。本筛选方法中使用的Mincle和FcR γ蛋白，如上述关于本发明的药物的说明中所记载。Mincle可以使用其全长，也可以使用包含其胞外区和跨膜区(在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中，包含氨基酸编号22 219所示的氨基酸序列的区)的片段。至于FcRY 蛋白，只要包含参与与Mincle的结合和细胞内信号传递的区即可，也可以使用其片段。以下，只要没有特别说明，则言及Mincle和FcRy时，以包含上述功能性片段的意义使用。更具体而言，本筛选方法包括下述步骤(a)、(b)和(C)(a)使受试物质与细胞接触的步骤，所述细胞表达Mincle和FcRy、并且可以测定通过它们的相互作用传递的信号(称作“活化信号”)；(b)测定接触了受试物质的细胞中的活化信号的水平，将该水平与未接触受试物质的对照细胞中的活化信号的水平进行比较的步骤；以及(c)根据上述(b)的比较结果，选择调节炎症反应的受试物质的步骤。在步骤(a)中，作为受试物质，使用上述受试物质。表达Mincle和FcR γ的细胞可以是具有内源性Mincle和FcR γ的细胞，也可以是导入有它们中的任一者或两者的重组细胞。内源性表达Mincle和FcR γ的细胞有从哺乳动物中分离的胸腺细胞、巨噬细胞、树状细胞、神经胶质细胞、枯否细胞、神经节细胞等。当为重组细胞时，作为宿主细胞，可以列举例如H4IIE-C3细胞、H印G2细胞、293T细胞、HEK293细胞、C0S7细胞、2B4T细胞、CH0、 MCF-7细胞、!E95R细胞等动物细胞。编码Mincle和FcR γ的核酸可以如下制作在筛选方法(I)中进行与上述相同的操作以分离蛋白，之后将其插入具有能够在宿主细胞内发挥功能的启动子的表达载体中，再利用例如磷酸钙共沉淀法、PEG法、电穿孔法、微量注入法、脂质转染法等将该载体导入宿主细胞中，即可制得。关于受试物质与上述细胞的接触，例如，向适合培养该细胞的培养基(例如，含有约5 20%的胎牛血清的最小必需培养基(MEM) ,Dulbecco' s改良fegle培养基(DMEM)、 RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基等)或各种缓冲液(例如，HEPES缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、Tris-盐酸缓冲液、硼酸缓冲液、乙酸缓冲液等)中添加受试物质，培养细胞达一定时间，从而可以使之接触。所添加的受试物质的浓度根据化合物的种类 (溶解度、毒性等)而不同，例如在约0. InM 约IOOnM的范围内适当选择。培养时间例如为约10分钟 约M小时。在步骤(b)中，活化信号的测定可以通过测定该信号的结果所诱导的细胞的响应来进行。例如，可以通过定量位于由Mincle和FcRy介导的信号传递路径的下游的激酶、 例如Syk、Erk、CARD9等的磷酸化，来进行活化信号的测定。关于这些分子的磷酸化，通过使用各自的磷酸化物特异性抗体，对细胞溶解产物进行蛋白质印迹或ELISA等免疫测定，即可进行定量。这些磷酸化物特异性抗体在市场上有售。此外，对于通过上述信号传递路径的活化而产生的MIP-2、TNFa、IL_6、IL_8、 IL-12等炎症性细胞因子/趋化因子，例如使用抗它们的抗体，通过蛋白质印迹或ELISA等免疫测定进行定量，从而可以进行活化信号的测定。并且，在另一优选方案中，可以以启动子调节下的基因表达为指标，来测定活化信号水平，所述启动子包含由Mincle和FcR γ介导的信号传递活化的转录因子所能结合的核苷酸序列。作为这样的转录因子，例如有NFAT、NFkB等。这些转录因子所结合的共有顺式序列在该领域众所周知。利用与上述相同的方法，将在包含该顺式序列的启动子的下游连接有编码报道蛋白(例如，萤光素酶、GFP、过氧化物酶、碱性磷酸酶等)的DNA的表达载体导入表达Mincle和FcR γ的细胞中时，利用活化信号活化该顺式序列的转录因子被活化， 诱导该报道蛋白的表达，所以通过测定该报道蛋白的表达，可以定量活化信号水平。在步骤(b)中，根据在受试物质的存在下、不存在下活化信号水平中是否存在显著差异，来进行活化信号水平的比较。需要说明的是，相对于接触了受试物质的细胞中的活化信号水平的测定，未接触受试物质的对照细胞中的活化信号水平可以是事先测定的表达量，也可以是同时测定的表达量，但从实验的精度、重现性的角度考虑，优选为同时测定的表达量。在步骤(c)中，选择使由Mincle与FcRy的相互作用介导的活化信号水平降低或增大的受试物质。使活化信号水平降低的受试物质作为抗炎性物质、特别是炎症性疾病的预防 治疗药的候选是有效的。此外，其作为免疫调节剂或研究用试剂也是有效的。另一方面，使活化信号水平增大的受试物质作为组织损伤或感染症的治疗药的候选是有效的。(III)调节Mincle与SAP130或FcRy的相互作用的物质的筛选方法在上述筛选方法(II)中，通过在SAP130的存在下进行受试物质与细胞的接触，除了可以筛选调节Mincle与FcR γ的相互作用的物质，还可以筛选调节Mincle与SAP130的相互作用的物质。同样，利用本筛选方法，使活化信号水平降低的受试物质被选作抗炎性物质、特别是炎症性疾病的预防 治疗药的候选。另一方面，使活化信号水平增大的受试物质被选作组织损伤或感染症的治疗药的候选。关于所选择的物质是否影响Mincle与SAP130、 或Mincle与FcRy的相互作用，例如可以通过结合使用上述筛选方法(I)或(II)来确认。(IV)调节Mincle的表达的物质的筛选方法本发明还提供调节炎症反应的物质的筛选方法，其特征在于在受试物质的存在下和不存在下，测定、比较产生Mincle的细胞中的该蛋白或编码该蛋白的mRNA的量。更具体而言，本发明的调节Mincle的表达的物质的筛选方法包括下述步骤(a)、 (b)和(c)(a)使受试物质与能够测定Mincle的表达的细胞接触的步骤；(b)测定接触了受试物质的细胞中的Mincle的表达量，将该表达量与未接触受试物质的对照细胞中的Mincle的表达量进行比较的步骤；(c)根据上述(b)的比较结果，选择使Mincle的表达量减少的受试物质的步骤。在步骤(a)中，受试物质如上所述。作为能够测定Mincle的表达的细胞，无论是内源性还是外源性，可以列举表达Mincle的所有培养细胞、或包含Mincle基因的内源启动子调节下的报道基因的细胞等。关于这些基因是否在培养细胞中表达，通过利用公知的 RNA印迹法或RT-PCR法检测这些基因表达，可以容易地确认。可测定Mincle的表达的细胞，可以以从非人哺乳动物中分离的产生Mincle的组织或脏器、以及非人哺乳动物个体的形态提供。或者，可以是导入有Mincle基因的内源启动子调节下的报道基因的转基因动物的细胞、组织、脏器或个体。以培养细胞或分离的组织、脏器等形态提供细胞时，受试物质与细胞的接触可以与上述同样进行。另一方面，以动物个体的形态提供细胞时，受试物质与细胞的接触通过对该动物给予受试物质来进行。对给药途径没有特别限定，例如有静脉内给药、动脉内给药、 皮下给药、皮内给药、腹腔内给药、口服给药、呼吸道内给药、直肠给药等。对给药量也没有特别限定，例如，以1次量计，约0. 5 20mg/kg，按照1日1 5次、优选1日1 3次，给药1 14天。在步骤(b)中，Mincle的表达量的测定以mRNA或蛋白为对象来进行。例如，由细胞制备总RNA，通过RT-PCR、RNA印迹等测定mRNA的表达量。至于蛋白的表达量，例如，由细胞制备提取液，利用免疫学方法进行测定。作为免疫学方法，可以采用蛋白质印迹法、放射性同位素免疫测定法(RIA法)、ELISA法、荧光抗体法等。使用包含连接在Mincle基因启动子下游的报道基因的细胞(例如萤光素酶、GFP)时，根据报道蛋白的信号强度来测定表达量。如后述实施例中所示，利用SAP130的存在诱导Mincle基因的表达。因此，在步骤 (a)中，通过在SAP130的存在下进行受试物质与细胞的接触，可以筛选能够调节由SAP130 的刺激诱导的Mincle基因的表达的物质。在步骤(a)中，作为使SAP130共存的方法，当以培养细胞等形态提供细胞时，可以列举向培养基中添加SAP130的方法，但通过添加利用放射线照射等诱导非稳态细胞死亡的细胞、或者对可测定Mincle的表达的细胞本身照射适当量的放射线等以部分性地诱导细胞死亡，也可以使SAP130共存。另一方面，以动物个体的形态提供细胞时，通过对该动物进行放射线照射等以部分性地诱导细胞死亡，可以提供 SAP130。使用RNA作为测定对象物时，具体而言，本发明的筛选方法可以如下实施根据 Mincle基因序列，利用公知方法制备引物或探针，再利用RNA印迹法、RT-PCR法、DNA芯片分析法、原位杂交分析法等，以RNA或其转录物与上述疾病标志物的结合量增大为指标进行筛选。利用RNA印迹法时，通过使用本发明的上述探针，可以检测、测定RNA中的Mincle 基因是否表达或其表达水平。具体而言，可以例示下述方法用放射性同位素(RI)或荧光物质等标志上述探针(互补链)，再按照常规方法使其与来自转移到尼龙薄膜等上的上述细胞的RNA杂交，之后针对所形成的上述探针(DNA)和RNA的双链，使用放射线检测器(BAS-1800II、富士 FILM社制)或荧光检测器，检测、测定来自疾病标志物的标记物 (RI或荧光物质)的信号。还可以采用下述方法使用Alk Phos Direct Labelling and Detection ^stem(碱性磷酸酶直接标记与检测系统)(Amersham Pharamcia Biotech社制)，按照该操作规程标志上述探针(探针DNA)，使其与来自受试者的活体组织的RNA杂交，之后使用 multibioimager ST0RM860 (Amersham Pharmacia Biotech 社制)检测、测定来自疾病标志物的标记物的信号。利用RT-PCR法时，通过使用在Mincle基因的核苷酸序列中具有连续的至少15个碱基的多核苷酸和/或与其互补的多核苷酸作为引物，可以检测、测定RNA中的Mincle基因是否表达或表达水平。具体而言，可以例示下述方法按照常规方法由来自上述细胞的 RNA制备cDNA，以其为模板，使制备的一对引物(与上述cDNA( “-”链)结合的正链、与“ + ”链结合的反链)与其杂交，使能够扩增靶Mincle基因的区，再按照常规方法进行PCR法，检测所得的扩增双链DNA。需要说明的是，检测所扩增的双链DNA时，可以采用下述方法使用预先用RI或荧光物质标志的引物进行上述PCR，检测由此产生的标志双链DNA的方法；按照常规方法将所产生的双链DNA转移到尼龙薄膜等上，使用已标志的疾病标志物作为探针并与其杂交，检测所扩增的双链DNA的方法等。需要说明的是，所生成的标志双链DNA产物可以利用Agilent 2100 bioanalyzer (横河Analytical Systems社制)等进行测定。此外， 还可以使用STOR Green RT-PCR试剂(Applied Biosystems社制)，按照该操作规程制备 RT-PCR 反应液,通过 ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社制)使之反应，检测该反应物。利用DNA芯片分析时，可以列举下述方法准备贴有Mincle基因部分序列作为 DNA探针(单链或双链)的DNA芯片，例如使按照常规方法由来自上述细胞的RNA制备并用生物素标志的cRNA与其杂交，利用荧光标志的抗生物素蛋白检测所形成的DNA与cRNA的双链。利用原位杂交法时，固定、包埋上述的上述细胞，制备切片。制作Mincle基因的特异性反义探针或正义探针。上述探针用RI标志或非RI标志(例如DIG标志)进行标记。 对上述切片进行脱石蜡(当为石蜡切片时)和前处理，之后用乙醇等固定。使固定的切片预杂交，之后与上述探针杂交，之后进行清洗和RNase处理，利用与标志对应的检测方法(例如，当为RI标志时，有显像的方法；当为非RI标志时，有免疫学检测和镜检的方法)，检测、 测定在活体组织中Mincle基因是否表达或其表达水平。使用蛋白作为测定对象物时，具体而言，本发明的筛选方法可以如下进行使用抗 Mincle抗体，利用蛋白质印迹法、放射性同位素免疫测定法(RIA法)、ELISA法、荧光抗体法、免疫细胞染色法等，以蛋白与上述抗体的结合量增大为指标进行筛选。利用蛋白质印迹法时，使用抗Mincle抗体作为一次抗体，之后使用以125I等放射性同位素、荧光物质、辣根过氧化物酶(HRP)等的酶等标志的二次抗体(与一次抗体结合的抗体)作为二次抗体，利用放射线测定器(BAS-1800II 富士 FILM社制等)、荧光检测器等检测、测定得到的标志化合物的来自放射性同位素、荧光物质等的信号，从而可以进行筛选。此外，还可以使用抗Mincle抗体作为一次抗体，之后使用ECL Plus Western Blotting Detection System(ECL Plus 蛋白质印迹法测定系统)(Amersham Pharmacia Biotech 社制)，按照该操作规程进行检测，通过 multibioimager ST0RM860 (Amersham Pharmacia Biotech社制)进行测定。利用免疫细胞染色法时，根据后述实施例4所述的方法，例如可以使用酶标记抗体和其显色底物来测定Mincle阳性细胞。在步骤(b)中，根据在受试物质的存在下、不存在下Mincle的表达量是否存在显著差异，来进行表达量的比较。需要说明的是，相对于接触了受试物质的细胞中的Mincle 表达量的测定，未接触受试物质的对照细胞中的Mincle的表达量可以是事先测定的表达量，也可以是同时测定的表达量，但从实验的精度、重现性的角度考虑，优选为同时测定的
表达量。在步骤(c)中，选择使Mincle的表达降低或增大的受试物质。使Mincle的表达降低的受试物质作为抗炎性物质、特别是炎症性疾病的预防·治疗药的候选是有效的。此外，其作为免疫调节剂或研究用试剂也是有效的。另一方面，使Mincle的表达增大的受试物质作为组织损伤或感染症的治疗药的候选是有效的。含有通过上述筛选方法(I) (IV)选择的物质的药物毒性低，可以直接以液剂的形式、或者以适当剂型的药物组合物的形式，对人或非人哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、 绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)进行口服或胃肠外(例如血管内给药、皮下给药等)给药。作为用于给药的药物组合物，可以是包含所选择的物质和药理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。这样的药物组合物以适合口服或胃肠外给药的剂型的形式提供。作为药理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，可以使用上述的物质。上述药物的给药量根据给药对象、对象疾病、症状、给药途径等而不同，例如用于治疗、预防成人的类风湿性关节炎时，活性成分以1次量计，通常为0. 01 20mg/kg体重左右、优选0. 1 10mg/kg体重左右、进一步优选0. 1 5mg/kg体重左右，按照1日1 5次左右、优选1日1 3次左右，通过静脉注射进行给药。在其他的胃肠外给药和口服给药的情况下，也可以根据这个量进行给药。症状特别严重时，根据其症状可以加量。本发明还提供非稳态细胞死亡的检测方法，其特征在于测定从受试动物中采集的试样中的SAP 130量。作为受试动物，例如有人或其他哺乳动物，优选为人、或通常用作实验动物的小鼠、大鼠、兔、狗、猴等。作为测定对象试样，可以列举血液、血浆、血清、淋巴液、唾液、粘膜、 尿、泪、精液、关节液。例如，可以使用抗SAP130抗体、Mincle或其片段来测定试样中的SAP130量，所述片段包含参与与该SAP130结合的区。具体而言，例如，向固定有第1抗SAP130抗体或 Mincle或其片段的反应容器(微量滴定板等)中添加试样液，培养一定时间后除去液相， 再添加已标志的第2抗SAP抗体或抗Mincle抗体，测定其与固相结合的标志量，从而可以定量SAP。作为标志物质，例如使用放射性同位素(例如[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等)、酶 (例如β -半乳糖苷酶、β -葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶)、荧光物质 (例如荧光胺、异硫氰酸荧光素等)、发光物质(例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、光泽精
寸J寸°除上述方法外，利用其他免疫学方法或表面等离子共振等，也能够测定试样中的 SAP130量，这为本领域技术人员所自明。上述测定的结果，与从健康对照中采集的试样中的SAP130量相比，从受试动物中采集的试样中的SAP130量明显高时，可以判定在该受试动物体内正发生非稳态细胞死亡。
实施例以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。[方法]小鼠从Clea Japan 购入 C57BL/6 (Β6)小鼠。VX Park, S. Y.等人，J Clin Invest 102， 1229-38(1998)中所述的方式进行操作，确立B6背景的FcR γ +小鼠。以Hara，H.等人，Nat Immunol 8,619-29(2007)中所述的方式进行操作，确立CARD9+小鼠，使其与B6回交6次。B6 背景的 MyD88+ 小鼠由 S. Akira(Osaka University)提供。Fc y RI+ 和 Fc y RIII+ 小鼠由J. S. Verbeek(Leiden University)提供。所有小鼠均维持在具有气体过滤器的层流的饲养架(rearing rack)中，自由摄取标准饵食和水。所有动物实验均按照我们的设施指南(facility guideline)进行。构建通过PCR克隆Mincle cDNA，之后将其插入pMX_IRES_hCD8载体50中。使用与以前记载的引物相同的引物(Matsumoto，M.等人，JImmunol 163，5039-48 (1999)) 制作Mincle-Flag。通过PCR使小鼠Mincle的胞外结构域(氨基酸46-214)与hlgG Fc融合，以构建Ig-Mincle融合蛋白。通过PCR克隆SAP130 cDNA,之后将其插入 pcDNA3. l-V5-His-T0P0(Invitrogen)巾。抗体相对于与小鼠Mincle的细胞质侧区相当的肽(氨基酸1_16)，制作兔抗Mincle 多克隆抗体° 抗 phospho_Erk Ab 从 Promega 购人，抗 phospho_Syk 从 Cell Signaling Technology 购入，抗人 IgG-HRP禾口蛋白 G Sepharose 从Amersham Biosciences (Pscataway, NJ)购入，抗大鼠 IgG-HRP 从 Zymed 购入，抗大鼠 IgG-PE 从 Jackson Immunoresearch 购入， 抗组蛋白-Hl和抗SAP 145从Santa Cruz购入，抗SAP49从Abcam购入，抗SAP 130从Novus Biologicals 购入，SAP155 从MBL购入，抗DDBl 从BD Biosciences 购入，而抗Flag 从 Sigma 购入。细胞刺激用抗Mincle和小鼠抗大鼠IgAbs刺激由巯基乙酸诱发的腹膜巨噬细胞。用 1% Nonidet P_40溶解缓冲液溶解细胞，如上所述(Yamasaki，S.等人，Nat Immunol 7， 67-75(2006))，进行免疫沉淀和蛋白质印迹。LPS(L4516)和酵母聚糖(zymosan) (Z4250)从 SIGMA购入。Ig-Mincle 的制备通过PCR使Mincle的胞外结构域(氨基酸46-214)与缺失了终止密码子的hlgG Fc区的C末端融合，之后将其插入pME18S-SLAMsig-hIgG Fc的)(hoI/NotI片段中。利用 pME18S-SLAMsig-hIgG Fc(Ig)或 pME 18S-SLAMsig_hIgG Fc-Mincle(Ig-Mincle) 一过性转染细胞。用无蛋白培养基(PFMH-II)培养细胞。过滤的上清添加到ftOtein A-Sepharose柱上，用50mM的二乙胺洗脱已结合的组分，之后立刻用Tris-HCl (pH7. 5)中和。用PBS透析主要组分，用作纯化Ig融合溶液。通过银染色和使用了抗hlgG-HRP (Pierce) 的蛋白质印迹法估计蛋白的分子量和纯化度。亮氨酸拉链化!^s-配体(FasL)由 S. Nagata (Kyoto University)提供。分子模型Mincle的序列从NCBI server获得。提取79 214残基的范围的Mincle的部分序列，利用同源性模型的一般方法预测其三维结构。WftOtein Data Bank(PDB)获得 DC-SIGN(PDB-entry =Infd)的晶体结构，作为用于生成同源性模型的模板。利用NW比对 (NW alignment) ,HMincle的部分序列与模板蛋白对齐。为了得到适当的比对，将Mincle 中的缺口(gap)和Cys残基手动取代成模板中对应的Cys残基的位置。得到适当的比对， 使靶蛋白中的主链的原子位于DC-SIGN的模板蛋白中对应的残基坐标上。通过从由具有公
24知结构的蛋白的片段制作的片段数据库中探索合适的结构，塑造环区中的插入和缺失。利用Metropolis Monte Carlo法，在Mincle模型的主链上构建侧链。为了将结构最优化，使用分子动力学包装的AMBERS，通过最速下降法进行2000阶段的最优化。利用ViewerLite(Accelrys)制作图 Id。RT-PCR通过DNase (Wako Nippon Gene)处理除去基因组DNA，之后使用逆转录酶 II anvitrogen)，通过随机引物生成cDNA链。通过使用基因特异性引物，利用实时PCR定量RNA的表达，值通过β-肌动蛋白的表达进行规范化。基因特异性引物序列如下。β-肌动蛋白，5，-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3，(正向)5，-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3，(反向)；IL-6,5，-TTCCATCCAGTTGCCTTCTTGG-3，(正向)5，-CTTCATGTACTCCAGGTAG-3，(反向)；TLR2,5，-CAGCTTAAAGGGCGGGTCAGA-3，(正向)5，-TGGAGACGCCAGCTCTGGCTC-3，(反向)；Mincle,5，-GCTCCAGCAGGGAACAATAG-3，(正向)5，-GCCCTTTGATGGAATTCAGA-3，(反向)；以及FcRy ,
5，-CCTTCCCTTCCCTCTACACC-3，(正向) 5，-AAGGTAAGGCAGGGTGGTCT-3，(反向)。 统计学
统计分析全部采用无对应的两侧Studentt检验来进行。 [实施例1]用表达小鼠Mincle的嗜碱性粒细胞性白血病(RBL-2H3)细胞对Wistar大鼠进行免疫，建立抗Mincle单克隆抗体。通过将表达Mincle-IRES-GFP的2B4细胞染色，筛选克隆化杂交瘤的上清。研究3个独立克隆lB6(IgGl，K)、4A9(IgGl，κ)和6E2(IgG2c，κ)的特征(图1)，用于本研究。各单克隆抗体中的内毒素的水平为lEU/ml (Limulus Color KY Test,Wako)以下。单克隆抗体的生物素化使用EZ-Iink生物素化试剂盒(Pearce)来进行 (图 1)。抗Mincle单克隆抗体的表位作图通过基于肽的ELISA(ρ印tide-based ELISA) 来进行。利用JPT Peptide Technologies合成包含Mincle的胞外结构域(长度为13a. a、重复为11a. a.)的79个生物素化肽。使各肽以0. 5nM与用链霉亲和素包被的多孔板 (PerkinElmer)结合。用1 μ g/ml的BSA封闭后，加入10 μ g/ml的大鼠IgG和抗Mincle单克隆抗体。清洗后，加入1 μ g/ml的抗大鼠IgG-HRP，用TMBZ过氧化物酶底物(SUMIL0N)进行显色(图1)。[实施例2]
由小鼠、大鼠和人的Mincle氨基酸序列的比对可知在跨膜结构域内存在保守精氨酸残基(图2a)。关于其他免疫受体，如记述的那样，提示由于该跨膜部分内的带正电的残基的存在，Mincle与包含ITAM的衔接分子(FcR y、DAP10、DAP12和CD3 ζ )发生相互作用。为了验证Mincle能否与这些亚单元中的任一种结合，将Mincle与这些衔接子一同转染到293Τ中。通过使用了新确立的抗Mincle抗体(图1)的免疫沉淀和蛋白质印迹分析， 可知=Mincle选择性地与FcR γ结合、而不与DAP10、DAP12和CD3 ζ结合(图2b和数据省略)。重要的是，即使在小鼠腹膜的巨噬细胞内，也明确了内源性Mincle与FcRy的结合 (图2c)。而且，我们还确认到人Mincle也与FcR γ结合(数据省略)。Mincle与FcR γ 的相互作用是通过Mincle的跨膜区内的Arg42 (R42)残基进行的。这是由于如通过相互的免疫沉淀所证明的那样(图2d)，通过R42I (由带正电变为中性)突变，Mincle与FcRy的结合消失。该结合对Mincle传递信号似乎是重要的。这是由于若使Mincle和FcR γ在 T细胞杂交瘤中异处表达，则由Mincle的交联诱导的IL-2产生依赖于R42 (图2e)。虽然 Mincle中在其细胞质侧区存在潜在的丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点，但缺失C末端侧尾部的 Mincle的缺损突变体(Mincl^2—18)并没有减弱在同样的系统中的信号传递能力(数据省略)。这些结果提示=Mincle可以进行由FcRy介导的信号传递。[实施例3]接下来，为了验证内源性Mincle能否变换活化信号，用抗Mincle抗体刺激由巯基乙酸诱导的腹膜的巨噬细胞。通过固定的抗Mincle诱导了 TNF α、MIP-2 (CXCL2)(图 3a)、KC(CXCLl)和IL_6(数据省略)的产生，但对照IgG则没有诱导它们的产生。虽然在 FcR γ +细胞中没有Mincle诱导性的炎症性细胞因子的产生，但通过FcR γ非依赖性LPS 刺激，诱导了可比量的细胞因子(图3b)。衔接子MyD88对于TLR信号传递是重要的，但对于由Mincle介导的细胞因子产生并不是必须的(图3b)。因此，Mincle是FcR γ依赖性地变换活化信号，以将其传递到巨噬细胞中。接下来，我们研究在Mincle刺激时产生的近位信号。通过Mincle的交联，在腹膜的巨噬细胞中诱导了包含激酶Syk和Erk的细胞蛋白的磷酸化(图3c)。在多个免疫受体中，Syk直接与磷酸化ITAM结合，诱导了下游的多个底物的磷酸化。因此，由抗Mincle 单克隆抗体诱导的总体的酪氨酸磷酸化在FcR γ+巨噬细胞中被显著抑制(图3d、右泳道)，但这也提示=Mincle为了诱导下游信号而利用FcR γ-Syk级联。抗Mincle介导的磷酸化在FcR γ +巨噬细胞中减少，但在FcyRI/III(⑶64/16)双重缺损巨噬细胞中依然可以观察到(图3d、左泳道)。由此提示抗Mincle不依赖于Fc γ受体(Fe y R)，而是通过 Mincle-FcRy复合体直接进行信号传递。最近，研究显示衔接分子CARD9对于联结Syk和炎症反应是必须的。因此，我们在野生型、FcR γ ι和CARD9+小鼠的巨噬细胞中比较由抗Mincle诱导的反应。在CARD9+腹膜巨噬细胞中，由Mincle诱发的ΜΙΡ-2的产生被减少至与FcR γ ‘细胞中相同的程度(图 3e) ο关于Mincle信号传递，我们也验证了其在来自骨髓的巨噬细胞(ΒΜΜΦ)中的情况。与腹膜巨噬细胞一致，活化ΒΜΜΦ中的Mincle介导的MIP-2产生(图3f)和 Syk活化(图3g)并不依赖于MyD88、而是依赖于FcRy。这些结果提示=Mincle通过 FcR y -Syk-CARD9信号传递轴来激活巨噬细胞。
[实施例4]对于Mincle的表面表达，本质上FcR γ并不是必要的(数据省略)，但在FcR γ + BMM Φ中，LPS诱导性的内源性Mincle的表面表达的亢进较野生型弱。但是，更有意义的是，我们发现该上升是MyD88非依赖性的(图4)。[实施例5]接下来，我们要找出Mincle的生理学配体。由骨髓性细胞诱导的炎症性细胞因子和趋化因子的分泌，是有可能用于筛选配体候选的指标。但是，这样的细胞因子和趋化因子在TLR刺激时也会大量产生。因此，为了与有可能污染推定上的Mincle配体的TLR配体进行区别，我们使用非骨髓性T细胞杂交瘤作为宿主细胞，而且利用NFAT-GFP报道基因作为 ITAM介在性信号的特异性检测方法。我们确立了共表达Mincle、FcR γ和NFAT-GFP报道基因的T细胞杂交瘤。虽然可溶性的抗Mincle不影响GFP表达(数据省略)，但通过由包被在板上的抗Mincle引起的Mincle的交联，诱导了强烈的GFP表达(图5a)。如预想的那样，利用LPS或酵母聚糖等 TLR配体，没有观察到GFP诱导(数据省略)。更有趣的是，我们发现不交换培养基而直接培养细胞3 4天时，显著诱导 NFAT-GFP表达(图5b、冒头面板)。在该培养期间，死细胞的数目增加，而同时GFP+的集团增加(图5b、C)。在只有FcR γ表达、而Mincle不表达的细胞中，没有观察到GFP的表达(数据省略)，NFAT活化几乎完全被可溶性抗Mincle单克隆抗体抑制(图5b、下面板)。 这些结果提示也许来自死细胞的成分是通过Mincle传递信号。与该假说一致，在与碘化丙啶(PI)阳性的死细胞结合的状态下观察到几个GFP+ 细胞(图5c)。拓扑异构酶II抑制剂依托泊甙通过诱导DNA损伤来促进细胞死亡。即使单纯添加进行了依托泊甙处理的死细胞，也可以将Mincle表达性细胞活化(图5d)。这些结果提示尚未明确的Mincle的配体在细胞死亡期间被生成和/或释放出来。Mincle在其C型凝集素结构域内包含已进行了充分研究的甘露糖结合模体、即 EPN模体。为了试验由Mincle进行的死细胞的识别是否与甘露糖或关联的烃有关，我们使 Mincle的EPN模体发生突变，形成QPD模体。已知QPD模体选择性地与半乳糖结合。具有 E169Q/N171D(MincleEPN->QPD)的突变型Mincle依然与野生型同样地传递响应死细胞的活化信号。由此提示=Mincle识别其配体，但不依赖于烃(图5e)。的确，最近的报道显示 C型凝集素与烃配体同样地识别非烃配体。在缺失由强效抑制的单克隆抗体1B6识别的表位的VEGQW序列(图1)的Mincle的突变体中，NFAT的活化消失(图5e)。由此提示这些残基对于识别来自死细胞的Mincle配体是重要的。[实施例6]为了进一步研究来自死细胞的Mincle配体，我们构建了可溶性Mincle蛋白。由于Mincle是II型膜蛋白，因此使Mincle的胞外结构域与人免疫球蛋白G的Fc结构域融合 (Ig-Mincle)(图6a)。我们首先验证了 Ig-Mincle是否特异性地识别死细胞。Ig-Mincle 选择性地与膜联蛋白V+PI+的胸腺(图6b)和2B4死细胞(数据省略)结合，而对照Ig则不与其结合。因此，死细胞似乎是表达Mincle结合蛋白。特别是，即使清楚了对于Ig-Mincle通过凝集素识别烃性配体而言Ca2+是必须的， 但是在没有Ca2+的情况下Ig-Mincle与死细胞结合。因此，为了搜索Mincle配体的候选，
27我们使用Ig-Mincle，在不存在Ca2+的情况下从死细胞的溶解产物中探索Mincle结合蛋白。 我们通过可以重现的方法，发现了特异性地与Ig-Mincle结合、而不与对照Ig结合的130kD 的蛋白(pl30)(图6c)。于是，我们使用死细胞的溶解产物，通过一系列的柱纯化，来纯化 Mincle结合蛋白(图7)。通过质谱分析可知所有10个来自pl30的肽相当于作为U2低分子核内核糖核蛋白(snRNP)24的成分的剪接体结合蛋白130 (还作为SAP130、Sf3b3而已知)(图6d)。SAP130与因UV而损伤的DNA所结合的损伤DNA结合蛋白I(DDBl)明显同源。但是， 在使用了抗-SAP130的免疫印迹中，明确Ig-Mincle选择性地与SAP130结合、而不与DDBl 结合(图6e)。作为核蛋白的高迁移率族蛋白1 (high mobility group box 1,HMGB1)仍然是Mincle配体的另一候选，据报道，该核蛋白由死细胞分泌，其发挥警告免疫系统有过剩或非稳态细胞死亡的信号的作用。但是，HMGBl与Ig-Mincle (图6e、f)和活化Mincle表达性NFAT-GFP (数据省略)均不发生相互作用。这些结果提示SAP130选择性地与Mincle
纟口口。在细胞死亡过程中发生的磷酸化、糖基化、遍在蛋白化或甲基化等蛋白修饰，有可能赋予SAP130与Mincle结合的能力。为了验证该想法，比较来自活细胞和死细胞的SAP130 与Mincle的结合能力。图6f中显示=Mincle与来自活细胞和死细胞的SAP130同等地充分结合。这暗示没有以蛋白修饰的水平调节有关过剩的细胞死亡的SAP130的信号。在正常活细胞中SAP130存在于细胞核中，细胞死亡时SAP130向外部环境中移动， 这能够成为有关非稳态细胞死亡的警告信号。的确，已知snRNPs的其他构成成分的Sm蛋白从后期的凋亡或坏死细胞移动到上清中。与该想法一致，与仍然是另一典型核蛋白的组蛋白Hl相比时，有相当量的SAP 130从死细胞中释放出来(图6g)。在Fas-配体(Fas-L) 诱导性细胞死亡期间也明确了 SAP130的释放，与碘化丙啶(PI)+的后期凋亡/坏死细胞的出现密切相关(图6h)。[实施例7]培养2B4T细胞杂交瘤4天，以生成死细胞。用1 % NP-40溶解缓冲液(1 % NP-40, 50mM Tris,150mM NaCl,5mM EDTA，10 μ g/ml 抑肽酶、12. 5 μ g/ml 胰凝乳蛋白酶抑制剂、 5(^8/1111亮抑酶肽、25 48/1111抑肽素4、11111苯甲基磺酰氟)溶解IX IO8个细胞。使用庚二亚氨酸二甲酯(Pierce)和乙醇胺，使Ig和 Ig-Mincle蛋白与Protein G Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Bioscience)进行共价结合。细胞溶解产物通过Protein G S印harose洗脱2次，然后通过Ig-coupled Protein G S印harose洗脱3次。将流过的组分添加到结合有Ig-Mincle的Protein G S印harose柱中，用溶解缓冲液清洗柱。通过与试样缓冲液煮沸来洗脱结合组分，用SDS-PAGE进行分离，然后转移到PVDF上，用胶体金全蛋白染色液 (Colloidal Gold Total Protein Stain) (Bio-Rad)进行染色。切出相当于 pl30 的谱带， 通过 MALDI-T0F/MS in Protein Research Network, Inc.进行分析(图 7)。为了从哺乳动物细胞中纯化SAP130，在293T细胞中表达带有V5 tag的SAP 130， 再使用抗V5琼脂糖从细胞溶解产物中纯化，然后用V5肽洗脱。为了纯化在杆状病毒中表达的 SAP130，将 SAP130 cDNA 插入 pLP-BacPAK9_6xHN 杆状病毒载体(Clontech)中，使 Sf9 细胞感染重组杆状病毒。使用Q-S印harose Fast Flow(GE Healthcare)和TALON金属亲和树脂(Clontech)来纯化细胞上清(图7)。
[实施例8]接下来，我们验证纯化SAP130能否激活Mincle表达细胞。为了从哺乳动物细胞中纯化重组SAP130，使带有V5 tag的SAP130在293T细胞中表达，之后使用抗V5-琼脂糖， 将其与V5肽一同洗脱，从细胞溶解产物中纯化重组SAP130。在包被在板上的抗V5上用 SAP130-V5刺激腹膜巨噬细胞时，有相当量的MIP-2分泌到上清中(图8a)。利用同样的刺激，从表达Mincle和FcR γ的T细胞杂交瘤中也诱导IL-2产生(图8b)。由此可知纯化蛋白的活性是由于污染的内毒素产生的可能性极小。我们还确认到SAP-130-V5对没有表达Mincle的亲本细胞没有任何影响(图8b)。并且，由Mincle表达细胞介导的SAP130-V5 诱发性IL-2产生几乎完全被可溶性抗Mincle单克隆抗体抑制(图8b)。这些结果提示 SAP130可以发挥Mincle的内源性配体的作用。我们使用杆状病毒表达载体，在昆虫细胞中还生成带有重组HN tag的SAP130。重组SAP130保有在巨噬细胞中产生MIP-2的免疫刺激活性(图8c)。总结这些结果时，提示SAP130是Mincle的功能性配体。由于SAP130是内源性核蛋白，因此由Mincle进行的SAP130的识别能够成为发生过剩细胞死亡的信号。[实施例9]最后，我们研究Mincle在体内的生理学功能。根据若干报道，证明尽管没有感染，但通过过剩或非稳态细胞死亡诱导了炎症性细胞的一过性浸润。在用于研究该现象的模型系统中，包括小鼠的全身放射线照射，而这会在皮质区中诱导CD4+CD8+双重阳性(DP) 胸腺细胞的大量死亡(图9a、b)，并且，结果会诱发嗜中性粒细胞在胸腺中一过性浸润(图 %、右面板)。有报道称在p53+小鼠等没有发生DP胸腺细胞死亡的突变小鼠中浸润减少，因此该嗜中性粒细胞的浸润似乎是过剩的细胞死亡的结果。我们还确认象缺失DP胸腺细胞的Rag2+小鼠(数据省略)一样，在细胞凋亡抵抗性的Apafl+小鼠中，照射后嗜中性粒细胞的浸润少很多。我们发现全身照射后，Mincle mRNA急速上升(图9c)。Mincle的上升发生在 TLR2和FcRy的诱导之前，这显示胸腺内的炎症性细胞的浸润，因此该上升起因于Mincle 的转录活化(图9c)。接下来，我们验证通过识别死细胞，Mincle是否会诱发嗜中性粒细胞浸润。通过给予抑制用的抗Mincle单克隆抗体，照射后嗜中性粒细胞在胸腺中的浸润得到显著地抑制(图9d、e)，但另一方面，通过单克隆抗体处理，胸腺细胞的死亡频率本身并没有改变(数据省略)。有报道称由胸腺的巨噬细胞产生的MIP-2对于嗜中性粒细胞的补充是重要的。 抗Mincle处理抑制由胸腺的巨噬细胞诱发的MIP-2产生(图9f)。由此提示该单克隆抗体抑制Mincle-配体相互作用，以从巨噬细胞中诱导炎症性细胞因子/趋化因子。[实施例10]通过抗Mincle单克隆抗体处理，由地塞米松诱导性的胸腺细胞死亡引起的嗜中性粒细胞的浸润也有所减少(图10)。与克隆4A9相比，单克隆抗体克隆1B6对嗜中性粒细胞浸润的抑制效果更强效，这与体内的B6对Mincle的更强效的抑制效果一致(图5b)。[实施例11]抗Mincle不影响通过LPS刺激的嗜中性粒细胞的体内输送(图11)。因此，当胸腺细胞死亡时，在嗜中性粒细胞的浸润中，其中大半都是由Mincle介导的。[实施例12]因为C型凝集素受体识别各种自身和非自身配体，因此显示其是重要的免疫受体的证据正在增加。由C型凝集素识别的病原体成分已充分描述，但自身配体还没有被如此地充分了解。大致说来，认为它们是与组织损伤有关的分子。例如，内吞作用受体的MBL、 Lox-I和MGL-I识别来自死细胞的配体，并能够参与它们的清除。由于抗Mincle单克隆抗体不抑制胸腺死细胞的吞噬作用，由此认为Mincle不是内吞作用受体(图12)。迄今为止，还没有受体识别已损伤的自身，但某凝集素受体可以通过ITAM介导信号传递。因此，Mincle 是直接识别死细胞的最初的ITAM共轭性受体。[实施例I3]我们鉴定了 SAP 130作为Mincle的配体。在U2 snRNP复合体内，SAP 130与SAP 145、 SAP 155和SAP49发生相互作用而形成剪接体(图13a)。因此，虽然SAP155、SAP 145和 SAP49也和Ig-Mincle同时发生共沉淀，但效率不如SAP130好(图13b)。我们的使用了纯化SAP130的数据提示其独立活化Mincle表达细胞，但复合体的形成是否使Mincle的反应性亢进，目前尚不明确。产业实用性利用本发明的筛选方法，可以探索能够从根本上抑制炎症反应的活化信号的新的抗炎药。而且，可以为炎症性疾病的治疗提供由此得到的本发明的抗炎药。利用本发明的诊断方法，可以诊断在诱导炎症反应的组织中是否有细胞死亡。并且，能够探索炎症反应的激动剂，该激动剂可以用作以适当的水平促进嗜中性粒细胞在损伤或病原体感染的组织中的浸润、其结果可以提供促进组织修复的治疗药。本发明以2008年7月17日申请的日本国专利申请、特愿2008-186570为基础，其内容全部包含在本说明书中。
权利要求
1.抗炎药，其中含有抑制Mincle的表达、或者Mincle与SAP130或FcRγ的相互作用的物质。
2.权利要求1所述的药物，其中，抑制Mincle与SAP130的相互作用的物质是抗Mincle 抗体。
3.权利要求2所述的药物，其中，抗体识别SEQID NO :2所示的人Mincle的氨基酸序列中氨基酸编号146 150所示的氨基酸序列或其他哺乳动物的直系同源中的对应的氨基酸序列。
4.权利要求1所述的药物，其中抑制Mincle与SAP130的相互作用的物质是包含SEQ ID NO 2所示的人Mincle的氨基酸序列中氨基酸编号146 150所示的氨基酸序列或其他哺乳动物的直系同源中的对应的氨基酸序列的肽。
5.权利要求1所述的药物，其中，抑制Mincle与SAP130的相互作用的物质是抗SAP130 抗体。
6.权利要求1所述的药物，其中，抑制Mincle的表达的物质是抗Mincle基因的反义核酸、核酶或siRNA。
7.权利要求1所述的药物，其中，抑制Mincle与FcRγ的相互作用的物质是抗Mincle 和/或FcR γ抗体。
8.权利要求1所述的药物，其中，抑制Mincle与FcRγ的相互作用的物质与Mincle的跨膜结构域中包含保守精氨酸残基的位点结合。
9.权利要求1 8中任一项所述的药物，该药物用于炎症性疾病的预防和/或治疗。
10.调节炎症反应的物质的筛选方法，其特征在于在受试物质的存在下和不存在下， 使Mincle或包含其胞外区的片段与SAP130接触，比较两种条件下Mincle或其片段与 SAP 130的相互作用的程度。
11.调节炎症反应的物质的筛选方法，其特征在于在受试物质的存在下和不存在下， 测定、比较表达Mincle或包含其胞外区和跨膜区的片段和FcR γ的细胞中Mincle或其片段与FcR γ的相互作用的程度。
12.权利要求11所述的方法，该方法以由Mincle和FcRy介导的信号传递路径的活化为指标，比较Mincle或其片段与FcRy的相互作用的程度。
13.权利要求12所述的方法，该方法以启动子调控下的基因的表达为指标，所述启动子包含通过由Mincle和FcR γ介导的信号传递而活化的转录因子所能结合的核苷酸序列。
14.权利要求11 13中任一项所述的方法，其特征在于进一步使SAP130共存。
15.调节炎症反应的物质的筛选方法，其特征在于在受试物质的存在下和不存在下， 测定、比较产生Mincle的细胞中的该蛋白或编码该蛋白的mRNA的量。
16.权利要求15所述的方法，其特征在于进一步使SAP130共存。
17.权利要求10 16中任一项所述的方法，该方法用于选择具有抗炎作用的物质。
18.非稳态细胞死亡的检测方法，其特征在于测定从受试动物采集的试样中的 SAP 130 量。
全文摘要
本发明提供新的炎症反应的调节方法，该方法通过调节由非稳态细胞死亡引起的炎症响应的信号传递来进行。具体而言，本发明提供抗炎药，其中含有抑制Mincle的表达、或者Mincle与SAP130或FcRγ的相互作用的物质；调节炎症反应的物质的筛选方法，其特征在于，在受试物质的存在下和不存在下，使Mincle或包含其胞外区的片段与SAP130接触，比较两种条件下Mincle或其片段与SAP130的相互作用的程度；以及非稳态细胞死亡的检测方法等，该检测方法的特征在于，测定从受试动物采集的试样中的SAP130量。
文档编号G01N33/15GK102170910SQ200980136730
公开日2011年8月31日 申请日期2009年7月17日 优先权日2008年7月17日
发明者山崎晶, 齐藤隆 申请人:独立行政法人理化学研究所