专利名称：方法
技术领域：
本发明涉及用于在受试者中检测癌症，特别是5T4阳性癌症的方法。本发明还涉及此类方法用于诊断癌症和监测癌症的进展和/或治疗的用途。
背景技术：
前列腺癌(PCa)仍然是西半球最流行的男性癌症，2008年预期在美国预计有 186，000 例新病例，和 28, 000 例死亡(American Cancer Society, Atlanta, Georgia 2008)。虽然在了解此疾病下的生物学方面及在其治疗的许多方面正在取得进展，但是仍需要用于PCa诊断和监测的更好的工具。本发明涉及一种用于检测癌症，诸如前列腺或膀胱癌的新的基于生物标志物的方法，其提供了一种用于早期疾病检测、用于鉴定适合于特定疗法的患者、和用于监测治疗/ 疾病进展的非侵入性技术。发明概述本发明人令人惊讶地发现了癌症相关生物标志物5T4在来自癌症患者的外来体， 诸如尿外来体中表达，而且是可检测的。5T4的表达表现为在外来体中/上高于在正常细胞中/上。如此，在第一方面，本发明提供了一种用于在受试者中检测5T4阳性癌症的方法， 其包括下列步骤(i)鉴定来自所述受试者的样品中的外来体和/或自来自所述受试者的样品纯化外来体；并(ii)检测外来体相关5T4。所述方法可以牵涉检测例如5T4肽、多肽或编码此类肽或多肽的核酸。5T4阳性癌症可以是生殖泌尿道癌症，诸如前列腺或膀胱癌。样品可以是例如尿液样品、血液样品、或自其可衍生的样品，诸如血清样品。尿外来体中5T4的检测具有尿液样品非侵入性可获得的优点。或者，样品可以来自肺的胸腔积液，或组织样品。为了证实和/或量化结果，所述方法还可以牵涉检测下列一项或多项(i)在5T4外的癌症生物标志物；(ii)外来体标志物；和/或(iii)特定组织或细胞类型的标志物。对于例如前列腺癌检测，所述方法可以牵涉检测一种或多种前列腺标志物，诸如 PSA、PSCA 禾口 /^PSMA0在第二方面，本发明提供了一种通过使用依照本发明的第一方面的检测方法来测定受试者中的给定癌症是否是5T4阳性癌症的方法，其中5T4的检出确认所述癌症是5T4 阳性的。在第三方面，本发明提供了一种用于在受试者中治疗癌症的方法，其包括下列步骤
(i)通过依照本发明的第二方面的方法来测定所述癌症是否是5T4阳性的；并(ii)对通过步骤⑴测试呈阳性的受试者施用基于5T4的治疗剂在第四方面，本发明提供了一种用于测定给定受试者是否会适合于用基于5T4的治疗剂治疗的方法，其包括通过依照本发明的第一方面的方法来检测所述受试者中的5T4 阳性癌症的步骤。在第五方面，本发明提供了一种使用依照本发明的第一方面的检测方法来监测 5T4阳性癌症进展的方法，其包括比较在多个时间点时自受试者采集的样品中的外来体相关5T4的水平的步骤，其中升高指明所述5T4阳性癌症的恶化，而降低指明改善。本发明的第五方面的方法可以用于在治疗期间监测5T4阳性癌症的进展，其中在治疗期间的多个时间点时自受试者采集样品。癌症治疗可以牵涉施用基于5T4识别或表达的治疗剂。在第六方面，本发明提供了一种用于在受试者中检测5T4阳性癌症的试剂盒，其包括(i)外来体检测、收集和/或纯化系统；和(ii)针对5 的检测系统。检测系统可以例如检测5T4肽、多肽或编码此类肽或多肽的核酸。检测系统还可以量化5T4的水平。结合本发明，可以使用下列一种或多种方法来检测5T4 ⑴结合抗5T4抗体；(ii)结合对由MHC分子呈递的5T4肽特异性的T细胞受体；(iii)结合与编码5T4的核酸序列整个或部分的互补物显示高程度同一性的核酸序列；和(iv)使用5T4特异性引物来扩增5T4核酸。附图简述
图1 尿液衍生外来体的纯化将健康供体尿液进行外来体纯化，并在每个步骤，保留10 μ 1样品以进行电泳分析(4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶，银染色)(Α)，表明有效除去主要的非外来体蛋白质条带诸如为约80Kd的，并在最终的外来体产物中显著富集多种多样的蛋白质种类(A)。运行平行凝胶以进行免疫印迹分析，其使用如标示的针对典型外来体蛋白质的抗体进行(B)。 比较蔗糖垫法与Pisitkim等的更简单的方法，其中将细胞培养基(C)或新鲜尿液(D)以 17，OOOg进行离心，接着以200，OOOg沉淀。对于蛋白质差异，使外来体(来自蔗糖法)和 200，OOOg沉淀物标准化，并通过Wfestern印迹对2. 5 μ g/孔分析如标示的标志物。图2 量化健康供体和前列腺癌患者中的尿液衍生外来体使用BCA蛋白质测定法来测量每份制备物中存在的外来体数量。在尿液样本体积方面校正数值，并以ng外来体/ml尿液表示。比较来自10名健康供体和在ADT4 G周ADT 后)、ADT12 (3个月的ADT后)、和RT2tl (和20份放射疗法后)时的10名经历标准疗法的PCa 患者的制备物。工形线表示均值+SE。显示了使用Wilcoxon配对检验得到的*p < 0. 5。图3 表征由LNCaP前列腺癌细胞系生成的外来体。将如标示的前列腺癌细胞系(LNCaP和DU145)在培养物中作为阳性对照前列腺癌外来体的来源维持(用于随后的分析)。用如标示的一组抗体通过SDS-PAGE (5 μ g/孔)来分析全细胞溶胞物(CL)或外来体(Exo)。图4 表征来自健康供体尿液的外来体6名健康供体(表3中详述)提供了尿液样本，并将外来体纯化。用5 μ g尿液衍生外来体/孔，或用5 μ g LNCaP衍生外来体(Exo)或5 μ g LNCaP全细胞溶胞物(CL)进行 Western印迹。用如标示的针对PSA、TSG10U5T4, CD9和GAPDH的抗体来探查印迹。图5 表征来自PCa患者的外来体用如标示的一组抗体将自8名PCa患者(在ADT4、ADT12或RT2tl时)分离的尿外来体(5 μ g/孔)进行Western印迹分析。在每块凝胶上包括LNCaP的全细胞溶胞物(CL)或外来体(Exo) (5 μ g/孔)作为阳性对照。图6 患者的Wfestern印迹数据的汇总图7 使用Western印迹、流式细胞术和电子显微术来表征HT1376衍生外来体使用如标示的一系列抗体通过Wfestern印迹来比较细胞(CL)或外来体(Exo)溶胞物(5yg/孔)。这表明外来体中数种蛋白质的相对富集。一些标志物诸如gp96是外来体所没有的，这指明细胞碎片对制备物的污染可忽略(这代表3次实验)(A)。通过流式细胞术来分析与胶乳珠偶联的外来体，并且这揭示了四跨膜蛋白(tetraspanin)分子在外来体表面上的阳性表达。显示了中值荧光强度值(MFI)(代表大于5次实验)(B)。在与胶乳珠偶联前用增加量的FBS有意污染纯化的外来体揭示了 CD9的信号强度降低(均值士SEM， η = 6，#ρ < 0.001，单因素ANOVA及Tukey氏后检验)(B线图)。将以70，OOOg自细胞条件化培养基沉淀的材料铺于线性蔗糖梯度(0.2至2.02Μ)上，并以210，OOOg超速离心18 小时。通过折光测定法来分析所收集的级分以确定级分密度，此后使用针对作为外来体标志物的TSGlOl的抗体通过Wfestern印迹来分析。TSGlOl以1. 1和1. 2g/ml之间的典型外来体密度漂浮(代表4次实验)(C)。典型外来体制备物的透射电子显微照片，其揭示了直径为30和IOOnm之间的异质小囊泡(D)。图8 纳级LC/MS衍生的蛋白质鉴定针对来自ExoCarta和GeneGO的基因集的过度表示分析的汇总。为了便于与Exocarta基因集比较，首先将我们的蛋白质列表转换成EntrezGene 鉴定的基因列表，之后使用超几何分布来进行0RA。过滤结果以仅包括与基于MS的研究的比较，及与报告10种或更多种匹配基因的那些比较。这表明我们的MS数据多么好地与来自规定细胞类型的外来体蛋白质谱比较，其以在假检出率方面校正的对数(P值)显示㈧。 对于鉴定的蛋白质列表，使用MetaCore进行的ORA分析利用SwissProt ID。为了清楚，我们报告了组标题疾病生物标志(B)、疾病(C)、生物学过程(D)和细胞区室(E)之每项内含有的前10种过度表示的基因。虚线标示ρ = 0. 05，因此这左侧的柱不是统计学显著的。图9 通过Wfestern印迹和流式细胞术分析验证一些经MS鉴定的蛋白质通过^festern印迹对通过标准蔗糖垫法纯化的HT1376外来体(5_20 μ g/孔)分析如标示的一系列经MS鉴定的蛋白质的表达(A)。通过在线性蔗糖梯度(0. 2M至2. 5M)上离心来将自HT1376细胞条件化培养基获得的70，OOOg沉淀物进行分级。收集15个总级分， 并通过折光测定法来测量密度。此后，将每个级分的1/3与胶乳珠偶联，接着是对如标示的外来体表面表达的流式细胞术分析(B)。平行地，对于如标示的蛋白质，将每个级分剩余的
62/3进行Western印迹(C)。数据揭示于公认的外来体密度范围(1. 12-1. 2g/ml)漂浮的蛋白质。(数据代表2次实验)。图10 使用2DE和MS来分析HT1376衍生外来体通过在pH 3-10非线性梯度上的2DE解析来自HT1376外来体的蛋白质提取物。通过银染色来显现蛋白质(A)。随机选择32个点，切出凝胶栓，并在胰蛋白酶消化后回收肽。 这些中，对17个点获得成功的鉴定(在A中注释)，并列出MS鉴定的详情(B)。来自数据集的代表性MS/MS分析显示于(C)，肽来自整联蛋白α-6，点10。肽具有1191. 9的前体质量，并加以注释以显示衍生的肽序列。图IlA和B 外来体表达表面5Τ4，其通过微量板测定法检测。发明详述5Τ4本发明涉及一种用于在受试者中检测5Τ4阳性癌症的方法。5Τ4是一种在癌瘤中广泛表达，但是在正常成体组织中具有高度限制性表达样式的72kDa跨膜糖蛋白(参见表1)。它表现为与结肠直肠和胃癌的转移强烈相关。人5T4的完整核酸序列是已知的(Myers等，1994J Biol Chem 169 =9319-24) 表 权利要求
1.一种用于在受试者中检测5T4阳性癌症的方法，其包括下列步骤(i)鉴定来自所述受试者的样品中的外来体和/或自来自所述受试者的样品纯化外来体；并(ii)检测外来体相关5T4。
2.依照权利要求1的方法，其包括检测5T4肽、多肽或编码此类肽或多肽的核酸。
3.依照前述权利要求中任一项的方法，其用于检测生殖泌尿道癌症。
4.依照权利要求3的方法，其用于检测前列腺癌。
5.依照前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品是尿液样品。
6.依照权利要求1至4中任一项的方法，其中所述样品是血液样品，或者自血液样品可衍生的。
7.依照权利要求6的方法，其中所述样品是血清样品。
8.依照前述权利要求中任一项的方法，其还牵涉检测下列一项或多项 (i)在5T4外的癌症生物标志物；( )外来体标志物；和/或(iii)特定组织或细胞类型的标志物。
9.依照权利要求8的方法，其牵涉检测一种或多种前列腺标志物。
10.依照权利要求9的方法，其牵涉检测PSA和/或PSMA。
11.一种通过使用依照前述权利要求中任一项的检测方法来测定受试者中的给定癌症是否是5T4阳性癌症的方法，其中5T4的检出确认所述癌症是5T4阳性的。
12.一种用于在受试者中治疗癌症的方法，其包括下列步骤(i)通过依照权利要求11的方法来测定所述癌症是否是5T4阳性的；并(ii)对通过步骤(i)测试呈阳性的受试者施用基于5T4的治疗剂。
13.一种用于测定给定受试者是否会适合于用基于5T4的治疗剂治疗的方法，其包括通过依照权利要求1至10中任一项的方法来检测所述受试者中的5T4阳性癌症的步骤。
14.一种使用依照权利要求1至10中任一项的检测方法来监测5T4阳性癌症进展的方法，其包括比较在多个时间点时自受试者采集的样品中的外来体相关5T4的水平的步骤， 其中升高指明所述5T4阳性癌症的恶化，而降低指明改善。
15.依照权利要求14的方法，其用于在治疗期间监测5T4阳性癌症的进展，其中在治疗期间的多个时间点时自受试者采集样品。
16.依照权利要求15的方法，其中所述治疗包括施用基于5T4的治疗剂。
17.一种用于在受试者中检测5T4阳性癌症的试剂盒，其包括 ⑴外来体检测、收集和/或纯化系统；和(ii)针对5T4的检测系统。
18.依照权利要求17的试剂盒，其中所述检测系统检测5T4肽、多肽或编码此类肽或多肽的核酸。
19.依照权利要求17或18的试剂盒，其中所述检测系统还量化5T4的水平。
20.依照权利要求1至16中任一项的方法，或依照权利要求17至19中任一项的试剂盒，其中使用下列一种或多种方法来检测5T4 (i)结合抗5T4抗体；( )结合对5T4肽特异性的T细胞受体；(iii)结合与编码5T4的核酸序列整个或部分的互补物显示高程度同一性的核酸序列；和(iv)使用5T4特异性引物来扩增5T4核酸。
全文摘要
本发明提供了一种用于在受试者中检测5T4阳性癌症的方法，其包括下列步骤(i)鉴定和/或分离来自所述受试者的样品中的外来体；并(ii)检测外来体相关5T4。
文档编号G01N33/574GK102301236SQ200980155784
公开日2011年12月28日 申请日期2009年12月15日 优先权日2008年12月15日
发明者克莱顿 A. 申请人:牛津生物医学(英国)有限公司