方法

专利名称：方法
技术领域：
本发明涉及对免疫系统的调节，特别是对树突细胞抗原呈递作用的调节。
免疫系统识别机制的中心，是被称为toll样受体(TLRs)的多种种系编码的受体(1)。个体的TLRs通过激活NF-κB转录因子激活特化的抗真菌或抗细菌基因(2)。因此，业已证实TLR4能赋予对细菌脂多糖的反应性(3)，而TLR2能赋予对细菌肽聚糖和脂磷壁酸质以及酵母碳水化合物的反应性(4)。目前已知有9种TLRs(8)，并且预计存在更多种TLRs。
尽管包括TLRs在内的Toll-相关受体(TRRs)的细胞外部分是相对多样性的，其细胞质部分是更保守的。它们包括一种被称为Toll结构域的确定的区域，该区域还存在于包括IL-1受体、IL-18受体和被广义地称为IL-1受体家族的其他受体的蛋白的细胞质部分中。另外，诸如MyD88、TollIP、Mal和TIRAP的可溶性细胞质蛋白可以具有Toll结构域。TLRs和IL-1受体使用类似的信号传递体系；在配体结合时，它们通过与在MyD88的C-末端所包含的Toll结构域的同型相互作用募集接头分子MyD88。接着，MyD88又募集IRAK和TRAF-6，以便激活NF-κB和促分裂原激活的蛋白激酶。还可能与TollIP相关(2，Burns等(2000)Nature cell Biol.2，346-351)。
MyD88(骨髓分化蛋白)被认为具有一种模块组织，该模块组织包括N-末端死亡结构域(DD)，该结构域通过一个短的接头与C-末端Toll结构域隔离(综述于(5))。N-末端DD与大约90个氨基酸的基序相关，它被认为能介导与其他DD序列的蛋白-蛋白相互作用，形成同二聚体或异二聚体(Boldin等(1995)J Biol Chem 270，387-391)。
MyD88 Toll结构域具有大约130个氨基酸(Mitcham等(1996)JBiol Chem 199，144-146)。Toll结构域还被认为能介导与其他Toll结构域的蛋白-蛋白相互作用，形成同二聚体或异二聚体(参见(5))。
DD和Toll-Toll相互作用被认为与指导信号传递途径相关。MyD88被认为通过其Toll结构域结合在TLRs和IL-1受体上(在结合于配体上时)。接着，MyD88被认为通过其DD结合在其他含有DD的蛋白上；特别是认为它结合在IRAK和TRAF-6上，从而激活NF-κB和促分裂原激活的蛋白激酶(2)。
抗原呈递细胞在本领域中是众所周知的，并且包括树突细胞(参见Janeway，CA Jr & Tavers，P，Immunobiology(3rd Edition)，Editions Current Biology/Churchill Livingstone and GarlandPublishing)。它们是高度特化的细胞，能够加工抗原，并且将其肽片段展示在细胞表面上，同时展示淋巴细胞激活所需要的分子。最有效的抗原呈递细胞是树突细胞、巨噬细胞和B细胞。
树突细胞(DC)是专用抗原加工和呈递细胞，它对于初次MHC-限制的T-细胞免疫的形成来说是至关重要的。这种细胞源于骨髓中的CD34+前体，不过，也可以源于外周血液中的后集落形成单位CD14+中间体。DC能迁移到皮肤、黏膜、脾脏和胸腺的外周部位。它们参与了多种临床上重要的过程，包括同种异体移植排斥，特应性失调、自身免疫和抗肿瘤免疫性。
DC是用细胞因子，主要是GM-CSF，IL-4和TNFα由CD34+干细胞或CD14+外周血单细胞离体培养的。来自上述两种来源的DC是免疫感受态的，并且能吸收外源呈递的抗原，对所述抗原进行加工，并且将其呈递给细胞毒性T-细胞(Grabbe等(1995)ImmunologyToday 16，117-121；Girolomoni & Ricciardi-Castagnoli(1997)Immunology Today 18，102-104)。DC可以传递在体内产生的抗原-特异性肿瘤免疫性(Kwak等(1995)Lancet 345，1016-1020)，而且用来自体内的肿瘤抗原脉冲刺激的自体DC，能够诱导可检测的抗肿瘤作用(Hsu等(1996)Nature Medicine 2，52-58)。可以用粗制肿瘤膜裂解物、纯化的肽或肽片段有效刺激DC。例如，在WO/00/26249中披露了来自患者的自体树突细胞的离体扩增，给所述患者加载了肽抗原，并且作为过继免疫治疗进行再输注。
我们惊讶地发现，存在通过MyD88起作用的抑制信号，这种信号对诸如树突细胞和巨噬细胞的抗原呈递细胞(APCs)特异。所述抑制信号可能涉及一种或多种TRRs。
TRRs包括诸如TLRs的分子，包括IL-1受体和IL-18受体在内的IL-1受体家族成员，和诸如MyD88、TollIP、Mal和TIRAP的细胞质蛋白。
能调节，优选阻断诸如树突细胞的APCs中的TRR信号传递的分子，例如MyD88的无功能(抑制，例如显性失活)形式可以被用作免疫刺激剂，例如用于DNA疫苗和癌症免疫治疗。例如，将抑制性MyD88整合到DNA载体上，能比单独使用所述载体更有效地刺激T细胞和抗体反应。
本发明的第一方面提供了一种增强抗原呈递作用的方法，包括给诸如树突细胞的抗原呈递细胞(APC)，或前体细胞提供Toll-相关受体(TRR)信号传递的调节剂，优选抑制剂的步骤。所述调节剂能激活APCs，例如DCs，例如增强APCs，例如DCs的抗原呈递作用。
本发明的第二方面提供了一种抑制抗原呈递作用的方法，包括给诸如树突细胞的抗原呈递细胞(APC)，或前体细胞提供Toll-相关受体(TLR)信号传递的调节剂，优选增强剂的步骤。
Toll-相关受体(TRR)信号传递的抑制剂，优选能抑制存在于诸如树突细胞的APCs，或其前体中的TRR信号传递途径。在其他优选方面，所述抑制剂能抑制TRR信号传递途径，它的抑制作用诱导了不成熟树突细胞的激活和/或抗原呈递功能的增强，并可以诱导NF-κB核转位或激活MAP激酶。因此，TRR信号传递途径被认为能够维持诸如不成熟形式的树突细胞的不成熟APCs，并且维持NF-κB的无活性形式。TRR信号传递途径的激活能减弱诸如树突细胞的不成熟APCs对诸如GM-CSF和IL4的成熟因子的反应，即减少所形成的诸如树突细胞的成熟APCs的数量，或者可以增加形成特定数量的诸如树突细胞的成熟APCs所需要的时间或成熟因子的剂量。TRR信号传递途径的激活，可以减弱诸如树突细胞的成熟APCs诱导MLR(混合淋巴细胞反应)的能力，这是对诸如树突细胞的APC的一种试验，其作用为领域技术人员所熟知。将诸如树突细胞的APCs与同种异体T细胞一起培养，并且测定所述细胞的增殖，例如，在6天之后测定氚标记胸苷的吸收。例如，可以将105T细胞与梯度剂量(例如50-10000/孔)的树突细胞铺板在96孔圆底微量滴定板上。
通常，APC是专用的抗原呈递细胞，如黏膜细胞、巨噬细胞或B细胞。II类MHC分子存在于专用的APCs中。专用的APCs的特征是存在诸如CD80和CD86的共刺激分子，正如Mellman等所定义的((1998)Trends Cell Biol.8，231-237)。
一般，与未刺激过的细胞相比，其中的所述途径受到刺激的分离的前体或树突细胞能表达较高水平的HLA-DR、I类MHC和CD80/86。
在以下文献中提供了在增强抗原呈递功能时受到调控的DC表面标记Banchereau等(2000)Ann.Rev.Immunol.。树突细胞表面标记包括高CCR1、CCR5、CCR6，和低CCR7趋化因子受体；高CD86；低水平的I类MHC(HLA-A，B，C)和II型MHC(HLA-DR，HLA-DQ和HLA-DP)；低共刺激分子，如CD40、CD54、CD80、CD83和CD86，并且没有DC-LAMP。具有较高抗原呈递能力的活化DC具有低CCR1，CCR5，CCR6；高CCR7；低CD68；高表面I类和II类MHC；高共刺激分子，如CD40，CD54，CD58，CD80，CD83，CD86；高DC-LAMP和高p55fascin。
术语“Toll-相关受体(TRR)信号传递的抑制剂”可以包括以下APC(如DC)TRR信号传递途径中的任意一个步骤的调节剂i)刺激剂或拮抗剂结合于TRR，即，TRR结合于细胞外分子，ii)TRR结合于细胞内分子(TRR相互作用分子)，例如多肽，例如接头分子，例如含有Toll结构域的分子，例如MyD88，Mal(Fitzgerald等(2001)Nature 415，78-83)，TIRAP Horng等(2001)NatureImmunol7，835-841)或TollIP(Burns等(2000)Nature Cell Biol.2，346-351)；iii)TRR相互作用分子结合于诸如多肽的第二种细胞内分子。例如，如上文所述，MyD88可以结合于含有死亡结构域(DD)的多肽。可以结合于诸如DC的APC中的MyD88的分子可以是IRAK或TRAF-6或者可以是TollIP。IRAK披露于以下文献中Medzhitov等(1998)Mol.Cell 2，253-258；IRAK2披露于以下文献中Muzio等(1997)Science 278，1612-1615；TollIP披露于以下文献中Burns等(2000)Nature Cell Biol.2，346-351；而TRAF6披露于以下文献中Dushay & Eldon(1998)Am J Hum.Genet.62，10-14和Cao等(1996)Nature 383，443-446；iv)导致抑制不成熟DC的成熟的其他信号传递步骤(例如涉及多肽多肽结合，或改变多肽的磷酸化状态，或具体改变磷酸肌醇含量；可行性为本领域技术人员所熟知)。其他信号传递步骤可以促进维持NF-κB的无活性形式。作为其他信号传递步骤的一种例子，所述第二种细胞内分子可以与第三种或其它细胞内分子相互作用，例如与诸如IκB激酶或MAP激酶的多肽相互作用。所述相互作用可能涉及到多肽共价修饰的改变，例如通过第二种细胞内分子，或通过蛋白水解裂解或遍在化，将所述第三种细胞内多肽磷酸化或脱磷酸化。
如上文所述，诸如树突细胞的APCs被认为具有能抑制NF-κB核转运(激活)的TRR信号传递途径。因此，可以理解的是，能加强NF-κB激活/核转运的化合物不被认为是诸如DC的APC中TRR信号传递的抑制剂。
类似地，能抑制NF-κB激活/核转运的化合物不被认为是诸如DC的APC中的TRR信号传递抑制剂。
在诸如DC的APC中的TRR信号传递的抑制剂或增强剂，优选不会作用于APC抑制TRR信号传递途径，和APC中的能导致NF-κB激活的任何信号传递途径所共同拥有的信号传递途径成分或步骤。
APC中的TRR信号传递的抑制剂或增强剂优选作用于上述步骤(i)，(ii)或(iii)之一，优选作用于步骤(ii)或(iii)。因此，APC中的TRR信号传递的抑制剂或增强剂优选发挥调节细胞外分子与TRR结合的作用(即结合于TRR的细胞外部分)；或调节细胞内分子与TRR的结合(即结合于TRR的细胞内部分)；或调节所述细胞内分子与其他细胞内分子的结合。特别优选的是，TRR信号传递的抑制剂或增强剂能调节(功能性)MyD88与TRR的结合，或(功能性)MyD88与诸如含有DD的多肽的其他细胞内分子的结合。因此，诸如DC的APC中的TRR信号传递的抑制剂或增强剂优选发挥调节直接与MyD88相关的信号传递步骤的作用。
另外，诸如DC的APC中的TRR信号传递的诸如抑制剂或增强剂的调节剂，优选发挥调节直接与TRR相互作用分子或诸如Mal(Fitzgerald等(2001))或TIRAP(Horng等(2001))或TollIP(Burns等(2000))的接头相关的信号传递步骤的作用。野生型TIRAP或野生型Mal被认为在诸如DC的APC中对缺乏功能性DD的MyD88的突变体具有类似的作用，例如，对MyD881pr的类似作用。TollIP可能包括DD。缺乏功能性DD的TollIP的突变体被认为在诸如DC的APC中对缺乏功能性DD的MyD88的突变体具有类似的作用，例如对MyD881pr的类似作用。
诸如DC的APC中TRR信号传递的调节剂可以是TIRAP或Mal或其片段、融合体或变体。另外，它可以是TollIP(Burns等(2000))或其片段、融合体或变体。
所述抑制剂还可以是能选择性地破坏编码TRR的mRNA的核酶，或能抑制TRR转录的反义分子。
可以在本文所披露的病毒或病毒样颗粒的基因组中编码的核酶披露于以下文献中Cech和Herschlag“单链DNA的位点特异性裂解”US5,180,818；Altman等“RNAseP对靶RNA的裂解”US5,168,053，Cantin等“HIV-1 RNA的核酶裂解”US5,149,796；Cech等“RNA核酶限制性内切核酸酶和方法”，US5,116,742；Been等“RNA核酶聚合酶，脱磷酸化酶，限制性内切核酸酶和方法”，US5,093,246；和Been等“RNA核酶聚合酶，脱磷酸化酶，限制性内切核酸酶和方法；通过酯交换在特定位点裂解单链RNA”，US4,987,071，以上所有文献都被收作本文参考。
反义寡核苷酸是单链核酸，它能特异性结合互补的核酸序列，通过与合适的靶序列结合，形成了RNA-RNA，DNA-DNA或RNA-DNA双链体。所述核酸通常被称为“反义的”，因为它们互补于有关基因的有义或编码链。最近，业已证实了可以形成三螺旋，其中，所述寡核苷酸结合在DNA双链体上。业已发现，寡核酸能够识别DNA双螺旋大沟中的序列。由此形成了三螺旋。这表明，可以合成一种序列特异性分子，这种分子能通过识别大沟氢结合位点，特异地结合双链DNA。
通过结合靶核酸，上述寡核苷酸能够抑制所述靶核酸的功能。例如，所述功能可能是抑制转录、加工、聚(A)添加、复制、翻译，或促进细胞的抑制机制，如促进RNA降解的结果。
反义寡核苷酸是在实验室中制备的，然后将其导入细胞，例如通过显微注射或从细胞培养基中吸收进入所述细胞，或在用具有反义基因的质粒或逆转录病毒或其他载体转染之后在细胞中表达。最初发现，反义寡核苷酸能抑制Rous肉瘤病毒、水疱性口炎病毒、1型单纯疱疹病毒、猿猴病毒和流感病毒在细胞培养物中的病毒复制或表达。从那时开始，业已在包括兔网织红细胞裂解物和麦胚提取物在内的无细胞系统中，对反义寡核苷酸对mRNA翻译的抑制作用进行了深入研究。业已在体外用互补于AIDS HIV逆转录病毒RNA的寡核苷酸证实了反义寡核苷酸对病毒功能的抑制作用(Goodchild，J.1988“反义寡脱氧核苷酸对人类免疫缺陷病毒复制的抑制作用”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85(15)，5507-11)。Goodchild的研究表明，最有效的寡核苷酸是互补于聚(A)信号的；同样有效的是导向于RNA的5’末端的，特别是帽和靠近引物结合位点和位于引物结合位点上的5’非翻译区。帽、5’非翻译区、和聚(A)信号位于逆转录病毒RNA的末端的重复序列上(R区)，而与之互补的寡核苷酸可以与所述RNA结合两次。
通常，反义寡核苷酸的长度为15-35个碱基。例如，业已证实20聚体寡核苷酸能抑制表皮生长因子受体mRNA的表达(Witters等，Breast Cancer Res Treat 5341-50(1999))，并且业已证实25聚体的寡核苷酸能使促肾上腺皮质素的表达降低90％以上(Frankel等，J Neurosurg 91261-7(1999))。不过，应当理解的是，可能需要使用长度在该范围之外的寡核苷酸，例如10，11，12，13或14个碱基，或36，37，38，39或40个碱基。
反义核酸可以由合适的载体编码。
本发明的另一方面提供了一种治疗需要增强抗原呈递作用的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞或前体细胞提供Toll-相关受体(TRR)信号传递的调节剂，优选抑制剂的步骤。所述调节剂能激活诸如DCs的APCs。所述调节剂可以激活某些信号传递途径，如激酶途径，例如MAP激酶p42或p44/erk1/erk2，p54/Jnk，p38MAP激酶或NF-κB。所述调节剂或抑制剂可以是MyD88，Mal，TIRAP或TollIP或其中任意一种的片段、融合体或变体，优选保留了功能性TIR，但是不具有功能性DD的片段、融合体或变体(例如可能没有DD，或可能具有不能像DD那样起作用的突变的DD，例如，不能与其他(功能性)DD相互作用)。
因此，本发明的另一方面提供了一种治疗需要增强抗原呈递作用的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞或前体细胞提供MyID88，Mal，TIRAP或TollIP的步骤。所说的MyD88，Mal，TIRAP或TollIP包括其片段、融合体或变体，优选保留了功能性TIR，但是不具有功能性DD的片段、融合体或变体。
本发明的另一方面提供了一种治疗需要抑制抗原呈递作用的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞或前体细胞提供Toll-相关受体(TRR)信号传递的调节剂，优选增强剂的步骤。所述调节剂或增强剂可以是MyD88，Mal或TIRAP或TollIP的片段、融合体或变体(或者可以是MyD88，Mal或TIRAP或TollIP)，优选分别保留了MyD88，Mal或TIRAP或TollIP的某些，而不是全部结合或催化特性的片段、融合体或变体。所述调节剂或增强剂能抑制诸如DCs的APCs，例如抑制诸如DCs的APCs的抗原呈递。所述调节剂可以抑制某些信号传递途径，如激酶途径，例如MAP激酶p42或p44/erk1/erk2，p54/Jnk，p38MAP激酶或NF-κB。
本发明的另一方面提供了一种治疗需要抑制抗原呈递作用的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞或前体细胞提供MyD88，Mal，TIRAP或TollIP的片段、融合体或变体的步骤。所述片段、融合体或变体能抑制诸如DCs的APCs，例如抑制APCs，优选DCs的抗原呈递。所述片段、融合体或变体优选分别保留了MyD88，Mal或TIRAP或TollIP的某些，而不是全部结合或催化特性。
本发明的另一方面提供了一种治疗需要增强抗原呈递作用的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞(APC)或树突前体细胞提供直接与MyD88相关的信号传递步骤(存在于诸如DC的APC中)的抑制剂的步骤。所述抑制剂可以是MyD88的显性失活突变体。
本发明的另一方面提供了一种治疗需要增强抗原呈递作用的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞或前体细胞提供MyD88的显性失活突变体的步骤。
显性失活突变体包括MyD88的各个部分，它可以包括所述分子的片段，包括死亡结构域(DD)或Toll结构域或其部分。在参考文献(5)中披露了某些例子。所述显性失活突变体优选是这样的突变体，它能抑制IL-1或TRR信号传递，如通过激活IRAK或在成纤维细胞或在HUVECs中生产细胞因子。
本发明的另一方面提供了一种治疗需要抑制抗原呈递作用的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞(APC)或前体细胞提供直接与MyD88相关的信号传递步骤(存在于诸如DC的APC中)的增强剂。所述增强剂可以是MyD88，例如野生型MyD88。
所述信号传递抑制剂或增强剂(例如TRR传导抑制剂或增强剂或直接与MyD88相关的信号传递步骤的抑制剂或增强剂)优选是特异性导向于诸如树突细胞的APCs或前体细胞，不过这并非是必须的。
可以通过给所述患者或患者的细胞提供抑制剂或增强剂或通过在患者的细胞中表达，给所述患者或患者的细胞提供信号传递抑制剂或增强剂。因此，所述提供可以通过给所述患者(或所述患者的APC或前体细胞；例如从所述患者体内取出进行操作并随后再送回所述患者体内的细胞)施用编码(并且能够表达)一种信号传递抑制剂或增强剂的重组多核苷酸而实现的。
所述增强剂可以提高MyD88的信号传递活性。例如，所述增强剂可以是具有野生型活性的MyD88分子，或具有组成型活性的MyD88分子。例如，所述增强剂可以是缺乏功能性Toll结构域的MyD88分子(即缺少能够结合Toll结构域的结构域)；它可以是MyD88的突变体，其中，Toll结构域是缺失的和/或无功能的，例如在文献(5)中所披露的MyD88-DD多肽。另外，MyD88突变体可以是这样的，其中的死亡结构域是缺失的和/或是无功能的，例如MyD881pr。因此，作为一种例子，可以给所述患者施用能表达野生型MyD88的重组多核苷酸。
具有野生型活性的MyD88分子可以是野生型MyD88，优选小鼠或人野生型MyD88，更优选能在小鼠或人DC中表达的MyD88，或保留了野生型MyD88的活性的突变型MyD88，即具有功能性Toll结构域或功能性死亡结构域(DD；即具有能够结合死亡结构域的结构域)。MyD88Toll结构域和DD优选是非突变的，即所有突变都位于所述结构域之外。
MyD88优选具有以下文献中所披露的序列Hardiman等(1996)Oncogene 13，2467-2475；或Bonnert等(1997)FEBS Lett.402，81-84；或Hardiman等(1997)Genomics 45，332-339，所有这些序列都是人类序列。所述人类序列还以Gen Bank保藏号NM-002468中提供。
小鼠MyD88序列披露于以下文献中Harroch等(1995)Nucl.Acids Res.23，3539-3546和Hardiman等(1997)Genomics 45，332-339和Gen Bank保藏号NM-010851。
人类MyD88的氨基酸序列与小鼠MyD88的氨基酸序列具有82％的同一性。
人类和小鼠TIRAP序列分别披露于以下文献中Horng等(2001)Nature Immunol 7，835-841和Genbank保藏号AF378129和AF378130。
人类和小鼠Mal序列披露于以下文献中Fitzgerald等(2001)Nature 413，78-83。
人类、小鼠和果蝇TollIP序列披露于以下文献中Burns等(2000)Nature cell Biol 2，346-351。
正如本领域技术人员所熟知的，任何突变都优选是保守性取代。“保守性取代”表示诸如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr的组合。可以用本领域技术人员所熟知的蛋白质工程和定点诱变的方法实现。
在本文中使用IUPAC-IUB生物化学命名委员会的三字母和单字母氨基酸代码。多肽的序列是以常规形式从N-末端到C-末端提供的。所述氨基酸优选是L-氨基酸，不过它们可以是D-氨基酸残基。
MyD88信号传递的增强子可以通过结合MyD88或MyD88的结合配偶体起作用，例如通过结合能抑制MyD88的信号传递活性的结合配偶体起作用。例如，MyD881pr可以通过取代TRR信号传递的天然抑制剂起作用。所述天然抑制剂可能与能抑制TNFα信号传递的SODD多肽相关。SODD披露于以下文献中Jiang等(1999)Science 283，1852-1855。
所述抑制剂可以是MyD88信号传递活性的抑制剂。它可以结合MyD88或MyD88的结合配偶体，并且抑制MyD88与结合配偶体的结合。这样可以通过MyD88破坏信号传递。例如，所述抑制剂可以抑制MyD88与TRR的Toll结构域的结合和/或可以抑制MyD88与包括DD的多肽的结合，例如，IRAK或TRAF-6或TollIP。
所述抑制剂或增强剂可以是药物样化合物。术语“药物样化合物”为本领域技术人员所熟知，并且可以包括化合物的含义，其特征是能使它适用于药物，例如用作药物的活性成分。因此，举例来说，药物样化合物可以是通过有机化学技术合成的分子，其次是通过分子生物学或生物化学技术合成的，优选是分子量低于5000道尔顿的小分子。另外，药物样化合物可以具有选择性地与特定蛋白选择性相互作用的特征，并且可以是生物可利用的和/或能够穿透细胞膜。不过，应当理解的是，所述特征是不必须的。
所述抑制剂或增强剂可以是抗体，正如本领域技术人员所熟知的，该术语包括抗体片段或抗体样分子。所述抗体优选能结合MyD88(或其他接头分子，例如Mal、TIRAP或TollIP)或结合MyD88的结合配偶体(或其他接头分子)。例如，所述抗体可以结合MyD88的DD(和/或结合MyD88的结合配偶体的DD)，并且可以破坏MyD88与MyD88的结合配偶体的DD的结合。另外，所述抗体可以结合MyD88的Toll结构域(和/或结合MyD88的结合配偶体的Toll结构域)，并且可以破坏MyD88与MyD88的结合配偶体的Toll结构域的结合。所述抗体可优选结合于MyD88的包括相当于野生型小鼠MyD88的Phe56的残基的表位。
正如下面将要进一步讨论的，所谓的抗体包括抗体或其他免疫球蛋白，或其片段或衍生物。
抗体的可变重(VH)链区和可变轻(VL)链区与抗原识别相关，这是一种通过早期蛋白酶消化实验所认识到的一种事实。通过啮齿类抗体“人源化”发现了进一步的证实。来源于啮齿类动物的可变区可以融合在来源于人的恒定区上，以便所得到的抗体保留了啮齿类亲代抗体的抗原特异性(Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，6851-6855)。
所述抗原特异性是由可变区产生的，并且独立于所述恒定区，这一点是通过涉及到抗体片段的细菌表达的实验了解到的，所述抗体片段都包括一个或多个可变区。所述分子包括Fab-样分子(Better等(1988)Science 240，1041)；Fv分子(Skerra等(1988)Science240，1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中的VH和VL配偶体结构域是通过柔性寡肽连接的(Bird等(1988)Science 242，423；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879)，和包括分离的V区的单结构域抗体(dAbs)(Ward等(1989)Nature 341，544)。可以从以下文献中找到有关合成保留了其特异性结合位点的抗体片段合成的技术的概括综述Winter & Milstein(1991)Nature 349，293-299。
我们所说的“BScFv”分子表示这样的分子，其中的VH和VL配偶体结构域是通过柔性寡肽连接的。
使用抗体片段，而不是完整的抗体的优点是多方面的。抗体片段较小的体积会导致改善了的药理学特性。消除了完整抗体的效应子功能，如补体结合。Fab，Fv，ScFv和dAb抗体片段都可以在大肠杆菌中表达并且分泌，因此可以方便地大量生产所述片段。抗体片段还可以在患者细胞内表达。
完整抗体和F(ab′)2片段是“二价的”，我们所说的“二价的”表示所述抗体和F(ab′)2片段具有两个抗原结合位点。相反，Fab，Fv，ScFv和dAb片段是一价的，仅具有一个抗原结合位点。
所述抗体对表位的亲和力为大约105.M-1大约1012.M-1，更优选至少108.M1。
对选定多肽有反应性的抗体可以通过本领域众所周知的方法产生。具体地讲，所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
针对选定抗原的合适的单克隆抗体可以通过已知技术制备，例如披露于以下文献中的技术“Monoclornal AntibodiesA manual oftechniques”，H Zola(CRC Press，1988)和“Monoclonal HybridomaAntibodiesTechniques and Applications”，JGR Hurrell(CRCPress，1982)。Neuberger等披露了嵌合抗体(1988，8thInternational Biotechnology Symposium Part2，792-799)。适当制备的非人抗体可以是用已知方法“人源化”的，例如，通过将小鼠抗体的CDR区插入人类抗体的构架中。
制备抗体的技术为本领域技术人员所熟知，例如，披露于以下文献中Harlow，ED & Lane，D“Antibodiesa laboratory manual”(1988)New York Cold Spring Harbor Laboratory。合适的抗体以及制备合适抗体的技术可能披露于(5)中。
所述抗体(特别是抗体片段)可以与能促进诸如DC的细胞摄取所述抗体的成分结合。例如，正如本领域技术人员所公知的，所述抗体可以与亲脂性分子或能够促进所述分子或相互作用的多肽的细胞摄取的多肽结构域连接。因此，所述成分可源于触足螺旋3(Derossi等(1998)Trends Cell Biol 8，84-87)，或源于HIV的序列，通常为tat，它可以进入细胞。另外，诸如cDNA的编码所述抗体的多核苷酸，可以通过载体递送，以便在所述细胞内表达所述抗体，正如上文所述的。
所述抑制剂可以是抑制性MyD88分子，优选显性抑制性MyD88(即能够通过野生型MyD88抑制信号传递，例如在其中存在野生型和抑制性MyD88分子的细胞中)。所述抑制作用可能是由于阻断内源野生型MyD88与诸如TRR的内源MyD88的结合配偶体的相互作用导致的。
抑制性MyD88可以是MyD88分子，该分子的能力不如MyD88，优选基本上不能结合DD，例如MyD88或IRAK或TRAF-6的DD。例如，抑制性MyD88的能力可能不如MyD88，优选基本上不能通过DD二聚体化。抑制性MyD88分子可以是突变的MyD88分子，例如在DD上发生突变的MyD88，例如具有非保守性突变。例如，它可以在相当于全长小鼠MyD88的Phe56的位点上发生突变，例如突变成Asn。它可以是被称为MyD881pr的突变的MyD88分子(5)，其中，同样缺乏MyD88的N-末端53个氨基酸。与野生型MyD88，例如小鼠野生型MyD88相比，MyD881pr具有一个点突变(F56N；小鼠序列编号)。该点突变存在于DD中，并且能抑制DD的二聚体化(5)。已知相当于1prcp突变的突变能够消除Fas的细胞毒性信号传递，可能是通过破坏DD结构域的构像而实现的(Nagata(1994)Semin Immunol 6，3-8；Huang等(1996)Nature 384， 638-641)。
野生型MyD88和显性失活MyD88(MyD88-1pr)的构建体业已公开(Burns K.等.J Biol Chem 1998)，不过，MyD88-1pr被错误地披露为在其死亡结构域具有单一的氨基酸突变，其中，Phe56突变成Asn。该突变相当于存在于Fas配体的死亡结构域中的1prcp突变，它通过破坏所述死亡结构域的构像消除了其下游信号传递。实际上，除了所述点突变之外，在其N-末端53个氨基酸的结构域中存在一个缺失(缺少了genebank序列的1-159个碱基对)。这种缺失导致了部分死亡结构域的缺失。
所述抑制性MyD88可以是MyD88的截短形式，例如，其中被称为死亡结构域的结构域的全部或部分缺失了的MyD88分子。与野生型MyD88分子相比，抑制性MyD88分子可能不能或较少能够结合死亡结构域。
抑制性MyD8 8优选包括一个功能性Toll结构域，即能够与Toll结构域相互作用的Toll结构域，例如野生型MyD88的Toll结构域，例如野生型人类或小鼠MyD88或TRR。抑制性MyD88优选包括全长的MyD88Toll结构域。全长的Toll结构域可能是Toll-Toll结构域相互作用所必须的。尽管不希望受理论的约束，抑制性MyD88随后可能结合Toll受体的Toll结构域，并因此抑制野生型MyD88与Toll受体的结合，从而抑制来自所述受体分子的信号传递。
测定蛋白-蛋白相互作用(及其增强或破坏)的方法为本领域技术人员所熟知。测定DD和Toll-Toll相互作用的合适方法同样披露于文献(5)中。例如，合适的方法可以包括酵母双杂交相互作用，共纯化，ELISA，共免疫沉淀，荧光共振能量转移(FRET)技术和表面等离子共振方法。因此，如果可以通过ELISA、共免疫沉淀或表面等离子共振方法或通过酵母双杂交相互作用或共纯化方法检测到所述MyD88多肽和含有DD或Toll结构域的多肽之间的相互作用的话，可以认为MyD88分子能够结合DD或Toll结构域或者与DD或Toll结构域相互作用。优选方法是表面等离子共振。
所述抑制剂或增强剂可以是肽模拟化合物，例如相当于上文所述多肽抑制剂或增强剂的肽模拟化合物。
术语“肽模拟物”表示能模拟作为治疗剂的特定肽的构像和理想特征的化合物，不过它缺乏潜在的不希望的特征。例如，吗啡是一种可以口服的化合物，并且它是内啡肽的肽模拟物。
与肽相关的治疗用途可能是有限的，因为缺乏口服生物可利用性和存在蛋白水解降解作用。举例来说，肽通常是在体内由外肽酶和内肽酶迅速降解的，一般会产生非常短的生物半衰期。肽作为潜在治疗剂的另一个缺陷是，它们缺乏通过口服的生物可利用性。通过蛋白水解酶在胃肠道降解所述肽可能是一个重要的作用因素。不过，这一问题是更复杂的，因为业已认识到，即使是不会受到快速代谢物失活的小的环状肽也表现出差的生物可利用性。这有可能是因为通过肠膜的转运能力较差，以及通过肝脏萃取从血液中快速清除，并且随后外泌到肠道内。以上发现表明，有多个酰胺键可能影响口服生物可利用性。人们认为，在口服使用所述肽药物时，肽链上连接氨基酸残基的肽键可能会断开。
有多种不同的方法可以设计并合成肽模拟物。在一种方法中，如由Sherman和Spatola，J. Am.Chem.Soc.，112433(1990)所披露的，可以用化学官能团以基本等质的形式取代一个或多个酰胺键。这种逐步方法业已取得了某些成功，即业已获得了活性类似物。在某些场合下，业已证实所述类似物与其天然存在的对应物相比具有更长的生物学半衰期。不过，该方法具有局限性。成功地取代一个以上的酰胺键是罕见的。因此，所得到的类似物仍然容易在该分子的其他地方发生酶促失活。在取代所述肽键时，新的接头部分优选具有与肽键基本相同的电荷分布，和基本相同的极性。
可以通过本领域已知的方法，例如披露于Meziere等(1997)J.Immunol.159 3230-3237中的方法合成逆反肽模拟物，其中的肽键是反向的。该方法涉及制备包括主链改变，而不是侧链取向改变的假肽。包括NH-CO键而不是CO-NH肽键的逆反肽更能抗蛋白水解作用。
在另一种方法中，业已用多种非编码的或修饰过的氨基酸，如D-氨基酸和N-甲基氨基酸用于修饰哺乳动物肽。另外，通过诸如环化作用的共价修饰或通过掺入γ-内酰胺或其他类型的键，业已对推测的生物活性构像进行了稳定。例如，参见Veber等，P roc.Natl.Acad.Sci.USA，752636(1978)和Thursell等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，111166(1983)。
很多合成方法的共同主题是将某些环部分导入基于肽的构架。所述环部分限制了肽结构的构像空间，并且这通常会导致所述肽对特定生物学受体亲和力的提高。该方法的额外优点是，将环部分导入肽，还有可能使得所述肽具有减弱了的对细胞肽酶的敏感性。
合成环稳定化的肽模拟物的一种方法是闭环置换作用(RCM)。该方法包括以下步骤合成肽前体，并且让它与RCM催化剂接触，以便产生构像限制性肽。合适的肽前体可能包括两个或两个以上不饱和C-C键。该方法可以用固相肽合成技术完成。在本实施方案中，让固定在固体支持物上的前体与RCM催化剂接触，然后将产物从所述固体支持物上裂解下来，以便得到构像限制性肽。
本发明的方法可用于治疗任何哺乳动物，如人、犬、猫、马和牛等。优选将所述方法用于治疗人类患者。
本发明的另一方面提供了一种鉴定作为抗原呈递抑制剂的化合物的方法，包括鉴定能在诸如树突细胞的抗原呈递细胞或APC的前体细胞中调节，优选激活TRR信号传递，例如MyD88信号传递的化合物的步骤。TRR信号传递的调节，例如激活，优选可以通过观察MyD88与一种相互作用分子，例如多肽的相互作用的改变检测，例如，通过MyD88结合TRR能力的提高检测。
本发明的另一方面提供了一种鉴定作为抗原呈递增强剂的化合物的方法，包括鉴定能在诸如树突细胞的抗原呈递细胞或APC的前体中调节，优选抑制TRR信号传递，例如MyD88信号传递(或增强Mal、TIRAP或TollIP信号传递)的化合物的步骤。要抑制的TRR信号传递是能抑制DC成熟或功能的信号传递，如上文所述。TRR信号传递的抑制作用优选可以观察MyD88与一种相互作用分子，例如多肽的相互作用的改变检测，例如通过MyD88结合TLR能力的减弱检测。
可以观察IRAK或MAP激酶活性的改变。MyID881pr能提高IRAK活性。
本发明的另一方面提供了一种鉴定作为诸如DC的APC的抗原呈递作用的抑制剂或增强剂的化合物的方法，包括以下步骤让一种测试化合物暴露于MyD88或MyD88的APC结合配偶体(即存在于诸如DC的APC或其前体中的MyD88的结合配偶体)，并且确定该化合物是否能够结合MyD88或MyD88的APC结合配偶体。选择能够进行这种结合的化合物。所述方法优选还包括以下步骤确定所述化合物是否能抑制或促进MyD88与MyD88的APC结合配偶体的结合，并且选择能够抑制或促进所述结合的化合物。可以进一步测试所述化合物，例如通过观察其对DC成熟或抗原呈递的作用。该方法还可以包括确定所述化合物是否能结合MyD88的突变体，例如缺乏功能性Toll结构域或缺乏功能性DD的MyD88的步骤。
如上文所述，所述结合配偶体可以是含有DD的TRR或多肽。在诸如DC的APC中鉴定MyD88结合配偶体的方法为本领域技术人员所熟知，并且包括共沉淀和酵母双杂交方法和表面等离子共振和FRET。
本发明的另一方面提供了一种鉴定作为抗原呈递，例如诸如DC的APC的抗原呈递的抑制剂或增强剂的化合物的方法，包括以下步骤让一种测试化合物暴露于TRR相互作用分子(接头分子)，例如Mal或TIRAP或TollIP，或暴露于所述接头分子的APC结合配偶体(即存在于诸如DC的APC或其前体中的接头分子的结合配偶体)，并且确定所述化合物是否能结合所述接头分子(例如Mal或TIRAP或TOllIP)或所述接头分子的APC结合配偶体。选择能够进行这种结合的化合物。所述方法优选还包括以下步骤确定所述化合物是否能抑制或促进所述接头分子与所述接头分子的APC结合配偶体的结合，并且选择能抑制或促进所述结合的化合物。可以进一步测试所述化合物，例如通过观察其对DC成熟或抗原呈递的作用。该方法还包括确定所述化合物是否能结合所述接头分子的突变体，例如TIRAP或Mal或TollIP的缺乏功能性Toll结构域或缺乏功能性DD的突变体的步骤。
本发明的另一方面提供了将MyD88(或其他接头分子，例如TIRAP或Mal或TollIP)或MyD88的结合配偶体或其他接头分子用于鉴定诸如DC的抗原呈递作用的抑制剂或增强剂的方法中的用途。
对于上述每一种鉴定化合物的方法来说，所述化合物可以是药物样化合物或开发药物样化合物的前导化合物。正如本领域技术人员所熟知的，可以将所述方法可以用作开发药用化合物或药物的筛选测定方法。
术语“前导化合物”同样是本领域技术人员所熟知的，并且可以包括以下含义，即所述化合物本身尽管不合适用作药物(例如，因为它只能低效率地作用于其预期的目标，其作用方面的非选择性，不稳定性，难于合成或具有较差的生物利用度)，但是它可以提供计设可能具有更理想的特征的其他当合物的起点。
本发明的另一方面提供了一种通过本发明的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物，即通过本发明的以上三个方面提供的方法。本发明的另一方面提供了一种通过本发明的筛选方法鉴定的或可以鉴定的用于医学目的的化合物。本发明的另一方面提供了用于医学目的的MyD88的APC结合配偶体(或Mal或TIRAP或TollIP)或其突变体。本发明的另一方面提供了将通过本发明的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物或MyD88的APC结合配偶体(或Mal或TIRAP或TollIP)或其突变体用于治疗需要抑制或增强抗原呈递作用的患者或用于生产用来治疗需要抑制或增强抗原呈递作用的患者的药物的用途。
MyD88的APC结合配偶体(或Mal或TIRAP或TollIP)优选是MyD88的DC-结合配偶体。
本发明的另一方面提供了用于医学目的的Toll-相关受体(TRR)信号传递的抑制剂。本发明的另一方面提供了用于医学目的的Toll-相关受体(TRR)信号传递的增强剂，例如，用于治疗需要抑制或增强抗原呈递作用的患者。
本发明的另一方面提供了用于医学目的的直接与MyD88相关的信号传递步骤(出现在诸如DC的APC中)的增强剂或抑制剂，例如，用于治疗需要抑制或增强抗原呈递作用的患者。
优选的所述信号传递抑制剂和增强剂如上文所述。信号传递抑制剂优选是MyD88的显性失活突变体，例如MyD881pr或缺乏死亡结构域的MyD88，或能结合MyD88的化合物，优选如上文所述的小分子或药物样分子。如上文所述，所述信号传递抑制剂或增强剂还可以是TIRAP或Mal或TollIP或其片段、融合体或其变体。
如上文所述，可以理解的是，可以通过在细胞中表达(即合成)信号传递抑制剂或增强剂(或化合物)的方式，例如由存在于所述细胞中的重组多核苷酸(即能够表达TRR信号传递抑制剂或增强剂的重组多核苷酸)表达TRR信号传递抑制剂或增强剂，将信号传递(例如TRR或MyD88信号传递)抑制剂或增强剂(或通过本发明的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物)提供给所述细胞。可以理解的是，所述通过表达的方式在靶细胞中提供信号传递抑制剂或增强剂或化合物的方法可能是有利的；例如，所述提供方法可能促进将所述信号传递抑制剂或增强剂导向所需的细胞。它还可以促进从时间上延长所述信号传递抑制剂或增强剂的存在或向所述细胞提供信号传递抑制剂或增强剂的能力。
可以理解的是，可能需要给所需细胞同时提供两种调节剂，例如上文所定义的信号传递抑制剂(或通过本发明的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物，它是抗原呈递的增强剂)和抗原。优选通过在所需细胞中表达的方式，给所需细胞提供信号传递抑制剂/化合物或抗原，优选提供这两者。
类似地，可能需要给所需细胞同时提供信号传递增强剂(或通过本发明的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物，它是抗原呈递的抑制剂)和抗原。优选通过在所需细胞中表达的方式给所需细胞提供信号传递增强剂/化合物或抗原，优选提供这两者。
本发明的另一方面提供了一种编码信号传递抑制剂或增强剂(或通过本发明的方法鉴定的或可以鉴定的MyD88的APC结合配偶体或化合物)的重组多核苷酸，例如用于医学目的的MyD88多肽(例如组成型活性MyD88多肽或显性失活突变型MyD88多肽)或Mal或TIRAP或TollIP多肽。所述传导抑制剂或增强剂优选是上文所定义的显性失活MyD88多肽。所述重组多核苷酸优选能够在诸如树突细胞的APC或APC前体中表达信号传递抑制剂或增强剂。
所述重组多核苷酸优选编码信号传递途径的调节剂，如抑制剂和希望由APC呈递的抗原。因此，所述重组多核苷酸可能包括一个编码诸如抑制剂的信号传递调节剂的部分，和一个编码抗原性分子的部分。另外，所述抗原性分子可以由一个独立的多核苷酸分子编码；这种情况是不太理想的。所述信号传递分子和抗原可以由单一的启动子转录，它具有第二个编码序列的内部核糖体进入位点(IRES)。另外，所述信号传递分子和抗原能够由独立的启动子转录。
所述抗原性分子可以包括一个以上拷贝的一个或多个表位，例如，它可以包括单一拷贝的单一表位形成氨基酸序列，例如长度为大约8-30个氨基酸的序列，优选大约10-18个氨基酸，更优选大约15个氨基酸。它可以包括多个拷贝的所述表位形成序列，或单一或多个拷贝的至少两种不同的表位形成序列。所述抗原性序列可以串联在一起，形成结构域样结构，或者可以分散于载体多肽的不同位点上。所述多核苷酸可以编码一种或若干种不同的抗原性分子或其中的多种，其中每一种具有一个或多个抗原性部分或表位。
将重组多表位疫苗用于递送多个CD8 CTL表位的用途披露于以下文献中Thomson等(1996)J.Immunol.157，822-826和WO96/03144，这两份文献都被收作本文参考。就本发明而言，可能需要将一种肽(或编码肽的核酸)包括单一的疫苗，其中，所述肽按任何顺序包括一种或多种抗原性氨基酸序列(例如各自的长度为大约8-18个氨基酸)，例如源于肿瘤相关抗原，和CD4T细胞-刺激表位(如源于破伤风类毒素)。所述“串珠”疫苗一般是DNA疫苗。
例如，所述抗原性分子可以包括存在于转化过的细胞或癌细胞上的表位(即肿瘤相关的抗原或表位，例如由高比例的人黑素瘤产生的MAGE-1抗原(van der Bruggen等(1991)Science 254，1643))。另外，它可以包括存在于诸如病毒的致病性生物的表位，或存在于由致病性生物感染过的细胞(特别是人类细胞)，例如病毒感染的细胞。
正如本领域技术人员所熟知的，所述表位可以是T-细胞表位，即能够诱导T-细胞反应(TH-1反应)的表位，例如，T-辅助细胞反应，优选CD8+细胞毒性T-细胞反应，不过，还可以是CD4+辅助T-细胞反应(TH-2反应)。在某些场合下，细胞毒性T-细胞反应可能是不希望的，例如，当所述抗原是分支杆菌抗原(例如，结核分支杆菌或麻风分支杆菌)抗原时就是如此。
本文所披露的信号传递增强剂可能能够调节针对一种抗原的免疫反应，以便改变免疫反应的TH1/TH2平衡，优选变得有更多的TH1和更少的TH2反应。TH2反应可能与过敏相关。
如果癌抗原是或者具有至少一种存在于下列任意一种蛋白的表位，则是优选的i)在肿瘤中以异常高的水平表达的正常细胞蛋白；例如，多种肿瘤中的细胞周期蛋白D1；乳腺癌中的细胞周期蛋白E；多种肿瘤中的mdm 2；EGF-R，erb-B2，erb-B3，FGF-R，胰岛素样生长因子受体，Met，myc，p53和BCL-2都是在各种肿瘤中表达的。
ii)在肿瘤中突变的正常细胞蛋白；例如各种肿瘤中的Ras突变；各种肿瘤中的p53突变；CML和ALL中的BCR/ABL易位；AML和MDS中的CSF-1受体突变；结肠癌中的APC突变；MEN2A，2B和FMTC中的RET突变；神经胶质瘤中的EGFR突变；PML中的PML/RARA易位；前B白血病和幼儿急性白血病中的E2A-PBX1易位。
iii)在与病毒感染相关的肿瘤中病毒编码的蛋白；例如，宫颈癌中的人类乳头瘤病毒蛋白；B细胞淋巴瘤和何杰金氏人淋巴瘤中的EB病毒蛋白；成年人T细胞白血病中的HTLV-1蛋白；肝细胞癌中的乙型和丙型肝炎蛋白病毒；卡波西肉瘤中的疱疹样病毒蛋白。
iv)HIV感染的患者体内HIV编码的蛋白。
因此，上述癌相关抗原可以划分成三种主要类型(i)在肿瘤细胞中高水平表达的正常的自身抗原；(ii)在肿瘤细胞中表达的突变的自身抗原；(iii)在与病毒感染相关的肿瘤中表达的病毒抗原。优选类型(i)。
在类型(i)中包括三种亚型
a)超量表达的正常细胞蛋白；b)在正常细胞中以组织特异形式表达的蛋白，不过，也可以在肿瘤中表达；c)作为胚胎抗原的蛋白，它在大多数成人组织中是沉默的，但是，在肿瘤中异常表达。
b)和c)的例子有b)作为肿瘤反应性CTL的靶的组织特异性分化抗原，如GATA-1，IKAROS，SCL(在造血系和白血病中表达)；和免疫球蛋白恒定区(用于治疗多发性骨髓瘤)；和c)用于治疗白血病和Wilms肿瘤的Wilms-肿瘤抗原1(WT1)和用于肝脏和肠道肿瘤的癌胚抗原(CEA，胎蛋白)。
在一种实施方案中，癌相关抗原可以由肿瘤样品的粗制提取物提供。
在以下文献中披露了癌基因编码的蛋白在人类肿瘤中的超量表达和突变的癌基因在人类肿瘤中的表达Stauss & Dahl(1995)TumourImmunology，Dalgleish/Browning，第7章，该文献被收作本文参考。
因此，如果要治疗的患者患有癌症的话是优选的；更优选下列癌症中的任意一种乳腺癌；膀胱癌；肺癌；前列腺癌；甲状腺癌；白血病和淋巴瘤，如CML，ALL，AML，PML；结肠癌；神经胶质瘤；精原细胞瘤；肝癌；胰腺癌；膀胱癌；肾癌；宫颈癌；睾丸癌；头颈癌；卵巢癌；成神经细胞瘤和黑素瘤。
CML是慢性髓细胞白血病；ALL是急性淋巴细胞白血病；AML是急性髓细胞白血病；而PML是前髓细胞白血病。
另外，所述患者可能患有由病原体，特别是细菌、酵母、病毒和锥虫等导致的疾病或具有患这些疾病的危险。优选的是由一种病原体的慢性感染导致的疾病。同样优选的是，所述病原体是不容易被宿主免疫系统清除的病原体。
优选的是所述疾病是病毒感染；更优选的疾病是由下面任意一种病毒导致的疾病HIV，乳头瘤病毒，EB病毒，HTLV-1，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，疱疹病毒或任何能导致慢性感染的病毒。如果所述病毒是HIV的话是特别优选的。
在诸如某些类型的甲状腺疾病的某些疾病的细胞中产生了异常高含量的激素。因此，本发明的方法可用于促进产生较高含量激素的细胞的剥离。所述抗原可以是所述激素，与所述激素合成相关的生物合成酶，它是由所述细胞超量产生的。
患有细菌感染，特别是能导致慢性感染的感染的患者也可进行有效治疗。所述细菌感染可以是细胞内感染。因此，所述方法可用于治疗结核病。
所述方法还可用于治疗疟疾。
可以从增强或刺激抗原呈递作用中受益的其他患者包括患有朊病毒相关疾病的患者，如海绵状脑病患者。所述增强或刺激抗原呈递作用的方法可用于治疗(包括预防性治疗)以异常类型和/或异常高含量的(有害的)分子为特征的疾病或状况，例如身体中的多肽，例如，与慢性炎症相关的炎性介质(例如细胞因子)；细胞或结缔组织基质的降解产物，例如纤连蛋白片段；β-淀粉样多肽(与阿尔茨海默病相关)的含量。刺激针对所述分子的免疫反应，可能有助于从体内清除所述分子，因此有助于治疗或预防所述症状。
需要抑制抗原呈递作用的患者，可能是患有或者是有可能患自身免疫病或过敏的患者，或者是接受或将要接受移植组织的患者，即需要抑制对移植组织的排斥作用的患者。合适的抗原为本领域技术人员所熟知。
可以用本发明方法治疗的自身免疫病包括类风湿关节炎，I型糖尿病，多发性硬化，克隆氏病，桥本氏甲状腺炎，腹腔疾病，重症肌无力，寻常天疱疮，系统性红斑狼疮，和格雷夫斯病。
可以用本文所披露的方法治疗的过敏反应包括对以下过敏原的过敏Fel d1(家猫的猫皮肤和唾液腺过敏原——其氨基酸序列披露于WO 91/06571中)，DerpI，Der p II，Der FI或Der fII(来自家庭尘螨嗜皮螨属的主要蛋白过敏原——氨基酸序列披露于WO94/24281中)。
本发明基本上可应用于任何过敏，包括由存在下列任意一种物体上的过敏原引起的过敏牧草、树木和杂草(包括豚草)花粉；真菌和霉菌；食品，例如鱼，贝类，龙虾，花生，坚果，麦谷蛋白，蛋和乳；叮咬类昆虫，例如蜂，黄蜂和大黄蜂；以及摇蚊科(非叮咬摇蚊)；蜘蛛和螨虫，包括家庭尘螨；存在于头皮屑、尿液、唾液中的或诸如猫、狗、牛、猪、绵羊、马、兔、大鼠、豚鼠、小鼠和沙土鼠的哺乳动物的血液或其他体液中的过敏原；一般为空气传播的颗粒；乳胶；和蛋白型添加剂。
还可以治疗对来自以下昆虫的蛋白的过敏家蝇、果蝇、绵羊丽蝇、螺旋蝇、谷类象甲、蚕、蜜蜂、非叮咬摇蚊幼虫、蜡螟幼虫、粉虱、蟑螂和Tenibrio molitor甲虫的幼虫。
本发明的另一方面包括由各部分组成的试剂盒，组合物或诸如嵌合多肽的嵌合分子，所述嵌合分子包括上文所述的信号传递抑制或增强部分(它可以是编码抗原性分子的多核苷酸)和抗原性部分(它可以是编码抗原性分子的多核苷酸)。所述任意部分或两部分还可以包括转运部分和/或细胞结合部分。所述细胞结合部分优选能够结合树突细胞或其前体。所述转运部分可能有助于所述分子或所述分子的至少抗原性部分，优选信号传递抑制或增强部分的内化。因此，外源添加肽的可以连接在HIV tat肽上。这样可以引导它进入由CTL呈递的I型MHC途径(例如，参见Kim等(1997)J.Immunol.159，1666-1668)。可以在本发明中采用的嵌合分子披露于WO95/31483中。
树突细胞的特征可以是能表达CD80，CD86，CD40，CD1a，HLA-DR和/或CD83细胞表面分子。不成熟的树突细胞可以是CD34+或CD14+。因此，所述细胞结合部分可以能够结合于一种或多种所述细胞表面分子上(例如，能够结合所述分子的抗体)。对于DCs的定向来说，CD1a和CD83是优选的。
在多肽合成之前或之后对其中的一个或多个氨基酸残基进行过化学修饰的多肽可以用作抗原，只要所述多肽的功能，即在体内特异性免疫反应的产生基本上保持不变就行。所述修饰包括与酸或碱，特别是生理学上可以接受的有机或无机酸和碱形成盐，形成末端羧基的酯或酰胺，以及连接诸如N-叔丁氧基羰基的氨基酸保护基团。所述修饰可以抑制所述多肽的体内代谢。
所述表位(例如表位形成氨基酸序列)能够以单一拷贝或多拷贝形式存在，例如串联重复。所述串联的或多拷贝重复本身可能具有足够的抗原性，避免了载体的使用。对于要以环状形式形成的多肽来说，将N-末端和C-末端连接在一起，或在一个末端添加一个或多个Cys残基，以便增强抗原性和/或形成二硫键可能是有利的。如果所述表位，例如表位形成氨基酸序列，共价连接在一种载体，优选多肽上的话，所述结构是优选的，以便由表位形成氨基酸序列形成一个环。
根据现有的免疫学理论，为了刺激或增强刺激免疫系统，在任何免疫原性制剂中都应当存在载体功能。本发明的前述部分所述的表位，可以与诸如血清白蛋白、肌红蛋白、细菌类毒素和匙孔戚血蓝蛋白的独立的载体结合，例如通过交联结合。最新开发的能在免疫反应中诱导T-细胞辅助的载体，包括乙型肝炎核心抗原(又被称为核壳蛋白)，推测的T-细胞表位，如Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys，β-半乳糖苷酶和白介素-1的163-171肽。可以将后一种化合物视为载体或佐剂或这两者。
另外，可以将相同或不同表位的若干个拷贝彼此交联；在这种情况下，不存在独立的载体，但是可以通过这种交联提供载体功能。合适的交联剂包括在Sigma和Pierce产品目录中所列举的交联剂，例如戊二醛、碳二亚胺和琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，后一种交联剂利用了C-末端半胱氨酸残基(如果存在的话)上的-SH基团。交联多肽的任何常规形式都可以使用，如一般参见O′Sullivan等Ahal.Biochem.(1979)100，100-108。例如，其第一部分可以用巯基富集，而第二部分与能够与所述巯基起反应的双功能试剂起反应，例如，碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，即可以在缀合的化合物之间插入二硫键的异双功能交联剂。酰胺和硫醚键，例如，通过m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯获得的，在体内通常比二硫键更稳定。
其他有用的交联剂包括S-乙酰硫代乙醇酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SATA)，它是伯胺的硫醇化试剂，它能在温和条件下对巯基脱保护(Julian等(1983)Anal.Biochem.132，68)，二甲基辛二亚胺二氯化物和N，N′-o-苯基二马来酰亚胺。
如果所述多肽是通过在合适的宿主中表达合适的核苷酸序列制备的话，优选作为与能起到载体作用的肽序列的融合产物的形式表达所述多肽。Kabigen的“Ecosec”系统是所述结构的一个例子。
可以将来自不同生物学来源(例如不同的致病生物)的不同表位连接在其他抗原上，以便提供双重作用。
正如本领域技术人员所熟知的，表位包括模拟表位。
可用于制备合适的重组多肽的合适的载体或结构或多核苷酸为本领域技术人员所熟知。
能够表达需要的多肽的多核苷酸可以用本领域技术人员所熟知的技术制备。
所述多核苷酸优选能够在患者体内表达多肽。如果合适的话，所述多肽，例如TRR信号传递抑制剂或增强剂或抗原可以由下文所披露的任何合适的多核苷酸(遗传构建体)表达，并且递送到患者体内。通常，能表达所述多肽的遗传构建体包括可操作地与一种启动子连接的所述多肽的编码序列，它能在患者细胞内表达转录的多核苷酸(例如mRNA)分子，该分子能够翻译，以便合成所述多肽。合适的启动子为本领域技术人员所熟知。并且可以包括用于普遍表达的启动子，例如管家基因或组织选择性基因的启动子，这取决于表达所述多肽的需要(例如，在树突细胞或其前体细胞中)。优选使用树突细胞或树突前体细胞选择性启动子，但是，这并非是必须的，特别是如果所述多核苷酸的递送或摄取是针对特定细胞的话，例如针对树突细胞或前体。树突细胞选择性启动子可以包括CD83或CD36启动子。
能够表达所述多肽的核酸序列优选可操作地连接在表达所述序列所必须的调控元件上。
“可操作地连接”表示可以实现有关成分的正常功能的并列关系。因此，与调控因子“可操作地连接”的编码序列表示这样一种构型其中，编码NF-κ B的抑制剂(或诱导剂，正如在下文更详细的披露的，诱导剂是可以使用的)的核酸序列可以在所述调控序列的控制下表达。
“调控序列”表示在特定宿主生物中表达可操作地连接的编码序列所必须的氨基酸序列。例如，适用于真核细胞的调控序列是启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
“载体”表示包括单链、双链、环状或超螺旋DNA在内的DNA分子。合适的载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、痘病毒和细菌质粒。逆转录病毒载体是通过将其基因组随机整合到宿主的基因组上进行复制的逆转录病毒。合适的逆转录病毒载体披露于WO 92/07573中。
腺病毒是线性双链DNA病毒。合适的腺病毒载体披露于以下文献中Rosenfeld等，Science，1991，Vol.252，432页。
腺伴随病毒(AAV)属于细小病毒科，并且由大约4-6KB的单链DNA组成。
痘病毒载体是大型病毒，它具有若干个可以插入基因的位点。这种病毒是热稳定性的，并可以在室温下保存。安全性研究表明，痘病毒载体是复制缺陷型的，并且不会在宿主之间传播，或者向环境中传播。
将所述疫苗导向诸如抗原呈递细胞的特定细胞群体可以通过以下方式实现例如，通过注射部位，使用导向载体和递送系统，或从患者体内选择性地纯化所述细胞群体并且离内施用所述肽或核酸(例如，可以按照披露于以下文献中的方法保存树突细胞Zhou等(1995)Blood 86，3295-3301；Roth等(1996)Scand.J.Immunology 43，646-651)。另外，导向载体可以包括组织或肿瘤选择性启动子，该启动子能指导所述抗原在合适的部位表达。
尽管所述遗传构建体可以是DNA或RNA，但优选是DNA。
所述遗传构建体优选适用于递送到人细胞内。
将遗传构建体导入动物体内的细胞或从动物体内取出的细胞中的装置和方法为本领域技术所公知。例如，可以通过任何常规方法将本发明的构建体导入细胞，例如，涉及到逆转录病毒的方法，以便将所述构建体插入(分裂)细胞的基因组中。定向逆转录病毒可用于本发明中；例如，可以通过工程方法将能产生特异性结合亲和力的序列整合到现有病毒env基因上(有关用于基因治疗的这种载体和其他导向载体的综述可以参见Miller & Vile(1995)Faseb J.9，190-199)。
优选的逆转录病毒载体是慢病毒载体，如在以下文献中所披露的载体Verma & Somia(1997)Nature 389，239-242。
可以理解的是，逆转录病毒方法，如在下文所披露的方法可能仅适合于分裂中的细胞。例如，在Kuriyama等(1991)Cell Struc.andFunc.16，503-510中，使用了纯化逆转录病毒。可以用本领域所熟知的方法制备编码所需多肽的逆转录病毒DNA构建体。为了由所述构建体生产活性逆转录病毒，通常使用在含有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)中生长的亲嗜性psi2包装细胞系。所述细胞系的转染是通过磷酸钙共沉淀以常规方式进行的，并且通过以1毫克/毫升的最终浓度添加G418选择稳定的转化体(假设逆转录病毒构建体含有neoR基因)。分离并且扩增独立的菌落，取出培养上清液，通过0.45微米孔度的滤膜过滤，并且在-70℃下保存。为了将逆转录病毒导入靶细胞，通常直接注射业已在其中添加了10微克/毫升Polybrene的逆转录病毒上清液。所述注射可以在存在靶细胞的部位进行，例如皮下注射。
其他方法包括将所述构建体简单地递送到所述细胞中，以便进行有限时间的表达，或者在整合到基因组中之后进行较长时间表达。后一种方法的例子包括脂质体(Nǎssander等(1992)Cancer Res.52，646-653)。其他递送方法包括通过抗体-聚赖氨酸键携带外源DNA的腺病毒(参见Curiel Prog.Med.Virol.40，1-18)和作为载体的转铁蛋白-聚阳离子缀合物(Wagner等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414)。在上述第一种方法中，用本发明的DNA构建体或其他遗传构建体形成了聚阳离子-抗体复合体，其中，所述抗体对野生型腺病毒或变体腺病毒具有特异性，在变体腺病毒中业已导入了能结合所述抗体的新的表位。所述聚阳离子部分通过与磷酸主链的静电相互作用结合DNA。所述腺病毒因为包括未改变的纤维和五邻体蛋白而被内化到所述细胞中，并且将本发明的DNA构建体携带到所述细胞中。优选的聚阳离子是聚赖氨酸。
细菌递送披露于以下文献中Dietrich(2000)AntisenseNucleic Acid Drug Delivery 10，391-399。
所述DNA还可以通过腺病毒递送，其中，它存在于所述腺病毒颗粒中，例如下文所披露的。
在所述第二种方法中，采用了高效核酸递送系统，该系统使用受体介导的胞吞作用将DNA大分子运载到使用的细胞中。这一目的是通过将铁转运蛋白——转铁蛋白缀合在结合核酸的聚阳离子上而实现的。通过二硫键将人类转铁蛋白或其鸡的蛋白同源物伴白蛋白或其组合共价连接到小的DNA结合蛋白鱼精蛋白或各种大小的聚赖氨酸上。所述修饰过的转铁蛋白分子保留了它的结合其关联受体的能力，并且能将铁有效转运到所述细胞内。无论核酸大小如何，所述转铁蛋白-聚阳离子分子都能与本发明的DNA构建体或其他遗传构建体形成电泳稳定的复合体(从短的寡核苷酸到21千碱基对的DNA)。当将转铁蛋白-聚阳离子和本发明的DNA或其他遗传构建体的复合体提供给所述靶细胞时，预期会出现所述构建体在靶细胞中的高水平表达。
还可以使用高效受体介导的本发明DNA构建体或其他遗传构建体的递送，该方法使用了通过以下文献所披露的方法生产的缺陷型或化学失活的腺病毒颗粒的核内体破坏活性Cotten等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6094-6098。该方法似乎取决于以下事实腺病毒适合从核内体中释放出它的DNA，而不通过溶酶体，并且在存在诸如与本发明的DNA结构或其他遗传构建体连接的转铁蛋白的情况下，所述构建体通过与逆转录病毒颗粒相同的途径被所述细胞吸收。
该方法的优点是，没有必要使用复杂的逆转录病毒构建体；不存在与逆转录病毒感染相同的永久性基因组修饰；并且所述定向表达系统与定向递送系统偶联，因此降低了对其他细胞类型的毒性。
“裸露的”DNA和与阳离子和中性脂类复合的DNA也可用于将本发明的DNA导入要治疗的患者的细胞中。基因治疗的非病毒方法披露于以下文献中Ledley(1995)Human Gene Therapy 6，1129-1144。其他定向递送系统也是已知的，如披露于WO 94/10323中的修饰过的腺病毒系统，其中，所述DNA通常携带在腺病毒或腺病毒样颗粒中。Michael等(1995)Gene Therapy 2，660-668披露了对腺病毒的修饰，以便在纤维蛋白上添加一个细胞选择性部分。能选择性地在p53-缺陷型人类肿瘤细胞中复制的变体腺病毒，如披露于Bischoff等(1996)Science 274，373-376中的腺病毒，也可用于将本发明的遗传构建体递送到细胞中。因此，可以理解的是，本发明的另一方面提供了包括本发明的遗传构建体的病毒或病毒样颗粒。其他合适的病毒或病毒样颗粒包括HSV，AAV，痘苗病毒，慢病毒和细小病毒。
免疫脂质体(抗体定向脂质体)特别适用于导向能超量表达存在它的抗体的细胞表面蛋白的细胞类型，例如，使用树突细胞或前体是可行的，例如，使用抗CD1，CD14或CD83的抗体(或其他树突细胞或前体细胞表面分子，如上文所述)。为了制备免疫脂质体，按照Martin& Papahad jopoulos(1982)J.Biol.Chem.257，286-288的方法，合成了MPB-PE(N-[4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酰]磷脂酰乙醇胺)。将MPB-PE掺入到脂质体双层中，以便可以将抗体或其片段共价偶联到脂质体表面上。所述脂质体通常加载有用于递送给所述靶细胞的本发明的DNA或其他遗传构建体。例如，在所述DNA或其他遗传构建体的溶液中，形成所述脂质体，然后在最高达0.8MPa的氮气压力下，通过0.6-0.2微米孔度的聚碳酸酯膜过滤器连续挤压。在挤出之后，通过以80000×g的速度超速离心45分钟使捕获的DNA构建体与游离的DNA构建体分离。将新制备的MPB-PE-脂质体在脱氧缓冲液中与新制备的抗体(或其片段)混合，并且偶联反应是在4℃下在氮气中进行的，并且不间断地匀速旋转过夜。通过在80000×g的速度下超速离心45分钟，使免疫脂质体与未偶联的抗体分离。免疫脂质体可用于注射，例如腹膜内注射或直接注射到存在靶细胞的部位，例如皮下注射。
优选的载体包括慢病毒载体和腺病毒载体，例如类似于披露于以下文献中的载体Foxwell等(2000)Ann Rheum Dis 59 Suppl 1，I54-59或Bondeson等(2000)J Rheumatol 27(9)，2078-2089。
可以理解的是可能需要调控所述多肽(例如TRR信号传递抑制剂，例如MyD881pr)在细胞中的瞬时表达。因此，所述多肽的表达可能需要直接或间接(参见下文)在一种启动子的控制之下进行，所述启动子是可以调控的，例如，通过在需要激活或阻遏所述多肽的表达时，给患者施用的小分子的浓度调控(取决于所述小分子是否能影响所述启动子的激活或阻遏)。可以理解的是，如果所述表达构建体是稳定的话，将是特别有利的，即能够在所述细胞中表达所述多肽(在存在任何必需调控分子的情况下)至少1周，1、2、3、4、5、6、8个月或1年或1年以上。本发明的优选构建体可以包括一个可调控的启动子。可调控启动子的例子包括在以下文献中提到过的启动子Rivera等(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96(15)，8657-62(由一种口服生物可利用的药物纳巴霉素控制，使用两种独立的腺病毒或腺伴随病毒(AAV)载体，一种编码诱导型人类生长激素(hGH)靶基因，另一种编码二分纳巴霉素调控的转录因子)；Magari等(1997)J ClinInvest 100(11)，2865-72(由纳巴霉素控制)；Bueler(1999)BiolChem 380(6)，613-22(腺伴随病毒载体综述)；Bohl等(1998)Blood92(5)，1512-7(由腺伴随载体中的多西环素控制)；Abruzzese等(1996)J Mol Med 74(7)，379-92(参见诱导因子，例如，激素，生长因子，细胞因子，细胞静止因子，辐射，热激和相关的效应因子)。还可以使用四环素-诱导型载体。所述载体是通过相对无毒的抗生素激活的，业已证实它们可用于调控在哺乳动物细胞培养物中的表达。另外，还可以使用基于甾体的诱导剂，特别是因为所述甾体受体复合物能进入细胞核，其中，所述DNA载体在转录之前必须分离。
可以通过在两种水平上调控表达进一步改善该系统，例如，通过使用组织选择性启动子和由外源诱导剂/阻遏剂，例如上文所述的小分子诱导剂控制的启动子，这种诱导剂为本领域技术人员所熟知。因此，一种水平的调控可能涉及将合适的多肽编码基因连接在一种诱导型启动子上，而另一种水平的调控涉及到使用组织选择性启动子驱动编码必需的诱导型转录因子(它控制来自所述诱导型启动子的所述多肽(例如MyD88多肽)-编码基因的表达)。还可以通过所述遗传构建体的细胞类型特异性定向改善控制。
可以理解的是，所表达的蛋白优选以相对参与MyD88或TRR传导的其他蛋白的适当水平生产，以便获得最佳功能。
正如本领域技术人员所公知的，在用完整动物进行评估之前，可以在体外产生的诸如树突细胞的细胞中，评估本发明的方法或构建体。还可将在申请日为1999年12月24日的GB9930616.9中所披露的方法用于评估本发明的方法或构建体。
本发明的遗传构建体可以用本领域中众所周知的方法制备。
可以通过包括口服和肠胃外(例如皮下或肌内)注射在内的任何常规方法施用上述治疗分子，例如信号传递抑制剂或增强剂(例如MyD88多肽，包括显性失活MyD88变体多肽，如MyD881pr)或化合物，嵌合分子或本发明的构建体或其制剂。所述治疗可以包括在一定时间内的单一剂量或多个剂量。所述治疗分子(例如，多肽，嵌合分子，构建体或制剂)优选是通过注射施用的，优选皮下注射。可以理解的是，诸如上文所述的小分子诱导剂的诱导剂优选通过口服使用。
可能需要用包括所述遗传构建体的合适的递送载体对包括靶细胞的部位进行局部灌注一段时间。例如，需要移植的器官可以进行离体灌注。另外，或者作为一种替代方案，可以将所述递送载体或遗传构建体直接注射，例如皮下注射到包括靶细胞的可达到的部位。将诸如腺病毒载体构建体的遗传构建体注射到患者细胞中的方法为本领域技术人员所熟知。
具体地讲，可以使用过继治疗方法或使用基因枪将构建体递送到树突细胞中，例如递送到皮肤中。
过继治疗方法披露于以下文献中Nestle等(1998)Nature Med.4，328-332和De Bruijn等(1998)Cancer Res.58，724-731。
过继治疗方法可以包括以下步骤(1)从患者获得抗原呈递细胞或其前体，优选树突细胞或其前体；(2)让所述抗原呈递细胞与来自体内的信号传递抑制剂或增强剂(或通过本发明的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物)，以及需要针对它的免疫反应的任选的抗原，或上文所述的嵌合分子或多肽接触；和(3)将如此处理过的抗原呈递细胞重新导入患者体内。
合适的是，所述树突细胞是用多肽，例如信号传递抑制剂和抗原刺激过的自体树突细胞。在以下文献中披露了用由来自肿瘤相关抗原的肽刺激过的自体树突细胞进行的T-细胞治疗Murphy等(1996)The Prostate 29，371-380和Tjua等(1997)The Prostate 32，272-278。
在另一种实施方案中，所述抗原呈递细胞，如树突细胞与编码信号传递抑制剂或增强剂的多核苷酸接触。所述多核苷酸可以是任何合适的多核苷酸，并且它优选能转导所述树突细胞，因此相应导致所述抗原呈递细胞的抗原呈递作用的激活或抑制。
通常，所述多核苷酸可以包括在上文所述的病毒多核苷酸或病毒中。例如，业已证实腺病毒转导过的树突细胞能诱导与MUC1相关的抗原特异性抗肿瘤免疫性(参见Gong等(1997)Gene Ther.4，1023-1028)。类似地，可以使用基于腺病毒的系统(例如，参见Wan等(1997)Hum.Gene Ther.8，1355-1363)；可以使用逆转录病毒系统(Specht等(1997)J.Exp.Med.186，1213-1221和Szabolcs等(1997)Blood 90，2160-2167)；还可以使用颗粒介导的向树突细胞的转移(Tuting等(1997)Eur.J.Immunol.27，2702-2707)；并且还可以使用RNA(Ashley等(1997)J.Exp.Med.186，1177-1182)。
所述树突细胞可来自患者(即自体树突细胞)或来自健康个体(MHC匹配的或错配的)，按上述方法体外处理，进行过继治疗，即体内导入如此操作过的树突细胞，这种细胞随后能激活CTL反应。“健康个体”表示总体健康状况良好的个体，优选具有感受态免疫系统，更优选不患有任何可以方便地测试和检测的疾病。
因此，本发明的方法包括过继免疫治疗。
优选给患者施用大约103至1011APCs，更优选106至107APCs。APCs优选是DCs。
APCs可以通过任何常规途径施用。优选通过静脉内途径施用APCs。同样优选的是，将APCs局部施用到病变部位(如肿瘤或局部病毒或细菌感染)。通常，APCs是施用到动脉内的，该动脉供应病变或病变所在的组织。
APCs可以是皮下施用的，以便能够迁移到淋巴节。
APCs优选是DCs。
可以将所述细胞(或疫苗)提供给用某些其他方法治疗过其疾病的患者。因此，尽管可以单独使用所述治疗方法，但优选作为辅助治疗使用。
可以在其他治疗之前、期间或之后施用诸如DCs的APCs或疫苗。
当要治疗的疾病是癌症时，所述癌症优选业已、正在或将要用常规疗法或手术治疗，并且用本发明的治疗治疗。通常，根据治疗方法，通过放疗或化疗对所述癌症进行治疗。
在上面详细披露了可能需要免疫反应的癌抗原。
当要治疗的疾病是一种病原体感染时，所述感染优选业已、正在或将要用常规疗法或手术进行治疗。
如果要治疗的患者患有HIV感染的话，优选将本发明的方法用作其他治疗方法的辅助手段，所述其他治疗方法如用诸如AZT或3TC的逆转录酶抑制剂治疗或联合治疗，例如HART(高活性逆转录病毒治疗)。
当本发明的方法被用于治疗实质性肿瘤时，优选施用DCs或疫苗作为首次手术后治疗。
当本发明的方法被用于治疗白血病时，优选在放疗或化疗之后施用DCs或疫苗。如果同样用DCs同时结合骨髓移植对白血病患者进行治疗的话也是优选的。
癌症治疗，例如过继免疫治疗在控制或消除最小残余病变，而不是减少大病变方面是最有效的。可以想象的是，免疫治疗能暂时增加大病变的尺寸，这是因为细胞毒性T-淋巴细胞的流入和组织引流的结果。可以在治疗之后监测疾病的程度和体积，但是不能用作正式终点。按常规方法长期随访患者，以便确保不会表现出长期的不良影响。
还可以包括以下递送或导向方法。可以使用对培养物或体内细胞进行由冲击压缩空气驱动的DNA/蛋白包衣的纳米颗粒渗透(例如使用BioRad装置)。用于递送的结构可能优选具有细胞类型选择性启动子。
尽管可以单独施用本文所披露的治疗分子，例如信号传递增强剂或抑制剂或构建体或分子，不过优选以与一种或多种可接受的载体一起的药物制剂形式提供。所述载体必须是“可以接受的”，其含义是与治疗分子(可能是核酸或多肽)相容，并且不会损害其受体。通常，所述载体可以是无菌的，并且是无致热原的水或盐水。
鼻腔喷雾剂可能是有用的制剂。
所述制剂通常可以以单位剂量形式提供，并且可以通过制药领域所熟知的任何方法制备。所述方法包括将活性成分(例如，本发明的信号传递增强剂或抑制剂，构建体或分子)与构成一种或多种辅助成分的载体结合在一起。一般，所述制剂是通过以下方法制备的将所述活性成分与液体载体或精细分割的固体载体或这两者均匀而又紧密地结合在一起，然后，如果必要的话，使该产品成型。
适合口服的本发明的制剂可以以独立的单位形式提供，如胶囊、锭剂或片剂，每一个单位含有预定数量的活性成分；作为粉末或颗粒形式；作为存在于含水液体或无水液体中的溶液或悬浮液形式；或作为水包油液体乳液或油包水液体乳液形式。所述活性成分还可以药团、糖剂或糊剂形式提供。
片剂可以通过压缩或模塑制备，可任选与一种或多种辅助成分一起制备。压缩片剂可以通过在合适的机器中压缩诸如粉末或颗粒的自由流动形式的活性制剂成分制备，所述活性成分可任选与粘接剂(例如聚乙烯吡咯烷酮，明胶，羟丙基甲基纤维素)，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，崩解剂(例如淀粉乙醇酸钠，交联的聚乙烯吡咯烷酮，交联的羧甲基纤维素钠)，表面活性剂或分散剂混合。模塑的片剂可以通过在合适的机器中模塑用一种惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物制备。所述片剂可任选进行包衣或分级，并且配制成能缓慢释放或受控制地释放其中的活性成分的形式，例如使用各种比例的羟丙基甲基纤维素，以便提供理想的释放曲线。
适合于口腔局部施用的制剂包括喉糖锭，包括存在于香味基料，通常是蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶中的活性成分；锭剂，含有存在于诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶的惰性基料中的活性成分；和漱口水，含有存在于合适液体中的载体中的活性成分。
适合肠胃外施用的制剂包括含水和无水无菌注射液，该注射液可以包括抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，这些成分使得该制剂与预期的受体血液等渗；和含水和无水无菌悬浮液，它可以包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以用单位剂量或多剂量容器形式提供，例如密封的安瓿瓶和管瓶，并且可以在冷冻干燥条件下保存，在即将使用之前，只需要添加注射的无菌液体载体，例如水。可以用上文所述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
优选的单位剂量制剂是含有每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分的活性成分的制剂。
应当理解的是，除了上文具体提到的成分之外，所述本发明的制剂还可以包括本领域常见的其他制剂，这些制剂与相关制剂的类型相关，例如，适合口服的制剂可以包括香味剂。
可以理解的是，可以通过任何适合局部施用药物的方法将治疗分子，例如本发明的抑制剂或增强剂或分子或构建体递送到有关部位。例如，可以将所述构建体的溶液直接注射到所述部位，或者可以通过用输液泵通过输液递送。例如，所述结构还可以结合在可移植的装置中，该装置在放置到需要的部位之后，可以将所述构建体释放到其周围部位。
例如，所述构建体可以通过水凝胶材料施用。水凝胶是非炎性的和生物可降解的。有多种这样的材料是已知的，包括由天然和合成聚合物制备的水凝胶。在一种优选实施方案中，所述方法采用这样一种水凝胶，它在低于体温的温度下是液体，但是在体温或接近体温的温度下胶凝形成能保持形状的半固体水凝胶。优选的水凝胶是环氧乙烷-环氧丙烷重复单元的聚合物。所述聚合物的特性取决于所述聚合物的分子量和聚合物中聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的相对百分比。优选的水凝胶包括重量为大约10％-大约80％的环氧乙烷，和重量为大约20％-大约90％的环氧丙烷。特别优选的水凝胶包括大约70％的聚环氧乙烷和30％的聚环氧丙烷。例如，可以使用的水凝胶可以从BASF公司(Parsippany，NJ)，以Pluronic_为商标获得。
在本实施方案中，将水凝胶冷却成液体状态，并且将所述构建体混合到该液体中，使每克水凝胶中核酸的浓度为大约1毫克。然后将所得到的混合物涂敷在要治疗的表面，例如在手术期间通过喷雾或涂抹使用，或者使用导管或内窥镜方法。当所述聚合物变热时，就固化形成凝胶，并且所述构建体用一定时间从所述凝胶中弥散到周围的细胞中，所述时间是由所述凝胶的确切配方决定的。
例如，所述构建体可以通过其他植入物施用，所述植入物可以通过商业渠道获得或披露于科技文献中，包括脂质体、微胶囊和可植入的装置。例如，由生物可降解的材料，如聚酐、聚原酸酯、聚乳酸和聚乙醇酸及其共聚物，胶原和蛋白聚合物，或生物不可降解的材料，乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)，聚乙酸乙烯酯，亚乙基乙烯醇，及其衍生物制备的移植物用于递送所述构建体。可以使用熔融或溶剂蒸发技术将所述构建体以聚合化或固化形式掺入所述材料中，或者与所述材料机械结合。在一种实施方案中，将所述构建体(例如，包括反义寡核苷酸)混合到或涂敷到可植入装置的包衣上，如葡聚糖包衣的硅珠，支架或导管。
举例来说，所述构建体的剂量取决于所述构建体的大小及其预期的用途。一般，剂量范围是根据要治疗的组织的表面积计算的。所述构建体的有效剂量可能取决于该构建体的大小和所使用的递送载体/导向方法，和寡核苷酸的化学组成，不过，合适的剂量可以由熟练的技术人员决定，例如，利用来自上文所述的动物和体外测试系统的数据确定。
例如，所述构建体可以以治疗和预防目的给患者系统施用。例如，所述构建体可以通过上述任意一种有效方法施用，例如，肠胃外施用(例如静脉内、皮下、肌内)或口服，鼻腔或其他方式施用，例如，所述施用方式能够使所述结构进入患者血液，并且在患者血液中循环。全身施用的构建体优选是作为局部施用的构建体的补充提供的，不过，也可以在不进行局部施用的情况下起作用。
据信，树突细胞对所述核酸的吸收，以及所编码的多肽的表达可能是启动免疫反应的机制。不过，树突细胞可能是未经转染的，但是仍然是重要的，因为它们能够从组织中受转染的细胞中挑选表达的肽。
优选将诸如DNA疫苗的疫苗用于肌肉中。同样优选的是，将所述疫苗用在皮肤上或皮肤内。
本发明的另一方面提供了一种能有效抗癌，癌细胞或肿瘤细胞，或抗致病生物或受致病生物感染的细胞的疫苗，包括有效量的上文所述的抗原呈递作用的信号传递增强剂或激活剂，或编码所述抗原呈递作用的信号传递增强剂或激活剂的核酸。所述疫苗优选还包括具有存在于癌或肿瘤细胞，或致病生物或受致病生物感染的细胞上的表位的抗原(或编码抗原的多核苷酸)。
例如，本发明提供了能有效抗癌，或癌细胞或肿瘤细胞，或抗致病生物或受致病生物感染的细胞的疫苗，包括有效量的Mal或TIRAP或TollIP，或其片段、变体或融合体，或编码它们的多核苷酸。所述疫苗优选还包括具有存在于癌细胞或肿瘤细胞，或致病生物或受致病生物感染的细胞上的表位的抗原(或编码抗原的多核苷酸)。
如果所述疫苗是核酸疫苗的话是特别优选的。在以下文献中披露了由多核苷酸介导的对癌症的免疫治疗Conry等(1996)Seminarsin Oncology 23，135-147；Condon等(1996)Nature Medicine 2，1122-1127；Gong等(1997)Nature Medicine 3，558-561；Zhai等(1996)J.Immunol.156，700-710；Graham等(1996)Int J.Cancer65，664-670；和Burchell等(1996)pp 309-313 InBreastCancer，Advances in biology and therapeutics，Calvo等(eds)，John Libbey Eurotext，以上文献均被收作本文参考。
通常，所述核酸疫苗可以包括如上文所述的任何合适的核酸递送装置。所述核酸，优选DNA可以是裸露的(即基本上没有要施用的其他成分)，或者它可以在脂质体中递送，或作为病毒载体递送系统的一部分。
所述核酸疫苗可以在不使用佐剂的情况下施用。所述核酸疫苗还可以在使用诸如BCG或明矾的佐剂的情况下施用。其他的合适佐剂包括Aquila’s QS21刺激子(Aquila Biotech，Worcester，MA，USA)，它来自皂苷，分支杆菌提取物和合成的细菌细胞壁模拟物，以及专有佐剂，如Ribi’s Detox。还可以使用另一种皂苷衍生的佐剂QuilA(Superfos，Denmark)。诸如弗氏佐剂的其他佐剂也可以使用。如果所述核酸疫苗是在不使用佐剂的情况下施用的话将是优选的。
本发明的另一方面提供了一种药物组合物，包括信号传递抑制剂或增强剂或MyD88或MyD88多肽，或Mai，TIRAP或TollIP，或通过本发明的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物的结合配偶体，或编码所述化合物的多核苷酸，或本发明的组合物或嵌合分子，疫苗或多核苷酸，以及可以药用的载体。
本发明的另一方面提供了一种杀伤患者体内的能异常表达第一种表位的靶细胞的方法，该方法包括以下步骤(1)从所述患者获得抗原呈递细胞(APCs)；(2)离体让APCs与树突细胞内的TRR信号传递的调节剂，优选抑制剂与编码APCs的TRR信号传递的抑制剂的多核苷酸或表达载体接触；(3)任选让所述细胞与所述表位或编码所述表位的多核苷酸或表达载体接触，和(4)将如此处理过的APCs重新导入所述患者体内。
在重新导入患者体内之后，所述APCs能刺激细胞毒性T细胞对所述靶细胞的反应。
通常，APCs是树突细胞。
所述靶细胞可以是癌细胞。
本发明的另一方面提供了一种治疗患有癌症或致病生物感染的患者或具有患这种病的危险的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的抗原呈递细胞或前体细胞提供(1)如上文所述的TRR信号传递的调节剂，优选抑制剂(可以是上文所述的Mai，或TIRAP或TollIP(或其中一种的片段、变体或融合体)；并且它能激活诸如DCs的APCs，例如增强诸如DCs的APCs的抗原呈递作用)或(2)直接与MyD88相关的信号传递步骤的抑制剂，或(3)MyD88的显性失活突变体的步骤。
本发明的另一方面提供了一种治疗患有自身免疫疾病或移植排斥或具有患这种病的危险的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的抗原呈递细胞或前体细胞提供(1)如上文所述的TRR信号传递的调节剂，优选激活剂(它可以是Mal，或TIRAP或TollIP或其片段、变体或融合体；并且它能抑制诸如DCs的APCs，例如抑制诸如DCs的APCs的抗原呈递作用)或(2)直接与MyD88相关的信号传递步骤的激活剂，或(3)MyD88的步骤。
本发明的另一方面提供了将(1)将TRR信号传递的调节剂，优选抑制剂(它可以是上文所述的Mal，或TIRAP或TollIP或其片段、变体或融合体)或(2)直接与MyD88相关的信号传递步骤的抑制剂，或(3)MyD88的显性失活突变体(或编码它的多核苷酸)用于生产用来治疗需要增强抗原呈递作用和/或患有癌症或致病生物感染或有患这种病的危险的患者的药物的用途。
所述药物优选还包括一种抗原或编码抗原的多核苷酸。更优选的是，所述药物包括编码抗原的多核苷酸和本发明的抑制剂分子或嵌合分子。
另外，所述药物可以包括通过本发明的筛选方法鉴定的或可以鉴定的合适的化合物。
本发明的另一方面提供了将(1)将TRR信号传递的调节剂，优选激活剂(它可以是上文所述的Mal，或TIRAP或TollIP或其片段、融合体或变体)或(2)直接与MyD88相关的信号传递步骤的激活剂，或(3)MyD88(或编码它的多核苷酸)用于生产用来治疗患有自身免疫病或移植排斥或有患这种病的危险的患者的药物的用途。
所述药物优选还包括一种抗原或编码抗原的多核苷酸，更优选的是所述药物包括编码抗原的多核苷酸和本发明的抑制剂分子或嵌合分子。
另外，所述药物可以包括通过本发明的筛选方法鉴定的或可以鉴定的合适的化合物。
本发明的另一方面提供了各个部分的试剂盒或组合物或嵌合分子，包括(1)Mal，或TIRAP或TollIP或其片段、衍生物或融合体(其优选形式如上文所述)(或编码所述部分的多核苷酸)和(2)包括或编码抗原性分子的抗原性部分。本发明的另一方面提供了将所述各部分的试剂盒或组合物或嵌合分子用于医学目的的用途。本发明的另一方面提供了包括各部分的试剂盒或组合物或嵌合分子用于生产用来治疗需要调节抗原呈递作用的患者的药物的用途。
在本发明所述方面的任一部分或两部分还可以包括如上文所述的转运部分和/或细胞结合部分。
下面将结合以下的非限定性附图和实施例对本发明进行说明。


图1包括Toll和死亡结构域的MyD88的结构MyD88具有包括通过短的接头与C-末端toll结构域分离的N-末端死亡结构域(DD)的模块组织。N-末端DD与大约90个氨基酸的基序相关，该基序为FAS/AP01/CD95的细胞质尾和TNF受体所共同拥有，并且已知能介导与其他DD序列的蛋白相互作用，形成同或异二聚体(Boldin M.P.等.J Biol Chem 1995)。这种相互作用构成了建立信号传递复合体的基础，该复合体能激活MAP激酶和转录因子NF-κB(Nagata S.Cell 1997)。MyD88 C-末端toll结构域包括大约130个氨基酸，它存在于Toll-相关受体的逐渐增大的家族中，该家族中包括toll-样，IL-1和IL-18受体。Toll结构域还与蛋白-蛋白相互作用相关。MyD88在酵母中自我缔合。示意性地示出了全长的MyD88和MyD88突变体。黑色和灰色三角分别表示死亡结构域和Toll结构域。在死亡结构域(用白色圆圈表示)中包括一个点突变F56N的MyD88用MyD88-1pr表示(援引自Burns等1998 JBC 273 12203)。
图2toll-样受体1-5在免疫系统细胞中的表达模式最近，Muzio等.(J Immunol 2000)业已检查了TLR1-5的表达模式，并且发现TLR1是在免疫系统的细胞中普遍表达的，而TLR2，4和5的表达局限于多型核细胞，单核细胞和树突细胞。TLR3似乎局限于树突细胞。
图3显性失活(抑制性)MyD88在57A HELA细胞中阻断反应于IL-1的NF-κB报导基因的激活用NF-κB报导基因稳定转染过的57A HELA细胞不进行感染，或用编码一种不相关的蛋白(AdGFP)GFP，IκBα(Ad IκBα)，野生型MyD88的对照腺病毒感染，所述MyD88突变体仅仅已知为MyD88-1pr或MyD88-toll突变体。在一天之后，用20ng/ml TNF或IL-1刺激细胞，并且测定来自NF-κB报导基因的荧光素酶活性。显性失活(抑制性)MyD88-1pr蛋白的表达可以特异性抑制IL-1，但不能抑制TNF-诱导的NF-κB激活作用，而野生型MyD88像预期的那样没有作用。
图4显性失活(抑制剂)而不是野生型MyD88的表达能阻断中反应于IL-1的p38 MAPK，p42/44 MAPK和NF-κB激活作用，以及IκBα降解作用在无血清RPMI中用编码对照蛋白β-gal，野生型MyD88或显性失活形式的MyD88-1pr的腺病毒感染原代人皮肤成纤维细胞(HSF)。在2小时之后清除病毒，并且将所述细胞在5％FCS RPMI中培养1天，以便使表达发生。然后，用20ng/ml IL-1或TNFα刺激所述细胞30分钟，并且裂解细胞以便提取细胞质和细胞核。通过蛋白印迹分析细胞质提取物中的MyD88，磷酸化的p38和p42/44 MAPK，和IκBα。通过电泳迁移率变动分析(EMSA)分析核NF-κB-DNA结合活性。
图5显性失活(抑制剂)而不是野生型MyD88的表达能阻断IL-1诱导的IL-6在HSF中的生产在无血清RPMI中用编码对照蛋白β-gal、野生型MyD88或显性失活形式的MyD88-1pr的腺病毒感染原代人皮肤成纤维细胞(HSF)。2小时之后清除病毒，并且将所述细胞在5％FCS RPMI中培养1天，以便使表达发生。然后，用20ng/ml IL-1刺激所述细胞24小时，收集上清液，并且通过ELISA分析IL-6的生产。显性失活MyD88-1pr的表达可以抑制IL-1诱导的IL-6在人皮肤成纤维细胞中的生产。
图6显性失活(抑制剂)或野生型MyD88的表达不会阻断TNFα-诱导的IL-6在HSF中的生产在无血清RPMI中用编码对照蛋白β-gal、野生型MyD88或显性失活形式的MyD88-1pr的腺病毒感染原代人皮肤成纤维细胞(HSF)。2小时之后清除病毒，并且将所述细胞在5％FCS RPMI中培养1天，以便使表达发生。然后，用20ng/ml IL-1刺激所述细胞24小时，收集上清液，并且通过ELISA分析IL-8的生产。显性失活MyD88-1pr的表达可以抑制IL-1诱导的IL-8在人皮肤成纤维细胞中的生产。
图7显性失活(抑制剂)而不是野生型MyD88的表达能阻断IL-1的IL-8在HSF中的生产在无血清RPMI中用编码对照蛋白β-gal、野生型MyD88或显性失活形式的MyD88-1pr的腺病毒感染原代人皮肤成纤维细胞。2小时之后清除病毒，并且将所述细胞在5％FCS RPMI中培养1天，以便使表达发生。然后，用20ng/ml TNFα刺激所述细胞24小时，收集上清液，并且通过ELISA分析IL-6的生产。显性失活MyD88-1pr的表达可以抑制TNFα-诱导的IL-8在人皮肤成纤维细胞中的生产，这表明MyD88是IL-1特异性需要的，而不是TNF信号传递途径所需要的。
图8显性失活(抑制剂)或野生型MyD88的表达不会阻断TNFα-诱导的IL-8在HSF中的生产在无血清RPMI中用编码对照蛋白β-gal、野生型MyD88或显性失活形式的MyD88-1pr的腺病毒感染原代人皮肤成纤维细胞(HSF)。2小时之后清除病毒，并且将所述细胞在5％FCS RPMI中培养1天，以便使表达发生。然后，用20ng/ml TNFα刺激所述细胞24小时，收集上清液，并且通过ELISA分析IL-8的生产。显性失活MyD88-1pr的表达不会抑制TNFα诱导的IL-8在人皮肤成纤维细胞中的生产。这表明MyD88是IL-1特异性需要的，而不是TNF信号传递途径所需要的。
图9显性失活(抑制剂)而不是野生型MyD88的表达能阻断人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中反应于IL-1和LPS的p42/44 MAPK和NF-κB激活，以及IκBα的降解在无血清RPMI中用编码对照蛋白β-gal或显性失活形式的MyD88-1pr的腺病毒感染原代脐静脉内皮细胞(HUVEC)。2小时之后清除病毒，并且将所述细胞在5％FCS RPMI中培养1小时，以便使表达发生。然后，用20ng/ml IL-1或1μg/ml LPS刺激所述细胞30分钟，并且获得细胞质和细胞核提取物。通过蛋白印迹分析细胞质提取物中的MyD88表达，p42/44 MAPK的磷酸化IκBα的表达。通过电泳迁移率变动分析(EMSA)分析核NF-κB-DNA结合活性。
图10显性失活(抑制剂)而不是野生型MyD88的表达能阻断IL-1-和LPS-诱导的，而不是TNF-诱导的IL-6在HUVEC中的生产在无血清RPMI中用编码对照蛋白β-gal，野生型MyD88，显性失活形式MyD88-1pr，IκBα或显性失活形式的IKK-2的腺病毒感染原代HUVEC。2小时之后，清除病毒，并且将所述细胞在5％FCS RPMI中培养1天，以便使表达发生。然后，用20ng/ml IL-1，20ng/ml TNFα或1μg/ml LPS刺激所述细胞24小时，收集上清液，并且通过ELISA分析IL-6生产。显性失活MyD88-1pr的表达能抑制IL-1-和LPS-诱导的IL-6生产，这表明它是toll-相关受体的特异性抑制剂。IκBα和显性失活IKK-2也能抑制IL-6生产，因为它们作用于toll-相关受体信号传递途径中的MyD88的下游。TNF-诱导的IL-6生产没有受到阻断，因为没有涉及到MyD88。不过，IKK-2和IκBα也能被TNF-R信号传递途径所利用。
图11显性失活(抑制剂)而不是野生型MyD88的表达能阻断IL-1-和LPS-诱导的，而不是TNF-诱导的IL-8在HUVEC中的生产在无血清RPMI中用编码对照蛋白β-gal，野生型MyD88，显性失活形式MyD88-1pr，IκBα或显性失活形式的IKK-2的腺病毒感染原代HUVEC。2小时之后，清除病毒，并且将所述细胞在5％FCS RPMI中培养1天，以便使表达发生。然后，用20ng/ml IL-1，20ng/ml TNFα或1μg/ml LPS刺激所述细胞24小时，收集上清液，并且通过ELISA分析IL-8生产。显性失活MyD88-1pr的表达能抑制IL-1-和LPS-诱导的IL-8生产，这表明它是toll-相关受体的特异性抑制剂。IκBα和显性失活IKK-2也能抑制IL-8生产，因为它们作用于toll-相关受体信号传递途径中的MyD88的下游。TNF-诱导的IL-8生产没有受到抑制，因为没有涉及到MyD88。不过，IKK-2和IκBα也能被TNF-R信号传递途径所利用。
图12显性失活(抑制剂)MyD88在树突细胞中的表达具有相反的作用它能诱导NF-κB激活在50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培养5天之后，由外周血单核细胞制备出不成熟的DC。然后，不对所述细胞进行感染，或者在无血清培养基中用没有插入片段的对照腺病毒(Ad0)和编码显性失活MyD88的腺病毒(AdMyD88-1pr)感染所述细胞。使用100的感染复数。在表达6小时和24小时之后，裂解细胞，并且通过EMSA检查其核提取物的NF-κB DNA结合活性。令人吃惊的是，显性失活MyD88的表达能诱导它自身的NF-κB激活，这与以前的发现完全相反。
图13显性失活(抑制剂)而不是野生型MyD88的表达能诱导它自身的TNFα，并且不会抑制LPS-诱导的TNFα在树突细胞中的生产在50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4中培养5天之后，由外周血单核细胞制备出不成熟的DC。然后，不对所述细胞进行感染，或者在无血清培养基中用编码β-gal的对照腺病毒(Adβ-gal)，编码显性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)或编码野生型MyD88的腺病毒(AdMyD88wt)感染所述细胞。业已证实Adtoll是无功能的，并且应当被忽视。使用100的感染复数。24小时之后用100ng/ml LPS刺激细胞。令人吃惊的是，在没有其他刺激的情况下，显性失活MyD88的表达能诱导树突细胞自身产生TNFα。另外，它不能抑制LPS-诱导的TNFα，这一发现与以前的发现完全相反。
图14野生型MyD88的表达破坏了MyD88-1pr(显性失活)-诱导的TNFα在树突细胞中的生产用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培养5天之后，由外周血单核细胞制备出不成熟的DC。然后，不对所述细胞进行感染，或者在无血清培养基中用编码β-gal的对照腺病毒(Adβ-gal)，编码野生型MyD88(AdMyD88wt)的腺病毒和编码显性失活MyD88(Adlpr)的腺病毒感染所述细胞。在某些场合下，使用比例为1∶1和1∶5的Adlpr和Adβ-gal或AdMyD88wt的双重感染。对于单一感染来说使用100的感染复数。24小时之后，用100ng/ml LPS刺激细胞。令人吃惊的是，在没有其他刺激的情况下，显性失活MyD88的表达能诱导树突细胞自身产生TNFα。另外，它不能抑制LPS-诱导的TNFα生产，这一发现与以前的发现完全相反。
图15显性失活MyD88在树突细胞中的表达能增强抗原特异性T细胞增殖用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培养5天之后，由外周血单核细胞制备出不成熟的DC。然后，不对所述细胞进行感染，或者在无血清培养基中用没有插入片段的对照腺病毒(Ad0)，编码作为原型抗原的绿色荧光蛋白的腺病毒(AdGFP)，和编码与显性失活MyD88连接在一起的GFP的腺病毒(AdGFP-1pr)感染所述细胞。48小时之后，用2×104抗原特异性T细胞培养分级剂量的树突细胞，并且在第3天测定增殖。通过表达显性失活MyD88增强了向树突细胞中递送抗原GFP诱导的抗原特异性T细胞增殖。这一结果与我们的意外结果吻合，即在树突细胞而不是人皮肤成纤维细胞或HUVEC中抑制MyD88的活性，能诱导树突细胞激活。
图16显性失活MyD88在树突细胞中的表达增强了同种异体混合的淋巴细胞(MLR)用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培养5天之后，由外周血单核细胞制备出不成熟的DC。然后，不对所述细胞进行感染，或者在无血清培养基中用没有插入片段的对照腺病毒(Ad0)和编码显性失活形式的MyD88的腺病毒(Adlpr)感染所述细胞。48小时之后，用1×105同种异体T细胞培养分级剂量的树突细胞，并且在第6天测定增殖。显性失活MyD88的表达增强了同种异体T细胞增殖，这一发现表明增强了DC抗原呈递作用。
图17显性失活MyD88在树突细胞中的表达增强了共刺激分子(CD80，CD86)的表达用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培养5天之后，由外周血单核细胞制备出不成熟的DC。然后，不对所述细胞进行感染，或者在无血清培养基中用编码GFP的对照腺病毒和编码显性失活形式的MyD88的腺病毒(Adlpr)感染所述细胞。48小时之后，收集树突细胞，并且对CD80和CD86进行染色，它们是有效的抗原呈递功能所必需的两种非常重要的共刺激分子。显性失活形式的MyD88的表达增强了CD80和CD86的细胞表面表达，这表明增强了树突细胞抗原呈递功能。
图18显性失活MyD88在巨噬细胞中的表达能诱导p38 MAPK磷酸化在5％FCS RPMI中，通过添加100ng/ml M-CSF用2-3天时间由外周血单核细胞分化人巨噬细胞。然后，不对所述细胞进行感染，在无血清培养基中用编码β-gal的对照腺病毒感染，或用编码显性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。如图所示，使用100的感染复数(或在一种情况下使用50的感染复数)。在6，24和48小时之后，裂解细胞，并且通过蛋白印迹和磷酸-p38 MAPK-特异性抗体分析提取物中的p38 MAPK活性。出人意料的是，显性失活MyD88的表达在人巨噬细胞中诱导了p38 MAPK活性。
图19显性失活MyD88在巨噬细胞中的表达能诱导IRAK磷酸化在5％FCS RPMI中，通过添加100ng/ml M-CSF用2-3天时间由外周血单核细胞分化人巨噬细胞。还使用了在5％FCS RPMI中培养的HELA细胞。不对这两种类型的细胞进行感染，在无血清培养基中用编码β-gal的腺病毒编码野生型MyD88，或编码显性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。使用100的感染复数。在5分钟或12小时之后，裂解细胞，并且通过蛋白印迹分析提取物中的IRAK和磷酸-IRAK。在HELA细胞中，发现显性失活MyD88(MyD88-1pr)的表达能抑制IL-1-诱导的IRAK的激活。不过，出人意料的是，显性失活MyD88的表达能在人巨噬细胞中诱导了IRAK活性，通过添加LPS不能提高这种活性。这一发现表明，MyD88活性同样是在巨噬细胞中(而不是在HELA细胞中)抑制IRAK磷酸化的抑制信号所必需的，并且其抑制作用导致了IRAK的激活。
图20显性失活MyD88在巨噬细胞中的表达能诱导IκBα磷酸化在5％FCS RPMI中，通过添加100ng/ml M-CSF用2-3天时间由外周血单核细胞分化人巨噬细胞。在无血清培养基中用编码β-gal的对照腺病毒和编码显性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染细胞。使用100的感染复数。在24小时之后，裂解细胞，并且通过蛋白印迹分析提取物中磷酸-IRAK。出人意料的是，显性失活MyD88的表达能在人巨噬细胞中诱导了IκBα活性磷酸化。
图21显性失活MyD88而不是野生型MyD88在巨噬细胞中能在没有任何刺激的情况诱导TNFα，IL-6和IL-8生产在5％FCS RPMI中，通过添加100ng/ml M-CSF用2-3天时间由外周血单核细胞分化人巨噬细胞。然后，不对所述细胞进行感染，在无血清培养基中用编码β-gal的对照腺病毒感染，用编码野生型MyD88的腺病毒感染或用编码显性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。使用100的感染复数。(a)在48小时之后，收集上清液，并且在不进行任何进一步刺激的情况下，分析TNFα，IL-6和IL-8细胞因子的生产。可以在表达显性失活MyD88的细胞中检测到细胞因子生产，但不能在表达野生型MyD88的细胞或对照细胞中检测。这表明，与在树突细胞中类似而与HSF或HUVEC不同，阻断巨噬细胞中MyD88的活性，能导致细胞的激活，并释放炎性细胞因子。(b)在表达0小时，4小时，24小时和48小时之后，收集上清液，并且通过ELISA分析TNF，IL-6和IL-8。只表示了来自超量表达显性失活MyD88(MyD88-1pr)的细胞的结果，对照细胞或表达野生型MyD88的细胞具有本底水平的细胞因子生产。
实施例1人类细胞中Toll-样受体信号传递材料和方法1.试剂人类重组GM-CSF和TNFα分别是由Glenn Larsen博士(GI)和DTracey博士(BASF)馈赠的。人类重组IL-4是从R&D系统(Minneapolis，USA)购买的，而IL-1是由Hoffman La Roche馈赠的。LPS是从Sigma化学公司(St Louis，USA)获得的。
2.外周血单核细胞的制备通过对来自健康志愿者(North London Blood TransfusionService，Colindale，UK)的白细胞提取物残余物进行密度离心，获得外周血单核细胞(PBMC)。用HBSS将肝素化的残余物稀释2倍，并且将25ml稀释液小心铺放到装在50ml无菌试管中的等体积的Ficoll-Hypaque lymphoprep(Nycomed，Oslo，Norway)上，然后在室温下以2000rpm的速度离心30分钟。在离心之后，收集界面层，并且用HBSS洗涤2次(以2000rpm的速度离心10分钟)。然后收集PBMC，并且重新悬浮在30ml的含有5％FCS的RPMI中。
3.外周血T细胞和单核细胞的分离外周血T细胞和单核细胞是通过在Beckman JE6淘析离心机中进行细胞-细胞分离之后从PBMC中分离的。淘析是在含有1％FCS的RPMI的(淘析介质)中进行的。通过流式细胞术评估淋巴细胞和单核细胞纯度，使用抗CD45，CD3，CD14和CD19的荧光染料偶联的抗人单克隆抗体(Becton Dickinson，Oxford，UK)。T淋巴细胞级份通常含有约80％CD3-表达细胞，约6％CD19-表达细胞和＜1％CD14-表达细胞。单核细胞级份通常包括＞85％CD14-表达细胞，＜0.5％CD19细胞和＜3％CD3-表达细胞。
4.为了进行腺病毒感染，用M-CSF分化单核细胞为了优化腺病毒感染，以1×106细胞/ml的密度在含有100ng/ml的M-CSF(Genetics Institute，Boston，USA)的10厘米培养皿(Falcon，UK)中培养新淘析的单核细胞。在2-3天之后，用PBS洗涤所述细胞，以便除去非贴壁细胞，而其余的贴壁单核细胞用10ml解离溶液(Sigma，UK)在37℃下孵1小时。用含有5％FCS的RPMI洗涤细胞悬浮液2次，并且通过台盼兰排阻评估细胞存活力(90％)。通过FCS染色发现处于这一时期的细胞99％是CD14阳性的，并且以1×106/ml的密度在24孔或48孔平底组织培养平板(Falcon，UK)上培养，以便作进一步的实验。
5.单核细胞向树突细胞的分化以1×106细胞/ml的密度将新淘析的单核细胞放在装在10厘米培养皿(Falcon，UK)中的添加了50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4的5％FCS RPMI中培养5-6天。在第3天，补充细胞因子。与直接由血液或骨髓前体分化树突细胞相比，该方法具有若干优点。除了简单和能提供大量细胞之外，它能产生具有稳定的“不成熟DC”表型的均匀的细胞群体。通过添加TNFα(10ng/ml)，LPS(100ng/ml)或单核细胞条件培养基(50％v/v)可以使该表型成熟，再用2-3天时间形成DC。
6. 57A和未转染过的HELA，HUVEC和HSF
57A HELA细胞是由R.Hay(University of St Andrews，UK)慷慨馈赠的，并且在5％FCS，1％青霉素/链霉素DMEM中维持。按以前披露的方法(Jaffe EA等.(1973).J Clin Invest 522745-8)分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并且在存在10％FCS 10％NCS，1％青霉素/链霉素，15μg/ml内皮生长添加剂(Sigma，Poole，UK)和50IU/ml肝素的条件下在RPMI中维持。原代人皮肤成纤维细胞(HSF)是从装在T-75组织培养烧瓶中的5％FCS，1％青霉素/链霉素的DMEM中培养的，从包皮环切样品获得的。
8.腺病毒载体及其繁殖编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶(Adβ-gal)的重组复制缺陷型腺病毒载体或不具有插入片段(Ad0)的腺病毒载体是由A.Byrnes博士和M.Wood博士的(Oxford University，UK)。GFP-表达腺病毒(AdGFP)是通过AdTrack与由B.Vogelstein教授(The Howard Huges MedicalInstitute，Baltimore，USA)提供的AdEasy-1腺病毒质粒的双重组制备的。AdMyD88wt和AdMyD881pr是用由Xu博士(University ofTexas，Southwestern)和K.Burns博士(Lausanne，Switzerland)提供的质粒产生的。具体地讲，将pAdTrackCMV用于AdMEKK-1wt，而对于AdMyD88wt和AdMyD881pr来说，使用被称为AdTrack.CMVKS17的pAdTrack.CMV载体衍生物。pAdTrack.CMVKS17是通过以下方法构建的去除AdTrack.CMV的EcoRI位点及其多克隆位点(MCS)，并且插入载体pBCSK(+)(Stratagene)的较大的多克隆位点。重组病毒是在BJ5183细菌细胞中产生的，所述细胞通过热激方法用1μg线性化的pAdTrack.CMV-MEKK1wt，AdTrack.CMVKS17-MyD88wt或AdTrack.CMVKS17-My881pr构建体和100ng复制缺陷型腺病毒载体pAdEasy-1转化过的。通过其对卡那霉素的抗性筛选阳性重组克隆。在选择之后，将DNA提取物用于在293人胚胎肾细胞中进行病毒繁殖。通过用两种氯化铯梯度进行超速离心纯化病毒，正如He等.(He T.C.等.(1998).Science 2811509-12)所披露的。通过以下方法在HEK293细胞中通过噬斑分析确定滴度和病毒原种在无血清DMEM培养基(Gibco BRL)中处理1小时，然后覆盖(1.5％)琼脂(2×DMEM，含有4％FCS)混合物(v/v1∶1)，并且孵育10-14天(He T.C.等.(1998).Science2811509-12)。
9.细胞的腺病毒感染收集M-CSF-分化的巨噬细胞和不成熟的或成熟的树突细胞，计数并且重新铺平板。然后，在无血清RPMI中用能表达感兴趣的基因的复制缺陷型腺病毒感染所述细胞。对于巨噬细胞和不成熟的DC来说使用50-100的感染复数，而对于成熟的DC来说使用150-300的感染复数。2小时后，清除病毒，并且在完全培养基中再培养细胞1-2天，以便能表达感兴趣的蛋白。然后，将其用于进一步实验。
类似地，在无血清培养基中感染57A HELA，HUVEC和HSF 2小时。使用40-100的感染复数。然后，清除病毒，重新添加完整的培养基，并且将细胞再培养1-2天。
10.抗原特异性T细胞系的建立绿色荧光蛋白是从Clontech购买的。为了建立抗原特异性多克隆T细胞系，用1μg/ml绿色荧光蛋白(抗原)培养1×106 PBMC/ml 7天时间，然后用20ng/ml的I L-2再培养10-14天。每隔4天补充IL-2。由此导致了抗原特异性T细胞的扩增，和存在于PBMC中的大多数其他细胞群体的细胞死亡。在培养17-21天之后，采用一个再刺激步骤，包括在没有IL-2的条件下，以1∶1的比例用辐射过的自体PBMC和新鲜抗原培养T细胞。在4天之后，添加IL-2再培养10-14天。在将抗原特异性T细胞用于进一步实验之前，将该再刺激循环重复至少4次。
11.抗原特异性T细胞的增殖实验为了评估抗原特异性T细胞系的特异性，在96孔平底微量滴定板上用1×105辐射过的自体PBMC和各种浓度的抗原培养1×105抗原特异性T细胞。3天之后，用[3H]胸苷脉冲细胞过夜，并且在次日收获。
为了测定树突细胞诱导的抗原特异性T细胞增殖，用分级剂量的刺激过的或丝裂霉素处理过的树突细胞培养1×105抗原特异性T细胞，所述细胞是未脉冲过的，用抗原脉冲过的，未感染过的或腺病毒感染过的。2天之后，测定[3H]-胸苷的掺入。所有抗原特异性增殖实验都重复进行3次。
12.混合的淋巴细胞反应(MLR)为了分析未辐射过的或辐射过的(3000拉德，来自137Cs源)DC的免疫刺激能力，将未感染过的和腺病毒感染过的DC以分级的剂量与1×105淘析过的同种异体T细胞一起放在96孔平底微量滴定板(Falcon)中培养，有4个重复。在第5天，在用[3H]胸苷脉冲16小时(0.5μCi/孔；Amersham Life Science，UK)之后，通过胸苷掺入测定增殖。
13.细胞因子分析用腺病毒载体感染细胞2小时，然后再培养2天，以便使相关的蛋白能超量表达。在对所述细胞进行刺激24小时之后，收集培养上清液，并且保持冷冻。通过标准的2或3层夹心ELISA技术，使用TNFα，IL-4，IL-6，IL-8，IL-12和IFNγ的特异性单克隆和多克隆抗体测定细胞培养上清液中细胞因子含量。用于所述分析的抗体对和标准物是从Pharmingen购买的，只有IL-2试剂例外。它是由GeneticsInstitute(Boston，USA)馈赠的。
14.免疫荧光染色和流式细胞术为了进行FACS染色，首先收获细胞。对于需要表面受体完整的贴壁细胞来说，在37℃下使用溶解在PBS溶液中的热的2％EIDTA 20分钟。在将细胞溶解到溶液中之后，对它进行1次洗涤，然后重新悬浮在冰冷的FACS洗涤缓冲液中。随后的所有培养都是在4℃下进行。对每一种分析来说，将5×105细胞与相关的抗原特异性抗体或同种型对照一起孵育30分钟，然后用FACS洗涤缓冲液洗涤2次。然后通过流式细胞术检查所述细胞。可以在FACScan流式细胞计(Becton和Dickinson)上通过使用CellQuest(Becton Dickinson)分析细胞。直接与HLA-DR，HLA-A，B，C，CD80，CD86，CD3，CD14和CD25偶联的单克隆抗体是从Pharmingen购买的(San Diego，USA)。
15.细胞质蛋白提取物的制备制备细胞质提取物，以便通过蛋白印迹研究与信号传递相关的生物化学事件。将贴壁细胞从组织培养平板/烧瓶上刮至新鲜PBS中，并且通过离心收获(在4℃下以13000g的速度离心10秒)。通过类似的离心方法使非贴壁细胞沉淀，并且用新鲜PBS洗涤1次。在弃掉上清液之后，根据要裂解的细胞的数量(每1×106个细胞50-100μl)添加合适量的冰冷低渗裂解缓冲液(Whiteside S.T.等(1992)。NucleicAcids Res 201531-8)。在冰上孵育10分钟之后对裂解物进行离心(13000g，5分钟，4℃)，以便除去细胞核和细胞碎片。然后将澄清的裂解液取出放入新的试管中，冷冻，并且在-20℃下保存，以便随后估算蛋白浓度，并用于蛋白印迹分析。
16.核蛋白提取物的制备制备核蛋白提取物，是为了研究NF-κB激活，以及从细胞质向细胞核的转运，及其DNA结合能力。在裂解缓冲液(见第部分)中裂解细胞之后，通过离心使细胞核沉淀(在4℃下以13000g的速度离心5分钟)，用低渗裂解缓冲液洗涤1次，以便除去污染性细胞质蛋白，然后重新悬浮在高渗提取缓冲液中，在4℃下搅拌培养1-2小时。低渗裂解缓冲液抑制了在裂解期间蛋白从细胞核中渗出，而高渗提取缓冲液使得核膜穿孔，使核蛋白能够进入溶液。在离心之后(在4℃下以13000g的速度离心10分钟)，将含有核蛋白的上清液取出放入新的试管，并且在-70℃下保存。这种核提取物制备方法基于Whiteside S.T.等的方法((1992).Nucleic Acids Res 201531-8)。
17.免疫沉淀为了免疫沉淀IRAK，在4℃下在柔和振荡的条件下将细胞质提取物与3μg抗-IRAK抗体一起孵育。然后添加50μl的50％浆液蛋白G琼脂糖(Amersham)，并且再振荡2小时。然后，收集与蛋白G琼脂糖结合的IRAK，洗涤4次，重新悬浮在蛋白印迹加样缓冲液中，煮沸5分钟，然后马上用于蛋白印迹分析。
18.蛋白浓度分析在将细胞质或细胞核提取物用于任何进一步的实验方法(例如蛋白印迹分析，电泳迁移率变动分析)之前，必须测定其蛋白浓度，以便确保在每一份样品中存在相同量的蛋白。通过Bradford分析评估蛋白浓度。简单地讲，将20μl适当稀释过的提取物连同20μl被用作标准物的一系列浓度在10-1000μg/ml范围内的BSA(Sigma，UK)一起添加到96孔组织培养平板上，共三份。然后向每一个孔中添加200μlBradford试剂，并且在分光光度计(Multiscan Bichromatic，Labsystems)上在595nm的波长下测定吸收值。根据由各种BSA浓度制备的线性标准曲线确定细胞质和细胞核提取物中的蛋白含量。
19.蛋白印迹和电泳迁移率变动分析通过在10％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE分离细胞质蛋白，然后电转移到硝酸纤维素膜上。分别用从Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz，USA)和Upstate Biotechnology(USA)购买的抗体检测IκBα和IRAK，而通过从New England Biolabs购买的抗体检测磷酸化形式的IκBα，p38和p42/44 MAPK。
20.荧光素酶分析在LPS刺激之后，用PBS洗涤细胞1次，并且用100μl的CAT裂解缓冲液(0.65％(v/v)NP40，10mM Tris-HCL pH 8，0.1mM EDTApH8，150mM NaCl)裂解。将细胞裂解液(50μl)转移到发光计样品槽条的孔中，并且添加荧光素酶分析缓冲液(220μl)。用Labsystem发光计通过在每个分析点上分配30μl荧光素(1.5mM，Sigma，Poole，UK)测定荧光素酶活性。通过Bradford分析测定细胞裂解物的蛋白浓度，并相应调整测定的荧光素酶活性。
结果Myd88是含有toll和死亡结构域细胞质蛋白(图1)，它与TRR成员TLR(图2)和IL-1受体的信号传递机制相关。在N-末端含有53个氨基酸缺失和Phe56Asn突变的Myd88的突变蛋白Myd881pr(图1)能够在Hela细胞(图3)和人皮肤成纤维细胞(图4)中起IL-1的抑制剂作用，但不能起NF-κB的TNF激活(图3和4)和MAPK激活(图4)的抑制剂作用。与该结果吻合的是，当Myd881pr在所述细胞中表达时，同样能抑制IL-1诱导的IL-6在人皮肤成纤维细胞中的生产(图5)。相反，Myd88本身能诱导IL-6生产，而无需任何IL-1激活(图5和6)。相反，Myd881pr对TNF诱导的IL-6在HSF中的生产没有任何影响(图6)。这一结果是预料中的，因为Myd88不参与TNF信号传递。当Myd881pr在人皮肤成纤维细胞中表达时，也能抑制IL-1(图7)但不能抑制TNF诱导的IL-8(图8)生产。Myd881pr的抑制作用并不局限于人皮肤成纤维细胞，正如在用AdMyd881pr转染的HUVECs进行研究所证实的。IL-1和LPS-诱导的NF-κB激活和p42/44 MAPK激活(图9)以及IL-6和IL-8生产(图10和11)也受到抑制。与以上结果不同，我们惊奇地发现，当在不成熟的DC中表达时，Myd881pr激活了NF-κB(图12)，而不需要任何额外的刺激。另外，Myd881pr的表达能够诱导不成熟的DC产生TNF(图13)，而与HSF不同，Myd88没有作用(图13)。Myd881pr在DC中的激活作用受到了Myd88的拮抗，这表明这两种类型竞争相同的信号传递途径(图14)。正如用GFP抗原特异性T细胞进行的研究(图15)或在同种异体MLR(图16)中所证实的，Myd881pr的激活作用翻译成了DC的增强了的抗原呈递功能。DC的抗原呈递功能与诸如CD80和CD86的共刺激分子在DC表面的表达的上调相关。与该刺激作用吻合的是，发现当Myd881pr在不成熟的DC中表达时能增强CD80和CD86的表达(图17)。Myd881pr的激活作用不局限于NF-κB，因为Myd881pr在另一种潜在的APC即MCSF-人巨噬细胞中的表达，导致了p38 MAPK(图18)和IRAK(图19)的激活。相反，但是与图3所示的以前用Hela细胞进行的研究吻合，Myd881pr抑制了IL-1诱导的IRAK磷酸化(图19)。因为对于DC来说，Myd881pr还诱导了人MCSF巨噬细胞中IκBα磷酸化(图20)，并且诱导或增强了人巨噬细胞的TNF，IL-6和IL-8的生产(图21)。
讨论Toll相关受体包括Toll样受体(TLR)，它是跨膜受体蛋白，它具有包括富含亮氨酸的重复的细胞蛋白，该重复能识别LPS-LBP-CD14复合体，并具有一个细胞质结构域(Toll结构域)，该结构域还存在于IL-1R和相关分子的细胞内部分中(Gay NJ and Keth FH，Rock F等1997)。TRR通常使用信号传递成分，如Myd88，IRAK和TRAF6。具体地讲，Myd88与TRR一样，也包括Toll结构域，它通过同型相互作用与所述受体的Toll结构域缔合在一起。Myd88还具有一个死亡结构域，它通过该结构域与IRAK缔合，并因此将TRR与细胞内信号传递途径连接在一起。以前业已证实，显性失活Myd88的表达抑制了293细胞中IL-1和LPS信号传递(Mujio等1998)，并且同时抑制了细胞因子释放和MAPK/NF-κB激活。在人皮肤微血管内皮细胞中以及在原单核细胞系THP-1中获得了类似结果(Zhang FX等1999)，其中，显性失活Myd88的瞬时超量表达阻断了IL-1和LPS-诱导的NF-κB激活。
Myd88剔除小鼠不能诱导LPS-依赖型TNFα生产(Kawai等1999)。不过，尽管剔除了IL-1和IL-18诱导的MAPK和NF-κB激活，在鼠类Myd88-1-巨噬细胞中所述途径的LPS-诱导的激活似乎正常，只是略微推迟了一点。
我们业已利用有效的腺病毒基因转移技术检查了TRRs在人原代细胞中的作用，以便超量表达野生型(Myd88wt)或Myd88突变蛋白，或Myd881pr(图1)。正如由Burns等(1998)以前的研究所预料的，Myd881pr能够阻断HSF，HUVECs和Hela细胞中的信号传递。另外，Myd881pr阻断了HUVECs中的LPS信号传递。Myd881pr的抑制作用包括诸如NF-κB和MAPK的信号传递分子的激活和细胞因子生产。正如所预料的，TNF信号传递途径未受影响。另外，在HSF中，Myd88wt能够诱导细胞因子生产，而无需任何额外的刺激。不过，出乎意料的是，我们发现将Myd881pr导入不成熟的DC和MCSF巨噬细胞，导致了NF-κB，MAPK的激活和细胞因子生产。另外，在DC中，共刺激分子CD80和CD86的表达主要与所述APC的抗原呈递功能相关，通过Myd881pr上调了所述功能。作为上述作用的结果，Myd881pr的表达大大增强了DC的抗原呈递功能。
以上结果意味着，在DC和巨噬细胞中，TRR信号传递的抑制能导致所述细胞的激活。这表明，可能存在TRR，其作用是抑制APC，特别是抑制DC功能。这种推测得到了以下发现的部分支持，即Myd881pr的刺激作用受到了Myd88wt的同时表达的抑制。另外，与Hela细胞不同，在Hela细胞中Myd881pr能抑制IRAK激活，而在巨噬细胞中，Myd881pr能诱导这种激酶的激活。
除了对给我们对TRR信号传递的理解增加了一层新的复杂性，以及所述受体对调控细胞功能具有何种作用之外，以上结果业已揭示了一种与控制抗原呈递活性相关的新的途径。该途径可用于对免疫系统进行治疗性调节，用于自身免疫病和过敏的预防和治疗，并且还可用于需要刺激免疫系统的场合，如用于免疫接种。所述途径的发现可能对疫苗设计和免疫调节方法在总体上产生重大影响。
编号的参考文献1.Rock等(1998)PNAS 95，588-5932.O’Neill & Dinarello(2000)Immunol Today 21，206-2093.Poltorak等(1998)Science 282，2085-20884.Underhill等(1999)Nature 401，811-8155.Burns等(1998)JBiol Chem 273，12203-122096.Kawai等(1999)Immunity11，115-1227.Takeuchi等(2000)Int Immunol 163，978-9848.Du等(2000)Eur Cytokine Netw 11，362-371实施例2树突细胞培养物来自正常志愿者的示例性树突细胞培养物将CD14+外周血单核细胞贴在组织培养烧瓶上，并且在存在1％AB血清，GM-CSF(400ng/ml)和IL-4(400IU/ml)的条件下培养7天。由此得到了具有DC形态的细胞，并且平均49％的细胞具有CD1a+标记，它是能摄取并呈递抗原的不成熟的DC形式的标记。然后通过添加TNFα(15ng/ml)使所述细胞成熟成CD83+细胞，这使得DC向细胞毒性T-细胞呈递抗原。7％的细胞在1天内成为CD83+，不过，要获得最大效果至少需要3天时间。可以用单核细胞条件培养基取代1％AB血清，不过这样做可能不太理想。
来自癌症患者的示例性树突细胞在挽救性化疗之前和之后从患有复发的转移性疾病的6位患者体内制备DC(一共12个外周血液样品，每个样品50ml)。
临床研究按照标准方法由患者捐献一个单位的自体血液。在献血之前，由输血服务医生对患者进行评估。以与同种异体献血相同的方式对自体献血进行筛选，寻找常见病毒标记(HIV，HBV，HCV和梅毒)，并且在对询问患者是否愿意参与之后得到了患者的同意。这种预防措施保护临床和实验室职员免受潜在感染，并且防止常规血液供应受到可能交叉污染的可能性。将血液采集到常见的方形包装袋中，这能使得红细胞，血块黄色层和血浆自动分离。血块黄色层产生了大约670×106单核白细胞，使用现有技术它能提供大约47×106DC。每位患者使用8-128×106DC的剂量。将外周血单核细胞分成两份，并且用TRR信号传递抑制剂(例如MyD881pr，选择性地与细胞摄取促进剂一起使用)和抗原性肽或肿瘤细胞提取物脉冲1-10天。另外，让外周血单核细胞接触DNA疫苗构建体，例如编码TRR信号传递抑制剂(例如MyD881pr)和编码抗原性肽的腺病毒构建体，并且培养10天，可以多次接触所述疫苗。与同种异体AB血清相比，优选使用无血清培养条件或自体血浆。合并培养的DCs，洗涤，并且重新悬浮在100ml盐水中，然后用1小时输液。自体红细胞浓缩物不再送回到患者体内，而是进行标准临床指示。按照良好的生产操作方法，实施离体的DC培养方法。
此时，捐献最初血液样品的患者业已接受了挽救性化疗，并且可能或不可能处在临床缓解中。其他患有复发性转移疾病的患者在接受化疗之前接受治疗。有两套治疗方案(1)转移性复发，标准治疗，然后进行过继免疫治疗；(2)转移性复发，过继免疫治疗，然后进行标准治疗。
产品输液是在有经验的医生的直接监督下，在白天在病房里的病床上进行的，在这里，如果必要的话可以得到抢救和支持性护理设施。
权利要求
1.一种增强抗原呈递作用的方法，包括给诸如树突细胞的抗原呈递细胞，或前体细胞提供Toll-相关受体(TRR)信号传递的调节剂，优选抑制剂的步骤。
2.一种抑制抗原呈递作用的方法，包括给诸如树突细胞的抗原呈递细胞，或前体细胞提供Toll-相关受体(TRR)信号传递的调节剂，优选增强剂的步骤。
3.一种治疗需要增强抗原呈递作用的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞，或前体细胞提供Toll-相关受体(TRR)信号传递的调节剂，优选抑制剂的步骤。
4.一种治疗需要抑制抗原呈递作用的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞，或前体细胞提供Toll-相关受体(TRR)信号传递的调节剂，优选增强剂的步骤。
5.如上述权利要求中任意一项的方法，其中TRR信号传递的调节剂，增强剂或抑制剂能调节细胞外分子与TRR的结合。
6.如上述权利要求中任意一项的方法，其中TRR信号传递的调节剂，增强剂或抑制剂能调节细胞内分子与TRR的结合。
7.如上述权利要求中任意一项的方法，其中TRR信号传递的调节剂，增强剂或抑制剂能调节MyD88与TRR的结合。
8.如上述权利要求中任意一项的方法，其中TRR信号传递的调节剂，增强剂或抑制剂能调节MyD88与包括死亡结构域(DD)的多肽的结合。
9.一种治疗需要增强抗原呈递作用的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞，或前体细胞提供直接与MyD88相关的信号传递步骤的抑制剂的步骤。
10.如权利要求1-4，8或9中任意一项的方法，其中所述抑制剂是MyD88的显性失活突变体。
11.一种治疗需要增强抗原呈递作用的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞，或前体细胞提供MyD88的显性失活突变体的步骤。
12.如权利要求1-4，8-11中任意一项的方法，其中所述抑制剂或显性失活突变体是MyD88lpr。
13.一种治疗需要抑制抗原呈递作用的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞，或前体细胞提供直接与MyD88相关的信号传递步骤的增强剂的步骤。
14.如权利要求2，4，6，7，8或13中任意一项的方法，其中所述增强剂是MyD88。
15.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述调节剂，增强剂或抑制剂或显性失活突变体是在细胞中或患者中表达的。
16.如权利要求15的方法，其中，给所述患者或细胞施用能够在细胞中或患者中表达所述调节剂，增强剂或抑制剂或显性失活突变体的多核苷酸。
17.如权利要求16的方法，其中，所述多核苷酸是以腺病毒载体形式施用的。
18.一种鉴定作为抗原呈递作用的抑制剂的化合物的方法，包括鉴定能够调节，优选激活诸如树突细胞的抗原呈递细胞或所述细胞的前体中TRR信号传递的化合物。
19.一种鉴定作为抗原呈递作用的增强剂的化合物的方法，包括鉴定能够调节，优选抑制诸如树突细胞的抗原呈递细胞或所述细胞的前体中TRR信号传递的化合物。
20.如权利要求18或19的方法，其中，TRR信号传递的激活或抑制是通过观察MyD88与相互作用分子的相互作用的改变检测的。
21.一种鉴定作为抗原呈递作用的抑制剂或增强剂的化合物的方法，包括以下步骤将测试化合物暴露于存在于抗原呈递细胞或其前体中的MyD88或MyD88的结合配偶体，和确定所述化合物是否能结合MyD88或MyD88的结合配偶体。
22.如权利要求22的方法，其中，所述MyD88的结合配偶体是TRR或包括DD的多肽。
23.将存在于抗原呈递细胞中的MyD88(或另一种接头分子，例如TIRAP或Mal或TollIP)或MyD88或其他接头分子的结合配偶体用于鉴定抗原呈递作用的抑制剂或增强剂的方法中的用途。
24.通过权利要求18-22中任意一项的本发明的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物。
25.将通过权利要求18-22中任意一项的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物用于医学的用途。
26.将存在于抗原呈递细胞或其突变体中的MyD88的结合配偶体或编码它的多核苷酸用于医学的用途。
27.将通过权利要求18-22中任意一项的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物或存在于抗原呈递细胞或其突变体中的MyD88的结合配偶体用于生产用来治疗需要抑制或增强抗原呈递作用的患者的药物的用途。
28.将Toll-相关受体(TRR)信号传递的抑制剂或编码它的多核苷酸用于医学的用途。
29.将Toll-相关受体(TRR)信号传递的增强剂或编码它的多核苷酸用于医学的用途。
30.将直接与MyD88相关的信号传递步骤的增强剂或抑制剂或编码它的多核苷酸用于医学的用途。
31.用于医学的MyD88的组成型活性突变体或显性失活突变体或编码它的多核苷酸。
32.一种重组多核苷酸，包括(1)一个编码如权利要求1-10，12-14中任意一项所限定的信号传递抑制剂或增强剂，或如权利要求11，12，26中任意一项所限定的MyD88的结合配偶体或MyD88多肽，或通过权利要求18-22中任意一项的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物的部分(调节部分)，和(2)一个编码抗原性分子的部分。
33.如权利要求32的重组多核苷酸，其中所述抗原性分子包括一个存在于转化过的或癌细胞上的或存在于致病性生物上的，或存在于受致病性生物感染的细胞上的表位。
34.一种各部分的试剂盒、组合物、或嵌合分子，包括(1)一个包括如权利要求1-10，12-14中任意一项所限定的调节剂、信号传递抑制剂或增强剂，或如权利要求11，12，26中任意一项所限定的MyD88的结合配偶体或MyD88多肽，或通过权利要求18-22中任意一项的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物的调节部分(或编码所述调节部分的多核苷酸)，和(2)一个包括如权利要求32或33所限定的抗原性分子的抗原性部分(或编码所述抗原性部分的多核苷酸)。
35.一种调节患者的抗原呈递作用的方法，包括以下步骤(1)从所述患者获得抗原呈递细胞或其前体，优选树突细胞或其前体；(2)离体让所述抗原呈递细胞与如权利要求1-10，12-14中任意一项所限定的调节剂，信号传递抑制剂或增强剂，或如权利要求11，12，26中任意一项所限定的MyD88的结合配偶体或MyD88多肽，或通过通过权利要求18-22中任意一项的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物(或编码它们的多核苷酸)接触，并且任选与需要针对它的免疫反应的抗原接触；或与权利要求32-34中任意一项限定的嵌合分子或多核苷酸接触；和(3)将如此处理过的抗原呈递细胞重新导入所述患者体内。
36.一种能有效抗癌，或癌细胞或肿瘤细胞，或抗致病生物或受致病生物感染的细胞的疫苗，包括有效量的如权利要求1-10，12-14中任意一项所限定的信号传递抑制剂，或如权利要求11，12，26中任意一项所限定的MyD88的结合配偶体或MyD88多肽，或通过通过权利要求18-22中任意一项的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物，或编码它们的多核苷酸。
37.如权利要求36的疫苗，还包括具有存在于癌细胞或肿瘤细胞，或致病生物或受致病生物感染的细胞上的表位的抗原(或编码该抗原的多核苷酸)。
38.如权利要求36或37的疫苗，其中，所述疫苗是核酸疫苗。
39.一种药物组合物，包括如权利要求1-10，12-14中任意一项所限定的调节剂，信号传递抑制剂或增强剂，或如权利要求11，12，26中任意一项所限定的MyD88的结合配偶体或MyD88多肽，或通过通过权利要求18-22中任意一项的筛选方法鉴定的或可以鉴定的化合物，或编码它们的多核苷酸，或权利要求34的组合物或嵌合分子或权利要求36-38中任意一项的疫苗，或权利要求32的多核苷酸，以及可以药用的载体。
40.一种杀伤患者体内的错误表达第一种表位的靶细胞的方法，该方法包括以下步骤(1)从所述患者获得诸如树突细胞的抗原呈递细胞；(2)离体让所述抗原呈递细胞与抗原呈递细胞中的TRR信号传递的调节剂，优选抑制剂接触，或者与编码抗原呈递细胞中TRR信号传递的抑制剂的多核苷酸或表达载体接触；(3)任选让所述细胞与所述表位或编码所述表位的多核苷酸或表达载体接触，和(4)将如此处理过的抗原呈递细胞重新导入所述患者。
41.如权利要求40的杀伤患者体内的靶细胞的方法，其中，所述靶细胞是癌细胞。
42.一种治疗患有癌症或致病生物感染或具有患这些病的危险的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞，或前体细胞提供(1)TRR信号传递的抑制剂或(2)直接与MyD88相关的信号传递步骤的抑制剂，或(3)MyD88的显性失活突变体的步骤。
43.一种治疗患有自身免疫病或移植排斥或过敏或具有患这些病的危险的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞，或前体细胞提供(1)TRR信号传递的调节剂，优选激活剂，或(2)直接与MyD88相关的信号传递步骤的调节剂，或(3)MyD88的步骤。
44.将(1)TRR信号传递的调节剂，优选抑制剂，或(2)直接与MyD88相关的信号传递步骤的抑制剂，或(3)MyD88的显性失活突变体(或编码它们的多核苷酸)用于生产用来治疗需要增强抗原呈递作用和/或患有癌症或致病生物感染和/或与致病形式的蛋白生产相关的疾病，如阿尔茨海默病或海绵状脑病或具有患这些病的危险的患者的药物的用途。
45.将(1)TRR信号传递的调节剂，优选激活剂，或(2)直接与MyD88相关的信号传递步骤的激活剂，或(3)MyD88(或编码它们的多核苷酸)用于生产用来治疗需要患有自身免疫病或移植排斥或具有患这些病的危险的患者的药物的用途。
46.如权利要求44或45的用途，其中，所述药物还包括一种抗原或编码抗原的多核苷酸。
47.用于医学目的如权利要求39所述的药用组合物，多核苷酸，嵌合分子或疫苗。
48.将如权利要求39所述的药用组合物，多核苷酸，嵌合分子或疫苗用于生产用来治疗需要抑制或增强抗原呈递作用的患者的药物的用途。
49.一种治疗需要增强抗原呈递作用的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞，或前体细胞提供Mal或TIRAP或TollIP的步骤。
50.一种治疗需要抑制抗原呈递作用的患者的方法，包括给所述患者或所述患者的诸如树突细胞的抗原呈递细胞，或前体细胞提供Mal或TIRAP或TollIP，或其片段、融合体或变体的步骤。
51.一种鉴定作为诸DC的APC的抗原呈递作用的抑制剂或增强剂的化合物的方法，包括以下步骤让一种测试化合物暴露于TRR相互作用分子(接头分子)或所述接头分子的APC结合配偶体(即存在于诸DC的APC，或其前体中的接头分子的结合配偶体)接触，和确定所述化合物是否能够结合所述接头分子或所述接头分子的APC结合配偶体。
52.如权利要求51的方法，其中，所述接头分子是Mal或TIRAP或TollIP。
53.一种各部分的试剂盒或组合物或嵌合分子，包括(1)Mal或TIRAP或TollIP或其片段、衍生物或融合体(或编码所述部分的多核苷酸)和(2)包括或编码一种抗原性分子的抗原性部分。
54.用于医学的权利要求53的各部分的试剂盒或组合物或嵌合分子。
55.将权利要求53的各部分的试剂盒或组合物或嵌合分子用于生产用来治疗需要调节抗原呈递作用的患者的药物的用途。
56.一种能有效抗癌，或癌细胞或肿瘤细胞，或抗致病生物或受致病生物感染的细胞的疫苗，包括有效量的Mal或TIRAP或TollIP或其片段、变体或融合体，或编码它们的多核苷酸。
57.如权利要求56的疫苗，还包括具有存在于癌细胞或肿瘤细胞，或致病生物或受致病生物感染的细胞上的表位的抗原(或编码该抗原的多核苷酸)。
58.如权利要求56或57的疫苗，其中，所述疫苗是核酸疫苗。
全文摘要
一种增强抗原呈递作用的方法，包括给诸如树突细胞的抗原呈递细胞、或前体细胞提供To11－相关受体(TRR)信号传递调节剂，优选抑制剂的步骤。一种抑制抗原呈递作用的方法，包括以给诸如树突细胞、或前体细胞的抗原呈递细胞提供To11－相关受体(TRR)信号传递的调节剂，优选增强剂的步骤。TRR信号传递的抑制剂可以是MyD88的显性失活突变体，例如MyD881pr。
文档编号A61K39/39GK1649618SQ01822685
公开日2005年8月3日 申请日期2001年12月21日 优先权日2000年12月22日
发明者B·M·J·福克斯维尔, M·费尔德曼 申请人:辛诺维斯有限公司