专利名称：一种检测甲苯胺红的间接竞争法酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于酶联免疫和食品安全领域中违禁添加剂检测分析技术领域，具体而 言，本发明涉及一种用于检测对位红的间接竞争法酶联免疫检测试剂盒。
背景技术：
甲苯胺红与对位红一样同属于偶氮系列化工合成染色剂，主要应用于油彩颜料及 橡胶制品的着色，常温下呈固态。由于其结构(见下图)与致癌物苏丹红相似，在代谢过程 中偶氮苯可被降解，产生苯胺，苯胺可直接作用于肝细胞，引起中毒性肝病，长期摄入苯胺 可造成人体的神经系统损害，并具有潜在的致癌性，因此被禁止用于食品生产。 由于添加甲苯胺红后可使辣椒制品、番茄制品以及香肠等食品长期保持鲜艳光亮 的樱桃红色，增加了产品的外观新鲜度，而且在偶氮染料中价格相对便宜，可大幅降低生产 成本，因而被不法商家作为食品添加剂使用，以吸引消费者，虽屡禁而不止，给消费者带来 巨大的危害。( 二 )相关国家标准的检测方法现状目前国内仍没有针对甲苯胺红的检测方法标准，其日常检测主要参考苏丹红的方 法标准(GB/T 19681-2005)，采用溶剂萃取，液相色谱测定。国外实验室甲苯胺红的检测， 则常采用液相、气相色谱法或与质谱联用进行定性、定量。这些方法具有检测精度高、灵敏、 准确、稳定等一系列优点，但设备及检测费用昂贵、操作复杂、分析时间长，不能实现现场检 测，限制了其推广和应用，也给甲苯胺红的快速检测和监管带来困难。目前国内外还没有专 门针对甲苯胺红的快速免疫检测方法报道，因而建立高灵敏度的甲苯胺红快速检测技术成 为当务之急。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测甲苯胺红的酶联免疫试剂盒。本发明提供了一种快速检测甲苯胺红的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括甲苯胺 红特异性抗体、甲苯胺红_载体蛋白偶联物和酶标二抗。其中甲苯胺红特异性抗体为甲苯 胺红的多克隆抗体或单克隆抗体，可用甲苯胺红与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物(例如兔或鼠)制得。所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或匙孔 铜兰蛋白(KLH)。所述的对位红_载体蛋白偶联物采用化学方法偶联得到。所述酶标二抗 的标记酶为辣根过氧化物酶，所述酶标二抗可以用商品化的辣根过氧化物酶酶标二抗，也 可以通过过碘酸钠法或戊二醛法将辣根过氧化物酶与二抗偶联制得。在本发明的一个优选 实施方案中，所述酶标二抗为酶标羊抗兔IgG抗体或酶标羊抗鼠抗体。用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙 烯。载体的形式是微量反应板凹孔。为方便现场检测和大量样本筛查，所述试剂盒还可以进一步包括包被有对位红抗 原的酶标板、对位红标准溶液、显色剂、浓缩洗涤液、终止液和浓缩样品稀释液。所述的浓缩洗涤液为0. 5%吐温-20 10倍磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂 A液和显色剂B液组成(例如，使用体积比为1 1)，显色剂A液为过氧化氢或过氧化脲， 显色剂B液为四甲基联苯胺或邻苯二胺。所述的浓缩样品稀释液为含0. 吐温-20的10 倍磷酸盐缓冲液。另一方面，本发明还提供了一种检测饲料、水产品或食品样品中对位红含量的方 法，包括步骤(1)样品前处理；(2)用权利要求1-9任一所述的试剂盒进行检测，向包被有对位红抗原的酶标板 孔中加入标准品或样品溶液，再加入抗甲苯胺红多克隆或单克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加 入酶标记二抗，孵育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；(3)分析检测结果。本发明试剂盒的检测原理为将甲苯胺红抗原吸附于固相载体上，加入样本或甲苯胺红标准品溶液并加入甲苯 胺红抗体工作液，待测样品中甲苯胺红和固相载体上包被的甲苯胺红抗原竞争甲苯胺红抗 体，再加入酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值 与样品中甲苯胺红的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出甲苯胺红浓度范围。有益效果本发明检测甲苯胺红的试剂盒主要采用间接竞争酶联免疫吸附测定法定性或定 量测定样品中甲苯胺红含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检 测大批样品。本发明中，该试剂盒采用高特异性的甲苯胺红多克隆或单克隆抗体，主要试剂以 工作液形式提供，可以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁 造成的误差，本发明具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试 剂保存时间长、自动化程度高、无放射性同位素污染的等优点，可在饲料及动物源性产品检 测中发挥重要作用。
附图为甲苯胺红检测曲线，其中系列1是lyg/ml-l 20000组合，系列2是 0. 5 μ g/ml-1 10000 组合，系列 3 是 0. 25μ g/ml-1 5000 组合。。
4实施例提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护 范围构成任何限制。实施例1免疫原的合成及多克隆、单克隆抗体制备1. 1试剂与仪器甲苯胺红(德国Dr)，琥珀酸酐(Sigma公司)，吡啶(Sigma公司)，EDC(上海共价 化学试剂公司)，牛血清白蛋白(BSA)、匙钥孔血蓝蛋白(KLH，Sigma公司)，辣根过氧化物 酶(HRP)(上海楷洋生物技术有限公司)，其它试剂均为分析纯。双光束紫外可见分光光度仪(TU-1909，北京普析通用仪器有限公司)，层析装置 (3057型便携式记录仪，重庆川仪四厂；SBS系列数控计滴器，恒流泵，自动部分收集器，层 析柱，上海沪西分析仪器厂)，磁力搅拌器(上海东荣丰科学仪器有限公司)，台式离心机 (Minispin 最大转速 13400rpm 最大离心力 12100rcf, 2ml X 12)。1. 2甲苯胺红人工抗原的合成1.2.1免疫原的合成称取25毫克(0. Immol)甲苯胺红溶于5ml吡啶中，充分搅拌使其完全溶解，加入 10毫克琥珀酸酐，室温搅拌24小时，N2吹干，以一定体积DMSO复溶称取50毫克KLH，以0. lmol/L的PBS溶解，缓慢滴加DMSO充分搅拌，使其占总溶 液的50%，将琥珀酸酐化的对位红加入到KLH溶液中，以加入EDC 0. 2-0. 3M (约IOOmg)，搅 拌反应过夜。然后，将偶联物过S印hadeXG-25M凝胶层析纯化，用0. OlM pH 7. 4PBS三倍柱床体 积平衡，调节流速至3ml/min，样品浓缩至5ml加入到平衡好的层析柱中层析提纯偶联物， 洗脱液用 PH 7. 4 0. OlM PBS。提纯后的免疫原分装后_20°C冻存。1.2. 2包被抗原的合成称取25毫克(0. Immol)的对位红溶于5ml无水吡啶中，加入10毫克琥珀酸酐，室 温下搅拌24小时，N2吹干，以一定体积DMSO复溶。称取40毫克卵清蛋白(OVA)，以0. lmol/L的PBS溶解，缓慢滴加DMSO充分搅拌，使 其占总溶液的50%，将琥珀酸酐活化的甲苯胺红加入到OVA溶液中，加入EDC 0. 2-0. 3M(约 100-150mg)，搅拌反应过夜。然后，将偶联物过S印hadeXG-25M凝胶层析纯化，用0. OlM pH 7. 4PBS三倍柱床体 积平衡，调节流速至3ml/min，样品浓缩至5ml加入到平衡好的层析柱中层析提纯偶联物， 洗脱液用 PH 7. 4 0. OlM PBS。提纯后的包被抗原加等量甘油，分装后_20°C保存。1. 3单克隆或多克隆抗体的制备将上述甲苯胺红-KLH偶联物用生理盐水稀释成lmg/ml溶液备用。选取5只BLBE/C小鼠，将偶联物与等量弗氏完全佐剂通过注射器对抽法混合成油 包水的乳浊液，按IOOug/只的进行首次免疫，采取背部皮下多点注射。每隔两周加强免疫 一次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，剂量及方法同首次免疫。从第三次免疫开始， 每次免疫后10天，尾静脉取血进行抗体特异性检测，抗体符合要求后准备细胞融合，在细胞融合前3天加强免疫一次，然后取脾脏融合。然后按照单克隆细胞株的筛选培养程序进 行阳性细胞株的制备。然后将符合要求的细胞株注入小鼠腹腔，制备单克隆抗体腹水。用同样的免疫程序，免疫5只日本大耳白兔，制备多克隆的抗体。3免一周后采血 清测定抗体滴度和特异性，4免一周后取全血清。用硫酸铵沉淀法提纯抗体，过S印hadeX-G25柱除去硫酸铵。所得抗体用于效价和 特异性测定。1. 4抗体效价和特异性测定1. 4. 1间接ELISA检测抗体效价以10 μ g/ml的甲苯胺红-OVA按每孔100 μ 1包被酶标板，4°C包被24h，洗涤5次， 拍干，每孔加入200μ1 2%的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液(封闭液)，4°C下封闭12h，洗涤 3次，拍干。加入不同稀释倍数的抗体ΙΟΟμ 1，37°C孵育2h，洗涤三次，立即加入ΙΟΟμ 1酶 标羊抗兔或羊抗鼠抗体，37°C孵育30min，洗涤三次，加50 μ 1显色剂A液和50 μ 1显色剂B 液，室温避光作用15min，加50 μ 1终止液终止反应，酶标仪检测OD值(450nm)。同时设置 阴性对照孔和平行重复孔。抗体溶液以1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、16000倍、32000 倍稀释。以两倍于阴性血清OD值的抗血清OD值对应的抗体稀释度为抗体效价。检测结果 见表-1表-1抗体效价检测结果(平均OD值) 据上表数据可以确定抗体效价为32000以上，满足实验要求。1. 4. 2间接竞争ELISA检测抗体特异性ELISA操作方法同1. 4. 1。每孔加入100 μ 1不同浓度的游离甲苯胺红与包被物 竞争随后加入抗体溶液，得出不同的OD值。根据1.4. 1的结果，所用抗体最佳浓度约为 1 5000。甲苯胺红抑制浓度系列值和抗体的IC5tl值结果见表-2，(以0抑制孔的OD值 为最大值Btl，其它抑制浓度孔OD值为B，Β/Β0 = 50%时对应的对位红浓度为此抗体的IC5tl 值。)由表中数据可知，甲苯胺红抗血清IC5tl值在9 μ g/L左右。表-2抗体特异性检测结果(0D平均值) 实施例2间接竞争ELISA方法的建立2. 1 ELISA棋盘法确定包被抗原和抗体最佳工作浓度将 ΙΟΟμ g/ml、10 μ g/ml、1 μ g/ml、0· 5 μ g/ml、0· 25 μ g/ml >0. 125 μ g/ml 系列浓度的甲苯胺红-OVA按每孔100 μ 1包被酶标板，4°C包被24h，用洗液洗涤4次，在吸水纸上 拍干，每孔用200μ1封闭液4°C下封闭12h，洗涤3次，在吸水纸上拍干。加入1 1000， 1 2000,1 4000,1 6000,1 8000,1 10000 稀释的抗体溶液 100 μ 1，室温作用 lh， 洗涤4次，立即加入100 μ 1酶标羊抗兔(或羊抗鼠)抗体，室温作用30min，洗涤三次，加 50 μ 1显色剂A液和50 μ 1显色剂B液，室温避光作用lOmin，每孔加入50 μ 1终止液终止 反应，酶标仪检测A值(450nm)。同时设置阴性对照孔和平行重复孔，取OD值为1. 7左右 时对应的包被抗原和抗体浓度组合做抑制曲线，选取最佳曲线的浓度组合。试验数据列于 表_3。 表-3
包被浓度 ug/mi 100 10 10.5 0.25 0.125 空白
抗体浓度_
1:1000 3.283 3.016 2.721 2.425 1.813 0.76 0.055
1:2000 3.06 3.052 2.563 2.137 1.517 0.51 0.056- 取包被浓度分别为lyg/mLO. 5μβ/πι1，0. 25μβ/πι1对应的抗体稀释度为 1 6000，1 4000，1 2000 做抑制曲线，抑制浓度分别为(^8/1、148/1、3 48/1、9口8/ L、27y g/L、81y g/L，得抑制曲线如附图1。其中，系列1是1 μ g/ml-1 6000组合，系列2 是 0. 5yg/ml-l 4000 组合，系列 3 是 0. 25 μ g/ml-1 2000 组合。结果表明系列1，SP 1 μ g/ml—1 6000组合所得的曲线为最佳曲线。实施例3甲苯胺红间接竞争酶联免疫试剂盒的组建组建检测甲苯胺红的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分(1)包被甲苯胺红抗原的酶标板；(2)抗甲苯胺红单克隆或多克隆抗体工作液；(3)用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠抗体；(4)甲苯胺红标准品溶液6瓶，浓度分别为:0yg/LUyg/L,3yg/L,9yg/L, 27μ g/L、81y g/L ；(5)底物显色液A液为过氧化脲或过氧化氢，底物显色液B液为四甲基联苯胺或邻
苯二胺；(6)浓缩洗涤液为含0. 5 %吐温20的10倍磷酸盐缓冲液；(7)浓缩样品稀释液为0. 吐温-20的10倍磷酸盐缓冲液；(8)终止液为2mol/L的硫酸溶液。实施例4试剂盒精密度试验例为标准可重复性试验。具体操作为从每批实施例2或3中的方法制备的酶标板中，各抽取10个孔，测定9 μ g/L的标 准溶液的吸光度值(OD)，重复3次，计算变异系数CV%。结果表明变异系数范围在1. 5-7. 5%之间，说明本试剂盒标准品精密度达到了要 求。实施例5试剂盒的回收率试验取两个浓度的甲苯胺红标样，对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分 别计算回收率。结果表明饲料中的添加回收率为60% -75%。实施例6试剂盒保存期试验试剂盒保存条件为2_8°C，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零添加)、 50%抑制浓度、甲苯胺红添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会 有非正常保存条件出现，将试剂盒在37°C保存条件下放置两周，进行加速老化实验，结果表 明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入_20°C冰箱 冷冻5天，测定结果表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8°C 保存12个月以上。实施例7样品中甲苯胺红残留的检测1、样品前处理准确称取5g辣椒酱样品于40ml离心管中。加入20mlDMS0，充分振荡10分钟， 4000rpm 离心 lOmin，取上清 5ml。2、用试剂盒进行检测向甲苯胺红-OVA偶联物包被的酶标板微孔中加系列标准品或样品溶液100 μ 1， 再加入抗体工作液50μ 1，室温反应1小时。倒出孔中液体，每孔加入250μ 1经10倍稀释了 的洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板4次，在吸水纸上拍干。每孔加入酶 标记羊抗兔(或酶标羊抗鼠)抗体ΙΟΟμ 1，避光室温孵育30min。倒出孔中液体，每孔加入 250 μ 1经10倍稀释了的洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板4次，在吸水 纸上拍干。加入底物显色液A液50 μ 1，B液50 μ 1，轻轻振荡混勻，室温避光显色lOmin，每 孔加入终止液(2mol/L盐酸)50μ1，轻轻振荡混勻，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD值)。结果分析计算百分吸光度值并绘制标准曲线，相对应每一个样品中甲苯胺红的浓度可以从 标准曲线上读出，也可以用回归方程法计算出在样本中甲苯胺红的含量。利用专业电脑软 件更便于大量的样本的快速分析。根据酶标板上的样本颜色的深浅与系列浓度标准溶液颜 色的比较，可以判断出样本中甲苯胺红的浓度范围。
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权利要求
一种检测甲苯胺红的酶联免疫试剂盒，其中包括甲苯胺红特异性抗体、甲苯胺红 载体蛋白偶联物和酶标二抗。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括包被有甲 苯胺红抗原的酶标板、甲苯胺红标准溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液和浓缩样品稀释液。
3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述甲苯胺红特异性抗 体为单克隆抗体或多克隆抗体。
4.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的载体蛋白为牛血 清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或钥孔铜兰蛋白(KLH)。
5.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的酶标二抗的标记 用酶为辣根过氧化物酶。
6.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的酶标二抗为羊抗 兔IgG抗体或羊抗鼠IgG抗体。
7.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的洗涤液为含有 0. 05% -0. 5%吐温-20磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的底物显色剂由显色剂A 和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺。
9.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的浓缩样品稀释液为含 0. 吐温-20的磷酸盐缓冲液。
10.一种检测样品中甲苯胺红含量的方法，包括步骤(1)样品前处理；(2)用权利要求1-9任一所述的试剂盒进行检测，向包被有甲苯胺红抗原的酶标板孔 中加入标准品或样品溶液，再加入抗甲苯胺红多克隆抗体或单克隆抗体工作溶液，孵育后 洗涤拍干，加入酶标记二抗(羊抗兔或羊抗鼠)，孵育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测 定吸光度值；(3)分析检测结果。全文摘要
本发明属于生物检测领域。本发明公开了一种检测甲苯胺红的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的甲苯胺红的酶联免疫试剂盒包括甲苯胺红特异性单克隆或多克隆抗体、甲苯胺红与载体蛋白的偶联物、酶标二抗。本发明的检测甲苯胺红酶联免疫试剂盒灵敏、快速、准确，主要用于大批样品的筛查；盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特异性、高灵敏性、高精确性、高准确性等特点，可快速检测食品中残留的对位红。
文档编号G01N33/543GK101915843SQ201010240040
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月29日 优先权日2010年7月29日
发明者于洪侠, 张妍, 张薇薇, 杨曙明, 程玛丽, 邱静, 陈刚, 陈爱亮 申请人:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所