专利名称：在抗体微阵列系统中识别异嗜性抗体干扰的方法及应用其检测目标抗原的抗体微阵列芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及在抗体微阵列系统中识别异嗜性抗体干扰的方法及应用其检测目标 抗原的抗体微阵列芯片。
背景技术：
分析病人血清中的多种蛋白质从而指导诊断、治疗和预后，促进了蛋白质并行分 析方法的发展(Expert Rev Mol Diag 2007 ；7 =87-98.) 0这种多种蛋白并行分析的方法称 为蛋白质芯片，蛋白质微阵列芯片等。目前的多指标分析方法主要是基于传统的免疫学原 理，将抗原或抗体以阵列的形式固定在固相表面，与血清中的相应的靶物质特异性的结合， 并与标记的抗体相结合，标志物能够被蛋白质芯片阅读仪拍摄或扫描，计算机软件对扫描 或拍摄的结果进行分析，得出各种蛋白质的分析结果。多指标分析的方法可以用于早期诊 断、鉴别诊断、疾病分期以及预后(Clin chem_56 :2，186，2010)。到目前为止主要应用的是 抗体微阵列芯片技术。除了蛋白质芯片本身遇到的新的技术挑战，传统的免疫学方法所遭 遇的很多技术问题，也必将在蛋白质芯片中体现，如异嗜性抗体的干扰。异嗜性抗体存在于血清中，能够与动物来源的免疫球蛋白结合，从而干扰基于双 抗体夹心法的免疫学检测(Clin chem. 34/1，27-33，1988)。在血清中如果不存在被检测的 特异性抗原，而存在这种能够结合动物(尤其是小鼠)免疫球蛋白的抗体，就会导致假阳性 的结果(Lancet 1980 ；ii :1136，clin chem. 1986 ；32 :476，1986 ；32 :1491，1987 ；33 414)。目前临床实验室和诊断试剂生产厂商普遍采取了好多措施来警示这种异嗜性抗 体的存在，并采用相应的封闭方法。这些方法包括1)采用其他的方法作对照，是否出现结 果的差异(Clin chem. 2000 ；46 :1037，clin chem. ；1999 ；45 :942，Ann clin bio 1999 ； 36:704-21) ；2)对血清样品进行系列稀释，看信号是否呈现线形(clin chem. ； 1999 ；45 942, Ann clin bio 1999;36:704-21) ；3)用特殊的试剂筛选血清中是否存在抗小鼠的抗 体(clin chem. ；1999 ;45 :942，)，或者用封闭试剂对样品进行预处理(clin chem. 2001 47 1332,clin chem. 1998 44 1942)。但是以上各种方法不能完全消除异嗜性抗体的影响。如 果要对每一分血清进行筛选和封闭，存在工作量翻备，试剂成本提高的问题。并且由于异嗜 性抗体干扰的多样化，以及各种产品所使用的抗体不同，目前尚未有一种方法可以有效的 消除所有的异嗜性抗体的干扰。在抗体微阵列系统中，一个产品中通常含有十几到二十几对单克隆抗体。被异嗜 性抗体干扰的几率要比普通的免疫学检测产品要高的多。对每个抗体进行人源化改造是不 可行的。对每一份血清在检测前进行预处理工作量会很大，如PEG处理。根据我们通常的 经验是在每一份血清中添加阻断剂如HBR或mac33，大部分的样品中的干扰会被消除，但是 剩余的一些顽固的样品中的干扰就很难判断是异嗜性抗体干扰还是指标的真阳性，对于一 个肿瘤这种致死的疾病来说，肿瘤指标的假阳性所造成的负担应该尽可能的避免。因此需 要建立一种对异嗜性抗体识别的有效机制，尽可能的减少假阳性的产生。
发明内容
本发明的一个目的在于克服上述现有的方法不能完全消除异嗜性抗体的影响或 不能有效识别异嗜性抗体的缺陷，提供在抗体微阵列系统中识别异嗜性抗体干扰的方法。在抗体微阵列系统中识别异嗜性抗体干扰的方法，包括以下步骤(1)根据检测疾病的类型制备的抗体微阵列芯片的预定组成，对所有需要固相化 的抗体进行免疫球蛋白的型和亚型的鉴定；(2)根据步骤(1)的鉴定的所有抗体的型和亚型的种类，选择所有抗体的型和亚 型的种类相同的多种与固相化抗体、被检测的抗原、酶标抗体不发生交叉反应的单克隆抗 体进行组合得到混合物(mixture monoclonal antibodies，简称MMAB)；(3)在抗体微阵列芯片的制备过程中，在每一个检测阵列内均设置增加一个用于 对照控制的识别异嗜性抗体干扰的识别点，所述识别点中的点样样品为步骤(2)的混合 物；(4)取步骤(3)制作完成的抗体微阵列芯片检测系统(包括标准品和酶标二抗，以 及相关各种试剂)检测若干份血清。将每一份血清分成两份，在其中的一份血清中添加所 述步骤(2)的混合物，另一份血清中不添加所述步骤(2)的混合物，对所述血清采用生物芯 片阅读仪进行检测，当有血清在添加所述步骤(2)的混合物后出现阳性指标转阴的结果则 该样品判断为异嗜性抗体干扰阳性，去除异嗜性抗体阳性干扰的血清，对剩余血清的识别 点进行读数，根据检测结果取单侧99%可信限的读数为判断血清是否存在异嗜性抗体干扰 的标准临界值；(5)采用步骤⑷的标准临界值判断检测临床样品，当临床样品的识别点读数高 于所述标准临界值，则该血清被判断为异嗜性抗体干扰阳性。优选地，所述步骤(1)中的所 使用的固相化抗体均为单克隆抗体。优选地，所述步骤(2)中的不相关单克隆抗体的品种数量为1种以上，优选为10 种以上。优选地，所述步骤(3)中在识别点中各种单克隆抗体样品为等量混合。优选地，所述步骤(4)中的在其中一份血清中添加所述步骤(2)的单克隆抗体混 合物的量为按体积比5% (ν/ν) 0本发明的另一个目的在于提供一种采用上述方法检测目标抗原的抗体微阵列芯 片，所述抗体微阵列中含有识别异嗜性抗体的识别点。抗体微阵列系统的优势就是信息量大，指标之间能够互相参考。本发明提供了一 种完全不同于传统免疫学检测方法里消除异嗜性抗体干扰的方法，可以有效、低成本、简单 的对异嗜性抗体进行识别，然后进行阻断。本发明的异嗜性抗体识别点的抗体是由各种指 标的固相抗体的相似物组成，类似于质量控制点。通过对具有统计学意义数量的样品进行 检测后建立异嗜性抗体阳性干扰的判断标准，根据该标准判断以后的针对同种指标的临床 样品是否存在异嗜性抗体阳性干扰。与现有技术相比，本发明所述在抗体微阵列系统中识 别异嗜性抗体干扰的方法，是在不增加现有的工作量和试剂的情况下，对异嗜性抗体进行 识别；不需要对每一份样品都添加异嗜性抗体阻断剂，与各种阻断剂相比，对已经识别的少 量干扰阳性样品添加的所述多种不相关单克隆抗体的费用非常低，因此可以降低成本并减少未知的干扰；同时可以通过生物芯片阅读仪自动识别，客观判断，而不需要对病人的临 床症状进行分析。
图1为实施例的抗体点样方阵示意图。图2显示了各种异嗜性抗体干扰阳性样品的不同表现形式的检测图示。图3显示了干扰阳性样品在加了 MMAB阻断剂以后出现各个指标从假阳性恢复为 阴性的对照图像。 图4为实施例的400份血清样品中每份样品的MMAB点的读数分布图。图5显示了实施例的第657号健康体检血清在不添加阻断剂、添加(V/V)阻断 剂、添加5% (V/V)阻断剂的检测结果。图6显示了实施例的P24号血清样品在添加MMAB阻断剂前后的检测结果对照。
具体实施例方式基本原理1、双抗体夹心法原理将特异性抗体包被于固相载体上，形成固相抗体；加入含待测抗原的样品，使之与 固相抗体结合；再加入酶标记的另一特异性抗体，使酶标抗体与固相免疫复合物中的抗原 结合；最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。2、抗体微阵列检测原理抗体微阵列技术基于抗原和抗体专一性结合的原理，将多种抗体结合在固相基质 (如特殊处理的玻片、有机膜片、硅微球等)上，检测生物样品中可与之专一性结合的对应 抗原。抗体微阵列具备微型化，集成化，高通量化的优势。3、MMAB抗体识别异嗜性抗体干扰的原理病人血清/血浆中的内源性异嗜性抗体，可结合其他种属的免疫球蛋白，包括作 为免疫分析试剂的抗体来源种属。这些抗体会干扰免疫分析系统，造成比实际分析物浓度 更高的检测值，因此有误判样本的可能。虽然异嗜性抗体可以影响各种检测，但主要作用于 夹心法免疫分析系统。夹心法免疫检测至少使用两种针对不同表位抗原的抗体，捕获抗体 在固相，标记抗体游离在溶液中。正常情况下，样本中的抗原与两抗体结合，标记抗体与固 相结合的数量与样本中的抗原浓度成正比。异嗜性抗体在无抗原的情况下，也可以桥连这 两种抗体，因而增加结合标记抗体的浓度(图2)，造成假阳性结果。我们选择的作为识别点的非相关抗体与固化抗体型和亚型相同，除了抗原结合位 点的氨基酸序列不同以外，绝大部分的分子结构相似或相同。异嗜性抗体在于固化抗体结 合的同时，也能够与这些不相关抗体结合，造成这些同时出现阳性。这样，在检测样品时，如 果样品中存在特异性的抗原，只会与特异性的抗体结合，不会出现异嗜性抗体干扰识别点 的强信号，那么其阳性是真实的，如果样品中存在异嗜性抗体的干扰，不但出现特异性的信 号增强，也会出现异嗜性抗体干扰识别点的强信号，那么该指标的阳性结果应该引起怀疑。单克隆抗体制备过程1、抗原免疫小鼠。
2、取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。3、筛选所需要的融合单克隆细胞，建立细胞库。4、提取单克隆细胞分泌的抗体，获得所需的单克隆抗体。更详细的步骤参照甑永苏、邵荣光编著的《抗体工程药物》(化学工业出版社， 2002)单克隆抗体型和亚型检测方法将待测样本同时加在9个测试孔中筛选和确定单克隆抗体/小鼠抗体的亚型。检 测步骤如下1.包被抗体。50 μ 1/孔，在4°C冰箱内过夜或者在室温下温育2hr。然后37°C下 封闭液封闭2hr，125 μ 1/孔。最后洗板，125 μ 1/次，每次洗4遍。2.上待测抗体样品(50 μ 1/孔)，同时加9个孔，最后第10个孔加阳性质控(单 克隆鼠抗IgGl)，在37°C下温育lhr。洗板，125 μ 1/次，每次洗4遍。3.在前面9各孔分别依次加入各种亚型抗体正常兔血清(阴性质控)、鼠抗 IgGl、鼠抗 IgG2a、鼠抗 IgG2b、鼠抗 IgG3、鼠抗 IgA、鼠抗 IgM、鼠抗 Kappa Light Chain、鼠 抗Lambda Light Chain—共九种检测亚型抗体，最后再加入鼠抗IgGl到阳性质控孔中。同 样在37°C下温育lhr。洗板，125 μ 1/次，每次洗4遍。4.将配置好的酶标二抗羊抗兔抗体IgG均分别加入到10个孔中，50μ 1/孔，37°C 下温育lhr。然后洗板，125 μ 1/次，每次洗4遍。5.加入发光液，等待30min反应后通过酶标仪在405处读数，读数时要保证阳性对 照的值处在0.8 1.2之间。标记抗体制作过程抗体标记的方式根据产品设计的需要，可以是酶标记、荧光标记、金标标记等。其 标记方法也根据不同的标记原理进行。抗体微阵列制作过程采用全自动的微量高密度点样系统，将第一抗体按照一定的秩序排列在固相基质 上，抗体与基质的结合方式根据基质以及表面特征的不同，可以是静电吸附也可以是化学 偶联。在点样后经过装配、封闭、干燥等处理，包装成成品。为了保证反应的通量，以及被检 测样品与标准的抗原在同一反应条件下进行，要求有一种反应的模块，能同时装有几十张 已经点制有相同的蛋白质阵列的基质。而且这几十个抗体阵列在整个反应过程中都形成一 个独立的反应体系，不相互影响，不相互渗漏。混合校准品制作过程抗体微阵列检测系统所使用的校准品是将多种被检测物质的抗原稀释于冻干缓 冲体系中，根据每个指标抗原原料的浓度和校准品中该指标所需要的浓度，计算得出抗原 原料的加入量，最后进行冻干。采用冻干标准品的工艺是为了标准品的稳定保存和运输方 便。冻干后的校准品会按照严格的溯源过程为其各指标的浓度赋值。交叉反应试验方法为了避免用于判断样品是否被异嗜性抗体干扰的MMAB点与抗体微阵列中其他指 标之间存在交叉反应，我们在从自有杂交瘤细胞库随机选择单抗进行混合前即对每一个被 选择的单抗进行交叉反应的验证，只有不发生交叉反应的单抗才被选择用于混合。
验证是否存在交叉反应的实验我们是这样进行的，首先按照抗体微阵列的制备方 案将待选择的单抗点于基质上，然后分别加入各种酶标抗体以及按照抗体微阵列系统检测 生物样品的过程加入校准品和酶标抗体，只有在这两种情况下都不发生交叉反应的时候， 该抗体才会被挑选用于混合MMAB。抗体微阵列检测系统组成整个抗体微阵列检测系统由如下部分组成抗体微阵列模块、系列浓度校准品、复 溶剂、反应液(示踪剂标记的抗体混合液)、浓缩洗液等。其他的实际根据检测系统的原理 实际的需要。抗体微阵列系统检测生物样品的过程样品检测过程分成5个环节1、第一抗体(抗体微阵列)与生物样品主要是血清进行反应，特异性的捕获样品 中的抗原。2、已经结合第一抗体的抗原与示踪抗体进行特异性的结合。3、以上两个步骤之间都需要通过洗涤方法，将没有结合的其他成分清洗掉。4、采用特殊的阅读仪采集生物信号，可以是拍摄成像、或者是扫描成像。5、数据处理。首先制作各种指标的标准曲线，再阅读被检样品的读数，根据标准曲 线获得样品各种指标的浓度。异嗜性抗体干扰判断方法的建立采用上述抗体微阵列芯片的检测步骤和方法检测400份血清样品，每一份分成两 份，其中一份加入5% (V/V)作为识别点的点样样品MMAB，另一份不添加MMAB，添加的和未 添加的同时检测读数。我们对异嗜性抗体干扰阳性进行了定义。如果一份血清样品在添加 MMAB前后出现某个指标或某一群指标的检测结果的显著差异，就表示这份血清存在异嗜性 抗体的干扰。其中结果差异定义为指标检测结果跟参考值相比，存在阳性和阴性的差异。如 果没有出现这种情况，我们就认为该份血清中没有异嗜性抗体干扰，或干扰极弱，不至于影 响检测结果。对剩余血清的识别点进行读数，根据检测结果取单侧99%可信限的读数为判 断血清是否存在异嗜性抗体干扰的标准临界值。
实施例检测11种肿瘤标志物的抗体微阵列检测系统1、主要原材料11种肿瘤标志物的抗体和抗原的来源如表1所示表1 11种肿瘤标志物的抗体和抗原的来源
权利要求
在抗体微阵列系统中识别异嗜性抗体干扰的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)根据需检测疾病的类型制备的抗体微阵列芯片的预定组成，对所有需要固相化的抗体进行免疫球蛋白的型和亚型的鉴定；(2)根据步骤(1)的鉴定的所有抗体的型和亚型的种类，选择与所有抗体的型和亚型的种类相同的多种与固相化抗体、被检测抗原、酶标抗体不交叉反应的单克隆抗体进行组合，得到混合物；(3)在抗体微阵列芯片的制备过程中，在每一个检测阵列内均设置增加一个用于对照控制的识别异嗜性抗体干扰的识别点，所述识别点中的点样样品为步骤(2)的混合物；(4)取步骤(3)制作完成的抗体微阵列芯片检测系统检测若干份血清，将每一份血清分成两份，在其中的一份血清中添加所述步骤(2)的混合物，另一份血清中不添加所述步骤(2)的混合物，对所述血清进行免疫学检测，当有血清在添加所述步骤(2)的混合物后出现阳性指标转阴的结果则该样品判断为异嗜性抗体干扰阳性，去除异嗜性抗体阳性干扰的血清，对剩余血清的识别点进行读数，根据检测结果取单侧99％可信限的读数为判断血清是否存在异嗜性抗体干扰的标准临界值；(5)采用步骤(4)的标准临界值判断检测临床样品，当临床样品的识别点读数高于所述标准临界值，则该血清被判断为异嗜性抗体干扰阳性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的所使用的固相化抗体均 为单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的用作异嗜性抗体干扰指 示剂的单克隆抗体的品种数量为1种以上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的用作异嗜性抗体干扰指 示剂的单克隆抗体的品种数量为10种以上。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中在识别点中各种单克隆抗 体样品为等量混合。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的在其中一份血清中添加 所述步骤(2)的单克隆抗体混合物的量为按体积比5% (ν/ν) 0
7.采用权利要求1所述方法检测目标抗原的抗体微阵列芯片，其特征在于，所述抗体 微阵列中含有识别异嗜性抗体的识别点。
全文摘要
本发明提供在抗体微阵列系统中识别异嗜性抗体干扰的方法，主要是在制作抗体微阵列芯片时，增加异嗜性抗体识别点。这个识别点的抗体是由各种指标的固相抗体的相似物组成。通过对具有统计学意义数量的样品进行检测后建立异嗜性抗体阳性干扰的判断标准，根据该标准判断以后的针对同种指标的临床样品是否存在异嗜性抗体阳性干扰。该方法是在不增加现有的工作量和试剂的情况下，对异嗜性抗体进行识别；不需要对每一份样品都添加阻断剂，节省了很多的阻断剂的用量，因此可以降低成本并减少未知的干扰；同时可以通过生物芯片阅读仪自动识别，客观判断，而不需要对病人的临床症状进行分析。
文档编号G01N33/577GK101963618SQ201010270098
公开日2011年2月2日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者季海鹏, 杨小丽, 林晓琳 申请人:上海铭源数康生物芯片有限公司