专利名称：一种表面等离子体子共振传感元件及其制作方法
技术领域：
本发明属用于生物体系检测的传感器技术领域，特别涉及基于磁纳米粒子修饰的 表面等离子体子共振传感器的制备及应用。
背景技术：
表面等离子体子共振(Surface plasmon resonance, SPR)是一种物理光学现象。 利用光在两相界面处发生全内反射时的消失波，引发金属表面的自由电子产生表面等离子 体子。在某一合适波长或者入射角时，表面等离子体子与消失波的频率相等，二者将发生 共振，入射光被吸收，使反射光能量急剧下降，从而在反射光谱上出现共振峰。当金属薄膜 表面的介质折射率不同时，共振峰位置将不同。由于sra技术具有直接、实时监测、无需标 记和快速的特点，使它成为研究生物分子的有利工具。sra传感器已广泛应用于抗体抗原， 蛋白药物，DNA等生物体系的测定中。在传感器的光学传感元件表面，修饰一层生物识别分 子，使其特异地与某种生物组分相互作用，同时产生可被检测的响应信号，这是生物传感器 的检测原理。生物识别分子的固定技术在SI^R生物传感器的发展中是极其重要的，最常用 的是利用巯基化合物，连接金属膜和生物分子。这种方式形成的敏感膜稳定有序，但是成膜 时间长，灵敏度低，且固定的生物分子容易失活。现有的波长检测型sra传感器，主要由光源、导光系统、传感元件、流通池、分光检 测系统和数据处理系统组成。其中，传感元件是传感器的重要部分，具体结构是在玻璃棱镜 的底表面上镀有铬膜(约2nm厚)和金膜(约50nm厚)，作为传感元件的金属膜，再在此金 属膜上制作有敏感膜；所说的敏感膜由羧基端酰化的3-巯基丙酸(MPA)膜和兔抗人免疫球 蛋白(兔抗人IgG)膜构成。MPA修饰的敏感膜的制备过程一般是采用真空镀膜的方法，在棱镜底表面镀2nm 铬膜和50nm金膜。用二次蒸馏水清洗玻璃棱镜，并向流通池中注入磷酸盐缓冲液(PBS)， 待共振波长稳定后注入IOmmol L—1的3-巯基丙酸(MPA) ImL,充分反应6小时，这时MPA可 以在金膜上形成稳定的单分子膜。用PBS缓冲液反复冲洗，然后注入30mg mL—1的1-乙 基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合溶液 ImL反应20分钟，目的是使MPA羧基端酰化，以利于抗体的连接。用PBS清洗至波长稳定， 注入IOOyg mL—1的羊抗兔免疫球蛋白(IgG) ImL充分反应12小时，使其通过氨基偶联反应 在MPA膜上形成稳定的兔抗人IgG膜。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，为简化抗体的固定过程，设计一种新型的用于表面 等离子体子共振传感器的传感元件，用醛基修饰的磁纳米粒子固定于金膜的表面作为敏感 膜，这样就简化了抗体的固定过程，此类传感器具有良好稳定性、生物相容性、较高灵敏度， 且成膜时间短制作效率高。本发明所说的磁纳米粒子修饰的sra敏感膜，是指利用磁铁的作用，将磁纳米粒子吸附到金基底膜上，用于制备表面等离子体子共振传感器的传感元件。本发明的具体技术方案是一种表面等离子体子共振传感元件，结构是在玻璃棱镜的底表面上顺次镀有铬膜 和金膜作为传感元件的金属膜，再在金属膜上制作有敏感膜；其特征在于，所述的敏感膜由 表面醛基化的磁纳米粒子和通过共价键与醛基相连的抗体构成；在玻璃棱镜的下面装有磁 铁。所述的磁纳米粒子是四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的核壳型纳米粒子或银包覆 的四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的核壳型纳米粒子，也可以用Fe304/Si02磁纳米粒子或 Fe304/Ag/Si02磁纳米粒子表示这两种核壳型纳米粒子。所述的抗体是羊抗兔免疫球蛋白 (IgG)、碱性成纤维细胞生长因子抗体、B因子抗体、牛心肌肌钙蛋白单克隆抗体或破伤风毒 素抗体。前述的醛基化的磁纳米粒子，是对现有的方法进行改进制备出的醛基化的Fe3O4/ SiO2磁纳米粒子或Fe304/Ag/Si02磁纳米粒子。本发明的基于磁纳米粒子的表面等离子体子共振传感元件的制作方法，有金属膜 的制备、Fe3O4磁纳米粒子的制备、氨基化的SiO2包覆的磁纳米粒子的制备、表面醛基化磁 纳米粒子的制备和敏感膜的制备过程；所述的金属膜的制备，是采用通常的真空镀膜的方法，在玻璃棱镜的底表面顺次 镀铬膜和金膜作为金属膜。或将顺次镀铬膜和金膜的玻璃片粘接在玻璃棱镜的底表面上作 为金属膜。所述的Fe3O4磁纳米粒子的制备过程是取2. 6g FeCl3 · 6H20，1. Og FeCl2 · 4H20 和0. 425mL HCl (12mol Γ1)溶解于15mL去离子水中；将125mL浓度为1. 5molL_1的NaOH溶 液加入三颈瓶，在氮气保护80°C的条件下，将混合溶液逐滴加入三颈瓶，同时搅拌回流3小 时；通过磁铁作用，分离出Fe3O4粒子，用去离子水洗涤，将沉淀物分散到IOOmL去离子水中， 得到Fe3O4磁纳米粒子溶液；所述的氨基化的SiO2包覆的磁纳米粒子制备过程有两种①取0. 724mL Fe3O4磁纳米粒子溶液加入到24mL水中，之后加入80mL异丙醇、 20mL曲拉通X-100 (Triton X-100)、2mL氨水，再加入120 μ L正硅酸四乙酯(TEOS)和30 μ L 3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，在室温下搅拌反应3小时；用磁铁分离出磁纳米粒子， 并用乙醇和水交替洗涤，制备出的氨基化的Fe3O4为核SiO2为壳的核壳型磁纳米粒子；②取0. 4mL Fe3O4磁纳米粒子溶液于三颈烧瓶中，在搅拌下加入5. 6mL曲拉通 X-100、5. 6mL正己醇禾口 37. 5mL环己烷，再加入ImL浓度为0. IOmol Γ1的AgNO3,反应30分 钟后加入ImL浓度为0. 20mol L—1的NaBH4，室温下搅拌4小时；之后加入过量丙酮，得到黑 色的银包覆的四氧化三铁纳米粒子沉淀，再通过磁铁作用将其分离出来，用乙醇和去离子 水交替洗涤，再超声分散于20mL去离子水中得到银包覆的四氧化三铁纳米粒子溶液；在搅 拌下向银包覆的四氧化三铁纳米粒子溶液中加入0. 0145g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)， 再依次加入5mL乙醇和100 μ L正硅酸四乙酯，室温下搅拌3小时；通过磁铁分离出银包覆 的四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的核壳型磁纳米粒子，并分散于30mL乙醇中，加入ImL氨 水和IOOyL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，室温下搅拌反应5小时，通过磁铁作用将 得到磁纳米粒子分离出来，并用乙醇和水交替洗涤，得到氨基化的银包覆的Fe3O4为核SiO2为壳的核壳型磁纳米粒子；所述的表面醛基化磁纳米粒子的制备是将制备出的氨基化的Fe3O4为核SiO2为 壳的核壳型磁纳米粒子或氨基化的银包覆Fe3O4为核SiO2为壳的核壳型磁纳米粒子转入 20mL水中，加入戊二醛，使水溶液中的戊二醛体积百分数为1.25%，并在室温下搅拌1小 时，用磁铁将磁纳米粒子从溶液中分离出来并水洗，再超声分散于20mL水中于4°C保存，分 别得到两种表面醛基化磁纳米粒子溶液；所述的敏感膜的制备，是将玻璃棱镜有金属膜的底面向上放置，将流通池固定于 玻璃棱镜的上方，将磁铁固定于玻璃棱镜的下方；向流通池中注入去离子水，然后注入磷酸 盐缓冲溶液至共振波长稳定；再将ImL表面醛基化的Fe3O4为核SiO2为壳的核壳型磁纳米 粒子或表面醛基化的银包覆Fe3O4为核SiO2为壳的核壳型磁纳米粒子溶液注入到流通池 中，由于磁铁的作用，醛基化的磁纳米粒子被固定在金膜表面；最后向流通池中注入抗体， 抗体通过共价键与醛基相连，制备出基于磁纳米粒子的敏感膜。上述的磷酸盐缓冲液，简称PBS，PH = 7. 4;可以用0.05g氯化钾、2. Og氯化钠、 0. 06g磷酸二氢钾、0. 91g磷酸氢二钠和250ml 二次蒸馏水的比例配制。上述的抗体可以是 兔抗人免疫球蛋白(IgG)、碱性成纤维细胞生长因子抗体、B因子抗体、牛心肌肌钙蛋白单 克隆抗体、破伤风毒素抗体等。通过对本发明两种基于磁纳米粒子的传感器的测量数据可以看出(测量数据参 见图2)，基于磁纳米粒子的传感膜在制备时间，生物相容性和灵敏度上有着极大优势。主 要表现为第一制作简单，在传统的sra方法中，抗体在固定于金膜之前需要对金膜进行 修饰，通常要在金膜表面自组装一层单分子膜，抗体固定于金膜之上需要很多试剂。然而， 本实验中我们将磁铁放置于棱镜的下方，由于磁铁的作用，磁粒子被吸附到金膜上，之后抗 体通过与磁纳米粒子上的活化基团反应固定于金膜上，这样简化了抗体的固定步骤。第二 生物相容性好，SiO2包裹的磁纳米粒子具有比较大的比表面积，与传统的在金膜表面自组 装一层单分子膜相比，生物相容性增强，更有利于抗体的固定，是理想的固定生物分子的载 体，从而用来检测生物分子之间的相互作用。第三灵敏度高，Ag纳米粒子可以放大sra传 感器的信号。Fe304/Ag/Si02纳米粒子不仅具有磁纳米粒子的磁性，还具有Ag纳米粒子的高 灵敏度，同时还具有SiO2纳米粒子的生物相容性。醛基化的Fe304/Ag/Si02磁纳米粒子可以 使抗体固定于金膜表面。因此Fe304/Ag/Si02磁纳米粒子可以很好地与生物分子连接，从而 提高传感器地灵敏度。本发明的基于磁纳米粒子的表面等离子体子共振传感器的应用范围广泛，可以应 用于所有的抗体抗原检测，还可以应用于蛋白和药物的测定如血清白蛋白与抗生素类药 物，血清白蛋白与蒽醌类药物等。
图1是本发明传感元件抗体固定于磁纳米粒子表面的结构示意图。图1中，1为玻 璃棱镜，2为金属膜，金属膜2由镀在玻璃棱镜1底面的铬膜和铬膜之上的金膜构成，3为磁 铁，4为磁纳米粒子，用 表示，5为抗体，用Y表示。图2是本发明的共振波长位移与兔IgG浓度的关系曲线。图2中，a是基于Fe3O4/ SiO2磁纳米粒子的传感元件；b是基于Fe304/Ag/Si02磁纳米粒子的传感元件。
图3是本发明的Fe3O4磁纳米粒子的电镜图。图4是本发明的Fe3CVSiO2磁纳米粒子的电镜图。图5是本发明的Fe304/Ag/Si02磁纳米粒子的电镜图。图6是本发明的磁纳米粒子的红外光谱图。其中，a为Fe3O4磁纳米粒子的红外光 谱图，b为Fe3CVSiO2磁纳米粒子的红外光谱图，c为Fe304/Ag/Si02磁纳米粒子的红外光谱 图。图7是本发明的磁纳米粒子的紫外可见光谱图。其中，a为Fe3O4磁纳米粒子的紫 外可见光谱图，b为Fe3O4Ag磁纳米粒子的紫外可见光谱图，c为Fe304/Ag/Si02磁纳米粒子 的紫外可见光谱图。图8是100 μ g ml—1的羊抗兔IgG在固定了磁纳米粒子的传感元件表面的动力学 吸附曲线。其中，a为基于Fe304/Si02磁纳米粒子传感元件表面的动力学吸附曲线，b为基 于Fe304/Ag/Si02磁纳米粒子传感元件表面的动力学吸附曲线。
具体实施例方式实施例1本发明的表面醛基化的磁纳米粒子的制备。表面醛基化的Fe304/Si02磁纳米粒子具体制备过程是取2. 6g FeCl3,6H20,1. Og FeCl2 · 4H20和0. 425mL HCl (12mol L-1)充分溶解于15mL去离子水中，并转移至滴液漏斗 中。将125mL浓度1. 5mol L—1的NaOH溶液加入三颈瓶中，在80°C的条件下，打开滴液漏斗， 将混合溶液逐滴加入，同时充分搅拌，回流3h。整个过程均需氮气保护。反应完毕后，通过 磁铁作用，分离出Fe3O4粒子，用去离子水充分洗涤四次。将沉淀物分散到IOOmL去离子水 中，得到Fe3O4磁纳米粒子溶液。取0. 724mL Fe3O4磁纳米粒子溶液加入到24mL水中，之后 加入80mL异丙醇，20mL曲拉通X-100 (Triton X-100)，2mL氨水，再加入120 μ L正硅酸四乙 酯(TEOS)和30 μ L 3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)后在室温下搅拌3h。反应结束后 用磁铁分离出磁纳米粒子，并用大量的乙醇和水交替洗涤。将制备出的氨基化的磁纳米粒 子转入20mL水中，加入戊二醛，使水溶液中的戊二醛体积百分数为1. 25 %，并在室温下搅 拌lh。待反应完毕，用磁铁将醛基修饰的Fe304/Si02磁纳米粒子从溶液中分离出来并水洗 四次，最后将其超声分散于水中于4°C保存。表面醛基化的Fe304/Si02磁纳米粒子的合成过程可以用下式表示
权利要求
一种表面等离子体子共振传感元件，结构是在玻璃棱镜(1)的底表面上顺次镀有铬膜和金膜作为传感元件的金属膜(2)，再在金属膜上制作有敏感膜；其特征在于，所述的敏感膜由表面醛基化的磁纳米粒子(4)和通过共价键与醛基相连的抗体(5)构成；在玻璃棱镜的下面装有磁铁(3)。
2.按照权利要求1所述的表面等离子体子共振传感器，其特征在于，所述的磁纳米粒 子(4)是四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的核壳型磁纳米粒子或银包覆的四氧化三铁为 核、二氧化硅为壳的核壳型磁纳米粒子；所述的抗体(5)是羊抗兔免疫球蛋白、碱性成纤维 细胞生长因子抗体、B因子抗体、牛心肌肌钙蛋白单克隆抗体或破伤风毒素抗体。
3.—种权利要求1的表面等离子体子共振传感元件的制作方法，有金属膜的制备、 Fe3O4磁纳米粒子的制备、氨基化的SiO2包覆的磁纳米粒子的制备、表面醛基化磁纳米粒子 的制备和敏感膜的制备过程；所述的Fe3O4磁纳米粒子制备过程是取2. 6g FeCl3 ·6Η20，1. Og FeCl2 ·4Η20和0. 425mL 浓度为12mol Γ1的HCl溶解于15mL去离子水中；将125mL浓度为1. 5mol Γ1的NaOH溶 液加入三颈瓶，在氮气保护80°C的条件下，将混合溶液逐滴加入三颈瓶，同时搅拌回流3小 时；通过磁铁作用，分离出Fe3O4粒子，用去离子水洗涤，将沉淀物分散到IOOmL去离子水中， 得到Fe3O4磁纳米粒子溶液；所述的氨基化的SiO2包覆的磁纳米粒子制备过程有两种①取0.724mL Fe3O4磁纳米粒子溶液加入到24mL水中，之后加入80mL异丙醇、20mL曲 拉通X_100、2mL氨水，再加入120 μ L正硅酸四乙酯和30 μ L3-氨基丙基三甲氧基硅烷，在 室温下搅拌反应3小时；用磁铁分离出磁纳米粒子，并用乙醇和水交替洗涤，制备出的氨基 化的Fe3O4为核SiO2为壳的核壳型磁纳米粒子；②取0.4mL Fe3O4磁纳米粒子溶液于三颈烧瓶中，在搅拌下加入5. 6mL曲拉通X-100、 5. 6mL正己醇和37. 5mL环己烷，再加入ImL浓度为0. IOmol L-1的AgNO3,反应30分钟后 加入ImL浓度为0. 20mol L—1的NaBH4，室温下搅拌4小时；之后加入过量丙酮，得到黑色的 银包覆的四氧化三铁纳米粒子沉淀，再通过磁铁作用将其分离出来，用乙醇和去离子水交 替洗涤，再超声分散于20mL去离子水中得到银包覆的四氧化三铁纳米粒子溶液；在搅拌下 向银包覆的四氧化三铁纳米粒子溶液中加入0. 0145g十六烷基三甲基溴化铵，再依次加入 5mL乙醇和100 μ L正硅酸四乙酯，室温下搅拌3小时；通过磁铁分离出银包覆的四氧化三 铁为核、二氧化硅为壳的核壳型磁纳米粒子，并分散于30mL乙醇中，加入ImL氨水和100 μ L 3_氨基丙基三甲氧基硅烷，室温下搅拌反应5小时，通过磁铁作用将得到磁纳米粒子分离 出来，并用乙醇和水交替洗涤，得到氨基化的银包覆的Fe3O4为核SiO2为壳的核壳型磁纳米 粒子；所述的表面醛基化磁纳米粒子的制备是将制备出的氨基化的Fe3O4为核SiO2为壳的 核壳型磁纳米粒子或氨基化的银包覆Fe3O4为核SiO2为壳的核壳型磁纳米粒子转入20mL水 中，加入戊二醛，使水溶液中的戊二醛体积百分数为1. 25%，并在室温下搅拌1小时，用磁 铁将磁纳米粒子从溶液中分离出来并水洗，再超声分散于20mL水中于4°C保存，分别得到 两种表面醛基化磁纳米粒子溶液；所述的敏感膜的制备，是将玻璃棱镜有金属膜的底面向上放置，将流通池固定于玻璃 棱镜的上方，将磁铁固定于玻璃棱镜的下方；向流通池中注入去离子水，然后注入磷酸盐缓冲溶液至共振波长稳定；再将ImL表面醛基化的Fe3O4为核SiO2为壳的核壳型磁纳米粒子 或表面醛基化的银包覆Fe3O4为核SiO2为壳的核壳型磁纳米粒子溶液注入到流通池中，由 于磁铁的作用，醛基化的磁纳米粒子被固定在金膜表面；最后向流通池中注入抗体，抗体通 过共价键与醛基相连，制备出基于磁纳米粒子的敏感膜。
全文摘要
本发明的一种表面等离子体子共振传感元件及其制作方法属用于生物体系检测的传感器技术领域。传感元件的结构是在玻璃棱镜(1)的底表面上顺次镀有铬膜和金膜作为传感元件的金属膜(2)，再在金属膜(2)上制作由表面醛基化的磁纳米粒子(4)和通过共价键与醛基相连的抗体(5)构成的敏感膜；在玻璃棱镜的下面装有磁铁(3)。传感元件的制作有金属膜的制备、Fe3O4磁纳米粒子的制备、氨基化的SiO2包覆的磁纳米粒子的制备、表面醛基化磁纳米粒子的制备和敏感膜的制备过程。本发明制作简单，灵敏度高，生物相容性好，具有良好的选择性；可以应用于所有的抗体抗原检测，还可以应用于蛋白和药物的测定。
文档编号G01N33/553GK101975765SQ20101027133
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者孙颖, 宋大千, 曹彦波, 汪静, 王丽英, 王键 申请人:吉林大学