专利名称：一种电化学发光适配体传感器检测赭曲霉毒素a的方法
技术领域：
本发明涉及利用电化学发光传感器对赭曲霉毒素A进行检测，特点在于赭曲霉毒 素A适配体和异鲁米诺电化学发光标记物的应用、纳米金粒子在电化学发光过程中放大信 号的作用，以及该检测方法的高灵敏度及易操作性，属于电化学发光传感器技术领域。
背景技术：
赭曲霉毒素Akchratoxin A，OTA)在自然界分布广泛，毒性强，对人类和动植物损 害极大。OTA主要存在于谷类、豆类及豆制品、千果、咖啡、葡萄及葡萄酒、香科、油料作物、啤 酒、茶叶等中。毒理学研究表明，赭曲霉毒素A具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性，以及致 畸、致癌和致突变作用等多种毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害。1993年国际癌症 研究机构(The International Agency for Research onCancer, IARC)已将 OTA 列为人类 可能致癌物。鉴于OTA毒性强，对人体健康危害大，世界各国纷纷制定出粮食及饲料中OTA 限量标准。如欧盟规定谷物原料OTA最大限量5 μ g/kg，谷物加工制品最大限量3 μ g/kg， 婴幼儿及有特殊医疗目的食品不超过0. 5 μ g/kg ；我国饲料OTA最大限量100 μ g/kg。目前OTA分析检测方法主要包括薄层层析法(TLC)、高压液相色谱-荧光检测法 (HPLC-FD)、毛细管电泳技术(CE)、高压液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)、酶联免疫吸附法 (Enzyme-linked immunosorbentassay，简称ELISA)、时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)、胶 体金免疫层析分析法(GICA)和放射免疫法(RIA)等。现场快速筛检方法中则以ELISA和 GICA方法应用最多，这两种方法均是基于抗原-抗体亲和反应，以抗体作为识别分子。但抗 体易受外界条件尤其是温度的影响，对保藏条件要求苛刻，在很大程度上限制了方法的灵 活应用。此外，抗体制备需要经过动物实验或细胞实验，繁琐费时，制备的抗体成本高，发展 的方法检测成本也相应偏高。所以有必要发展一种快速方便，稳定性好、灵敏度高、特异性 强、使用成本低的新型检测方法。电化学发光生物传感器则是指由生物材料作为敏感元件，电极作为转换元件， 以光强作为特征检测信号的传感器。生物传感器是指各种生物体成分(酶、抗原、抗体、 激素等)或者生物体本身(细胞、细胞器、组织等)作为敏感元件的传感器。核酸适配 体(aptamer)是通过指数富集配体的系统进化(systematicevolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术筛选而来的。与抗体相比，核酸适配体具有易合成、 易修饰、易固定、可反复使用和长期保存的优点，因而核酸适配体为识别分子构建的生物传 感器在蛋白质研究、药物检测、毒素检测、医学诊断等方面得到广泛应用。本发明把赭曲霉毒素A适配体应用于电化学发光传感器，并在电极表面修饰上可 以增强光信号的纳米金粒子，大大提高了传感器的灵敏度，该传感器以金电极为工作电极， 银电极为参比电极，钼电极为对电极，以过氧化氢(H2O2)与异鲁米诺(ABEI)在碱性条件下 反应的光信号为检测信号，通过对不同浓度赭曲霉毒素A标准品的检测，建立标准曲线，达 到对含赭曲霉毒素A样品进行定量检测的目的。该发明可以用于小麦、谷物，饲料及其制品 中赭曲霉毒素A含量的检测。
本发明与CN 1011699277A ( 一种电化学传感器对微量赭曲霉毒素A进行检测的方 法)相比，在适配体传感器的制作及检测模式上完全不同，CN 1011699277 A利用电化学方 法以电流值作为定量信号，而本发明采用电化学发光检测获得了更高的灵敏度，检测限可 低至 0. 007ng/mL。
发明内容
一种电化学发光适配体传感器检测赭曲霉毒素A的方法将纳米金粒子修饰到裸 金电极表面，对电化学信号起放大的作用，另外在工作电极表面修饰上巯基化的单链DNA， 并通过碱基配对将标记有异鲁米诺(ABEI)的适配体DNA修饰到电极表面，组装成适配体电 化学发光传感器。加入过氧化氢(H2O2)，检测发光信号，当加入目标分析物赭曲霉毒素A时， 适配体DNA与赭曲霉毒素A发生特异性结合，使得适配体DNA的空间构象发生变化，不能与 互补单链DNA匹配，从而标记有异鲁米诺(ABEI)的适配体DNA从电极表面脱落，导致电化 学发光信号减弱。以此现象对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线，以达到对含赭 曲霉毒素A样品进行定量检测的目的；步骤为(1)裸金电极的抛光处理将裸金电极依次用111111、0.311111、0.0511111的氧化铝 粉末进行打磨处理；然后置于丙酮水溶液中超声数分钟。将抛光处理好的电极在浓度为 0. 5mol/L H2SO4中，0 1. 5V(标准甘汞电极)100mV/S进行循环伏安扫描直至得到重现的 循环伏安图。然后用含有铁氰化钾的PBS溶液，在-0. 2 0. 6V(标准甘汞电极)100mV/S 下进行循环伏安扫描表征，直至得到形状良好的、峰_峰差值小于74mV的循环伏安图。(2)裸金电极的修饰将裸金电极置于2mM 1，3-丙二硫醇-乙醇溶液中室温孵育 20h，巯基单分子层被修饰到电极表面，经过乙醇和超纯水清洗后，将其置于200 μ L纳米金 溶液中4°C反应10h，即得纳米金修饰的电极，室温吹干后备用。(3)适配体修饰2mg ABEI (购于Sigma，USA)溶于盐酸，然后加入含5%戊二醛的 PBS缓冲液，室温搅拌反应2h后，加入适配体DNA (购于上海生工生物工程技术服务有限公 司)4°C振摇反应12h，得到ABEI标记的适配体DNA。(4)适配体电化学发光传感器的制备将纳米金修饰好的电极置于LOmL浓度为 2. OX 10_6mol/L单链DNA中反应4h，用0. lmol/L PBS缓冲液清洗电极，再将其置于1. OmL ABEI标记的适配体DNA 37°C杂交反应30min，清洗电极。即制备得该电化学发光传感器。(5)对制备所得的电化学发光传感器分别施加循环伏安和脉冲电压，由于ABEI在 脉冲电压下氧化程度更高，所以检测时脉冲电压获得的电化学工作信号强于循环伏安法， 而且脉冲电压下得到的电化学发光信号也比循环伏安法得到的稳定，因次本发明选用脉冲 电压。且在脉冲电压下，利用纳米金修饰的电极进行检测得到的电化学发光信号比单纯使 用裸金电极增大了 10倍。(6)对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线将制备好的电化学发光传 感器置于赭曲霉毒素A标准品溶液中反应，标准品溶液浓度依次为0ng/mL、0. 02ng/mL、 0. 04ng/mL、0. 06ng/mL、0. 08ng/mL、0. lng/mL、0. 2ng/mL、0. 8ng/mL、Ing/mL、1. 5ng/mL、2ng/ mL、3ng/mL，选用工作电压为0. 8V，工作缓冲体系为Na2CO3-NaHCO3 (pHll. 0)，每个浓度分别 反应30min，随后加入的H2O2浓度为1. 5mM，根据相对电化学发光值与对应的赭曲霉毒素A 标准品浓度建立际准曲线。
(7)对赭曲霉毒素A样品进行检测将制备好的电化学发光传感器置于赭曲霉 毒素A待测样品溶液中反应，选用工作电压为0. 8V,工作缓冲体系为Na2CO3-NaHCO3(pH 11.0)，每个样品反应30min，随后加入的H2O2浓度为1. 5mM,根据相对电化学发光值与从标 准曲线中求得对应的赭曲霉毒素A的浓度。所述的纳米金粒子粒径为IOnm左右。所述的适配体DNA是对赭曲霉毒素A有特异性结合能力的单链DNA。所述的标记ABEI的氨基适配体DNA，是通过戊二醛反应，将ABEI与适配体上修饰 的氨基通过偶联作用反应得到的。所述的单链DNA是与适配体DNA的一端互补配对、且用巯基修饰的DNA，修饰到电 极上的纳米金粒子与巯基修饰的DNA通过金巯键相结合。所述的建立赭曲霉毒素A检测的标准曲线是指适配体电化学发光传感器与不同 浓度的赭曲霉毒素A进行孵育后，再与过氧化氢在施加脉冲电压的条件下进行电化学发光 反应，根据不同浓度下得到的相对电化学发光强度做的标准曲线。有益效果(1)本发明采用异鲁米诺(ABEI)标记的适配体做传感器，提高了检测的灵敏度和 稳定性。(2)本发明把纳米金粒子修饰到电极表面，放大了电化学发光信号，进一步提高了 其灵敏度。(3)本发明采用电化学发光作为检测手段，灵敏度高，方便快捷。
图1 基于适配体的电化学发光传感器对赭曲霉毒素A定量检测的实验原理图。图2 对赭曲霉毒素A定量检测的电化学发光工作信号图。A.循环伏安图谱；B.脉 冲电压图谱，其中(a)图为金电极表面修饰了纳米金粒子得到的信号图；(b)图为裸金电极 得到的信号图。图3 赭曲霉毒素A检测标准曲线图。图4 本发明和国标方法检测同样的实际样品得到的相关性曲线。
具体实施例方式实施例1 赭曲霉毒素A检测标准曲线的建立及小麦实际样品检测将制备好的电化学发光传感器置于赭曲霉毒素A标准品溶液中反应，标准品溶 液浓度依次为 0ng/mL、0. 02ng/mL、0. 04ng/mL、0. 06ng/mL、0. 08ng/mL、0. lng/mL、0. 2ng/ mL、0. 8ng/mL、lng/mL、l. 5ng/mL、2ng/mL、3ng/mL，选用工作电压为 0. 8V，工作缓冲体系为 Na2CO3-NaHCO3 (pH 11.0)，每个浓度分别反应30min，随后加入的H2O2浓度为1. 5mM,根据相 对电化学发光值与对应的赭曲霉毒素A标准品浓度建立标准曲线。样品预处理小麦高速粉碎过筛，称取20g于IOOmL烧瓶中，加入5g NaCl，80%乙 醇水溶液，充分混勻后置于均质器中高速搅拌提取2min，静止片刻，过滤，取IOmL滤液置于 50mL烧瓶中，再次在均质器中高速搅拌提取2min，静止后用超细玻璃纤维过滤纸过滤，直 至滤液澄清，收集滤液备用。
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从本地六家农贸市场购买20种不同类别的小麦，利用本发明方法和国标方法分别测定其中赭曲霉毒素A的含量，结果见表一，将得到的数据进行相关性比较，结果P<o．000l，说明该发明方法快速可靠，灵敏度高，稳定性好，适合用于小麦实际样品中赭曲霉毒素A的检测。
表一小麦实际样品检测，本发明方法与国标方法对比
权利要求
一种电化学发光适配体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于对裸金电极抛光处理，然后将纳米金粒子修饰在裸金电极上，接着将单链DNA修饰到电极上，最后通过碱基配对将标记有异鲁米诺(ABEI)的适配体修饰到电极表面，装配成为基于适配体的电化学发光传感器，对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线，以达到对含赭曲霉毒素A样品进行定量检测的目的。
2.如权利要求1所述的一种电化学发光适配体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特 征在于裸金电极的抛光处理将裸金电极依次用1 μ m、0. 3 μ m、0. 05 μ m的氧化铝粉末进行 打磨处理；然后置于丙酮水溶液中超声数分钟。
3.如权利要求1所述的一种电化学发光适配体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特 征在于裸金电极上修饰上纳米金粒子将裸金电极置于2mM 1，3-丙二硫醇-乙醇溶液中室 温孵育20h，巯基单分子层被修饰到电极表面，经过乙醇和超纯水清洗后，将其置于200μ L 纳米金溶液中4V反应10h，即得纳米金修饰的电极，室温吹干后备用。
4.如权利要求1所述的一种电化学发光适配体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特 征在于适配体DNA修饰2mg ABEI溶于盐酸，然后加入含5%戊二醛的PBS缓冲液，室温搅 拌反应2h后，加入适配体DNA4°C振摇反应12h，得到ABEI标记的适配体DNA。
5.一种电化学发光适配体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，利用脉冲电压为电势，优 化各项工作条件工作电压为0. 8V，工作缓冲体系为Na2CO3-NaHCO3 (pH 11. 0)，加入的H2O2 浓度为1. 5mM，确保该方法的灵敏度、准确性和稳定性。
全文摘要
一种电化学发光适配体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，属于电化学发光传感器技术领域，用于小麦、谷物，饲料及其制品中赭曲霉毒素A含量的检测。本发明的基础是适配体对赭曲霉毒素A的特异性识别和过氧化氢(H2O2)与异鲁米诺(ABEI)在碱性条件下的电化学发光反应。将纳米金粒子修饰到裸金电极表面，对电化学发光信号起放大的作用，再在工作电极表面修饰上单链DNA，并通过碱基配对将标记有异鲁米诺(ABEI)的适配体修饰到电极表面，加入过氧化氢(H2O2)，检测电发光信号，相对电化学发光信号强度与赭曲霉毒素A浓度成比例，进而建立赭曲霉毒素A定量检测的标准曲线。本发明旨在建立灵敏度高、可操作性强的赭曲霉毒素A定量检测方法。
文档编号G01N27/48GK101936940SQ20101027124
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者吴世嘉, 段诺, 混旭, 王周平 申请人:江南大学