基于量子点的赭曲霉毒素A的sFLISA快速检测方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于量子点的赭曲霉毒素A的sFLISA（sandwich?fluorescence-linked?immunosorbent?assay）快速检测方法和检测试剂盒；方法包括下列步骤：首先用2.5μg/mL的抗OTA多克隆抗体100μL包被酶标板（黑色底透）；用1×PBST200μL洗涤后，用1×BSA?PBS封闭酶标板；用1×PBST200μL洗涤后，加入被检测抗原样品溶液100μL；用1×PBST200μL洗涤后，加入生物素标记的抗OTA单克隆抗体100μL；用1×PBST200μL洗涤后，加入100μL1:100稀释的量子点标记的链霉亲和素；用1×PBST200μL洗涤甩干后，用荧光分光光度计（390nm激发波长，605nm发射波长），测定相对荧光强度（RFU），根据样品的RFU代入标准曲线，得出样品的OTA含量。本发明所建立基于量子点的赭曲霉毒素AsFLISA快速检测方法，具有准确、快速、荧光稳定性好、灵敏、特异性高的特点。
【专利说明】基于量子点的赫曲霉毒素A的sFL ISA快速检测方法和试剂
合
Sl
[0001]【技术领域】:
本发明属于食品安全检测【技术领域】的方法，涉及基于量子点标记技术的赭曲霉毒素A的sFLISA检测方法。
[0002]【背景技术】:
赭曲霉毒素(OA)是曲霉属和青霉属的某些菌种产生的次级代谢有毒产物，属烈性的肝脏和肾脏毒素，并具有致癌、致畸和致突变性。OA广泛存在于各种食物中，花生、谷物及其副产品是OA的主要来源；此外，在可可、咖啡、肉类、乳汁、干果、调味品、酒类中也存在0A。这类毒素包括7种结构类似的化合物，其中毒性最大、分布最广泛、对农作物污染最严重、与人类健康关系最为密切的是赭曲霉毒素A (ochratoxin, OTA), OTA被证实有致癌、致畸、致突变的作用，还具有免疫抑制性，国际癌症研究机构LARC将OTA定位为2B类致癌物(SP可能引起人类癌症的物质)。
[0003]OTA的产毒菌株广泛地存在于自然界中，且能经食物链进入人体，在谷类和人血清等样品中都检出过OTA残留，严重危害人类的健康。由于OTA的危害性，各国都立法对食品中OTA的残留进行限定。至今已有多个国家制定了食品(I?50 ii g/kg)和动物饲料(100?IOOOil g/kg)的OA限量标准。因此，研究灵敏度高、检测限低的快速检测方法显得尤为重要。
[0004]目前对赭曲霉毒素A的检测方法有免疫亲和柱-高效液相色谱法(IAC-HPLC)、时间分辨荧光免疫法(TRFIA)、酶联免疫法(ELISA)、免疫亲和柱-荧光光度法等。传统的检测方法存在样品前处理过程中使用多种有毒、异味有机溶剂，毒害操作人员和污染环境；试剂昂贵，成本高；检测结果重现性差，存在交叉反应而易造成假阳性等缺点。
[0005]量子点(QDs)，又称无机半导体纳米晶体，是一类由II 一 VI族(如CdSe、CdTe,CdS、ZnSe等)或III 一 V族(如InP、InAs等)元素组成的纳米颗粒,是近年发展起来的一种新型荧光纳米材料。与传统有机荧光染料相比，具有很多优良的荧光性能，吸收光谱宽、发射光谱窄而对称，斯托克斯位移(Stoke’s shift)大及较高的突光稳定性和较长的衰减寿命。现在，量子点作为一种新型的荧光标记材料和重要的纳米材料之一，经常被用作生物标记及成像过程中的光学探针，在生物领域中的应用越来越受到关泛关注，特别是在临床诊断方法取得了长足的进展。
[0006]本发明利用多克隆抗体的强富集能力，通过量子点标记的链霉亲和素与生物素标记的OTA检测抗体相互作用的级联放大效应(亲和素与生物素互作效应)，巧妙设计了 一种灵敏度高、特异性强的赭曲霉毒素A三明治夹心荧光免疫检测(s an dw i c hfluorescence-linked immunosorbent assay, sFLISA)方法,为赫曲霉毒素 A 在食品安全等应用领域提供技术基础和参考依据。
[0007]
【发明内容】
:
本发明所要解决的技术问题是提供一种赭曲霉毒素A的基于量子点标记技术的sFLISA定量检测方法，即通过量子点荧光标记的链霉亲和素-生物素之间的级联放大效应，能灵敏特异地进行赭曲霉毒素A的定量检测，以克服现有检测技术的不足。
[0008]为解决上述技术问题，本发明利用量子点多波长激发、高强度荧光发射、发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好的荧光特性，提供了一种基于量子点标记的赭曲霉毒素A的检测方法，对被测物进行定量检测；主要原理是利用多克隆抗体的强富集能力，通过量子点标记的链霉亲和素与生物素标记的OTA检测抗体相互作用的级联放大效应(亲和素与生物素互作效应)，设计了一种灵敏度高、特异性强的赭曲霉毒素A的sFLISA定量检测方法。
[0009]一种基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA快速检测方法，具体包括下列步骤:
具体包括下列步骤:
(一)兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的包被
用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液将兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体稀释成浓度为2.5 u g/mL包被酶标板，每孔100 U L。42°C孵育0.5 h，倒去包被液，用I XPBST洗涤3次，3min/次,甩干。
[0010](二)封闭
用IX BSA-PBS溶液封闭板上的空白位点，每孔200 iiL，37°C孵育2 h，倒去封闭液，用I XPBST洗涤3次，3min/次，甩干。
[0011](三)加待检样品
各孔加倍比稀释的标准品或待测样品各100 u L，阴性对照孔加100 i! L的IX BSA-PBS,37°C孵育I h，用IXPBST洗涤3次，3min/次，甩干。
[0012](四)加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体
除试剂空白孔外，其余各孔加生物素化抗体IOOiiL，37°C孵育I h，用IXPBST洗涤3次，3min/次,甩干。
[0013](五)加量子点标记的链霉未和素
所有各孔加100 UL用TB S缓冲液稀释的适合稀释倍数的量子点标记的链霉亲和素，37°C孵育I h，用IXPBST洗涤3次，3min/次，甩干。
[0014](六)相对荧光强度检测
在多功能荧光酶标仪上以390nm为激发波长，605nm为发射波长，选择底读模式，测量相对突光强度(RFU, relative fluorescence units),减去试剂空白孔的相对突光强度,得到相对荧光强度值。
[0015](七)建立标准曲线
根据赭曲霉毒素A浓度和相应的相对荧光强度建立了标准曲线，在0.39 Ug/L~125 Ug/L之间，赭曲霉毒素A浓度与相对荧光强度呈线性关系，线性回归方程为y=0.0207x+0.196 (线性相关系数R2=0.9938，y为相对荧光强度，x为赭曲霉毒素A的浓度(u g/L));根据标准曲线回归方程可计算出样品的赭曲霉毒素A的浓度。
[0016]本发明所建立基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA快速检测方法，能够快速地对赭曲霉毒素A进行定量检测，加标回收试验结果表明，加标回收率范围在90.1%~110%之间，变异系数均小于10%。具有较高的特异性；该方法具有快速、稳定性好、灵敏、特异高的特点，具有很好的推广应用价值。
[0017]本发明还提供了一种基于量子点的赭曲霉毒素A的sFLISA检测试剂盒，包括:
(I)酶标板I块:包括12条,每条含有8个小孔,每个孔中均包被有兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体；
(2)稀释板I块:没有包被的12条8孔板；
(3)6瓶赭曲霉毒素A标准品浓度分别为:0,0.39,0.79,1.56,3.125,6.25,12.5、25、50、125 u g/L，每瓶 1.5 mL ;
(4)生物素标记的赭曲霉毒素A抗体:10mL ；
(5)量子点标记的链霉未和素:10mL。
[0018]发明所建立的基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA快速检测方法，具有准确、快速、荧光稳定性好、灵敏、特异性高的特点。
[0019]附图或附表说明:
图1为本发明实施例1，基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA快速检测方法建立的标准曲线，图中，横坐标为赭曲霉毒素A的浓度(y g/L)，纵坐标为相对荧光强度(RFU)。
[0020]图2为实施例4中样品应用HPLC的检测图谱。
[0021]【具体实施方式】:
下面通过具体实施例并结合附图或附表进一步阐述本发明。
[0022]实施例1:基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA快速检测方法建立的标准曲线
(一)兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的包被
用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液将兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体稀释成浓度为2.5 u g/mL包被酶标板，每孔100 U L。42°C孵育0.5 h，倒去包被液，用I XPBST洗涤3次，3min/次,甩干。
[0023](二)封闭
用IX BSA-PBS溶液封闭板上的空白位点，每孔200 iiL，37°C孵育2 h，倒去封闭液，用I XPBST洗涤3次，3min/次，甩干。
[0024](三)加待检样品
各孔分别加一定稀释倍数的标准品:0.39,0.79、1.56,3.125,6.25、12.5、25、50、125、250,500 u g/L IOOii L，阴性对照孔加 IOOiiL 的 IX BSA-PBS，37°C 孵育 I h,用 IXPBST 洗漆3次，3min/次,甩干。
[0025](四)加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体
除试剂空白孔外，其余各孔加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体IOOiiL，37°C孵育I h，用IXPBST洗涤3次，3min/次，甩干。
[0026](五)加量子点标记的链霉未和素
所有各孔加100 UL用TBS缓冲液稀释的适合稀释倍数的量子点标记的链霉亲和素，37°C孵育I h，用IXPBST洗涤3次，3min/次，甩干。
[0027](六)相对荧光强度检测
在多功能荧光酶标仪上以390nm为激发波长，605nm为发射波长，选择底读模式，测量相对突光强度(RFU, relative fluorescence units),减去试剂空白孔的相对突光强度,得到相对荧光强度值。
[0028](七)建立标准曲线
在0.39 yg/L?125 U g/L之间，赭曲霉毒素A浓度与相对荧光强度呈线性关系，推导出线性回归方程为y=0.0207x+0.196 (线性相关系数R2=0.9938，y为相对荧光强度，x为赭曲霉毒素A的浓度(ii g/L))。在此浓度范围内，赭曲霉毒素A浓度可进行定量分析。
[0029]实施例2:基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA快速检测方法的重现性试验 (一)兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的包被
用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液将兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体稀释成浓度为2.5 u g/mL包被酶标板，每孔100 U L。42°C孵育0.5 h，倒去包被液，用I XPBST洗涤3次，3min/次,甩干。
[0030](二)封闭
用IX BSA-PBS溶液封闭板上的空白位点，每孔200 iiL，37°C孵育2 h，倒去封闭液，用I XPBST洗涤3次，3min/次，甩干。
[0031](三)加待检样品
各孔分别加一定稀释倍数的标准品:6.25、25、50i!g/L 100 y L，平行重复3次，阴性对照孔加IOOuL的IX BSA-PBS，37°C孵育I h，用I XPBST洗涤3次，3min/次，甩干。
[0032](四)加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体
除试剂空白孔外，其余各孔加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体IOOiiL，37°C孵育I h，用IXPBST 洗涤3次，3min/次，甩干。
[0033](五)加量子点标记的链霉未和素
所有各孔加100 UL用TBS缓冲液稀释的适合稀释倍数的量子点标记的链霉亲和素，37°C孵育I h，用IXPBST洗涤3次，3min/次，甩干。
[0034](六)相对荧光强度检测
在多功能荧光酶标仪上以390nm为激发波长，605nm为发射波长，选择底读模式，测量相对突光强度(RFU, relative fluorescence units),减去试剂空白孔的相对突光强度,得到相对荧光强度值。
[0035](七)根据标准曲线计算赭曲霉毒素A含量
选择3个OTA浓度(6.25,25和50 u g/L)，每个浓度反复测定4次。计算相对标准差分别为5.63%、2.77%、5.65%，平均相对标准差为4.68% ;回收率分别为109.5%、100.6%,95.9%,平均回收率为102.0%，具有良好的重现性，具体结果见表1。
[0036]表1方法重现性试验结果
【权利要求】
1.一种基于量子点的赭曲霉毒素A的sFLISA快速检测方法，其特征在于:兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体作为捕获抗体，生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体作为检测抗体，量子点标记的链霉亲和素作为荧光探针，通过亲和素-生物素之间的级联放大效应，能灵敏特异地进行赭曲霉毒素A的定量检测，与黄曲霉毒素BI等无交叉反应； 具体包括下列步骤: (一)兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的包被 用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液将兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体稀释成浓度为.2.5ug/mL包被酶标板，每孔100uL，42°C孵育0.5 h，倒去包被液，用1XPBST洗涤3次，.3min/次,甩干； (二)封闭 用1X BSA-PBS溶液封闭板上的空白位点，每孔200 uL，37°C孵育2 h，倒去封闭液，用.1XPBST洗涤3次，3min/次，甩干； (三)加待检样品 相应孔加一定稀释倍数的标准品或待测样品100 yL，阴性对照孔加1OOuL的1XBSA-PBS，37°C孵育 1 h，用 1XPBST 洗涤 3 次，3min/次，甩干; (四)加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体 除试剂空白孔外，其余各孔加生物素化抗体100 uL，37°C孵育1 h，用IXPBST洗涤.3次,3 min/次,甩干； (五)加量子点标记的链霉未和素 所有相应孔加100 u L用TBS缓冲液1:100稀释的量子点标记的链霉亲和素，37°C孵育1 h，用1XPBST洗涤3次，3min/次，甩干； (六)相对荧光强度检测 在多功能荧光酶标仪上以390nm为激发波长，605nm为发射波长，选择底读模式，测量相对突光强度(RFU, relative fluorescence units),减去试剂空白孔的相对突光强度,得到相对荧光强度值； (七)建立标准曲线并计算待测样品中的赭曲霉毒素A的浓度 根据赭曲霉毒素A浓度和相应的相对荧光强度建立了标准曲线，在0.39 ug/L~125 ug/L之间，赭曲霉毒素A浓度与相对荧光强度呈线性关系，线性回归方程为y=0.0207x+0.196 (线性相关系数R2=0.9938，y为相对荧光强度，x为赭曲霉毒素A的浓度(u g/L)) ;根据标准曲线回归方程可计算出样品的赭曲霉毒素A的浓度。
2.一种基于量子点的赭曲霉毒素A的sFLISA检测试剂盒，包括: (1)酶标板1块:包括12条,每条含有8个小孔,每个孔中均包被有兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体； (2)稀释板1块:没有包被的12条8孔板； (3)6瓶赭曲霉毒素A标准品浓度分别为:0,0.39,0.79,1.56,3.125,6.25,12.5、25、.50、125 u g/L，每瓶 1.5 mL ; (4)生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体:10mL ； (5)量子点标记的链霉未和素:10mL。
【文档编号】G01N33/558GK103616508SQ201310597843
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】房保海, 梁旭锋, 贾俊涛, 姜英辉, 李正义, 于立欣, 房倩 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心