专利名称：快速检测滴滴涕代谢物的免疫胶体金试纸条以及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及有机氯农药滴滴涕(l，l，l-trichl0r0-2， 2-bis-p-chlorophenyl-ethane,DDT)代谢物的检测技术，特别是涉及一种利用蛋白偶联合成抗原，制备抗有机氯农药滴滴涕DDT代谢物的单克隆抗体，并涉及利用胶体金标记单克隆抗体，而分析检测环境样品中的DDT代谢物DDA含量的快速方便检测试纸条的制法。
背景技术：
DDT(1,1,l-trichloro-2,2-bis-p-chlorophenyl-ethane ；1,1,1- H 氯 _2， 2_双-ρ-氯苯基_乙烷)作为广谱杀虫剂曾经在20世纪50年代被大量使用。这一类含氯原子的有机合成杀虫剂，具有极高的脂溶性和稳定性，可在生物体内富集很高的浓度，在环境中降解缓慢，属于持久性有机污染物。DDT在沉积物中的两种主要分解物是2，2-双 (4-氯苯基)-1，1_ 二氯乙烯(DDE)和2,2-M (4-氯苯基)-1，1-二氯乙烷(DDD) ；DDT在动物组织内可以缓慢降解为2，2_双(4-氯苯基)乙酸(DDA)。DDA本身并不积累，而是作为人或动物与DDT暴露接触的指标，已报道尿液中DDA的含量可以用作人或其他哺乳动物暴露接触DDT的灵敏指标。DDT及其代谢产物DDD、DDE等属于环境内分泌干扰物质，损害动物的神经和生殖系统，长期暴露对肝脏有损害，因此70年代已被发达国家禁止使用，但由于其价格低廉、杀灭蚊虫效果显著，至今在一些发展中国家，包括我国的个别地区仍在使用；DDT的羟基同系物三氯杀螨醇(Dicofol)作为农业杀虫剂尚未被禁用，它含有不低于 5%的DDT ；因此在食品、环境样品中甚至南北极仍能检出DDT和它的代谢物。目前有机氯农药滴滴涕(DDT)及其代谢物的常规分析方法主要有气相色谱结合质谱或电子捕获检测器方法(GC/MS、GC/FLD)，该方法不仅需要昂贵的仪器设备和专业的分析人员，而且样品的前处理过程繁琐复杂，不易满足大批量样品的检测分析需要，也不适用于现场分析。近年来得到快速发展的免疫分析技术，以其特异性强、灵敏度高、操作简便、检测迅速和分析成本低的优点被广泛应用于各种有机污染物的分析。免疫化学方法是通过免疫动物等手段制得特异性抗体(多克隆抗体或单克隆抗体)，利用抗体和待检测抗原的结合反应，建立免疫分析方法，用于DDT及其代谢物的分析检测，该方法简便、快速，可同时分析大批量样品。建立有机氯农药滴滴涕代谢物的快速检测技术和产品，对了解有机氯农药滴滴涕的残留，特别是对于保障食品安全具有十分重大的意义。
发明内容
本发明的目的是克服上述DDT及其代谢物检测技术的不足，提供一种特异、敏感和简便的快速检测DDT代谢物DDA的免疫胶体金试纸条；本技术发明提供一种抗DDA的单克隆抗体的制备，用胶体金标记抗体，通过竞争免疫反应，利用抗DDA的单克隆抗体研制的间接竞争免疫层析分析DDA的试纸条，快速检测贝类中的DDT代谢物DDA ；简单易操作，适于现场、快速、大批量样品的检测，不需任何其他仪器设备，非专业人员可现场使用，产品性會旨稳定。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是一种快速检测DDT代谢物的免疫胶体金试纸条，包括样本垫、胶金垫、赛多利斯NC膜、吸水垫和PVC背衬；其具体结构是在PVC 背衬上按顺序依次粘附有样本垫、胶金垫、赛多利斯NC膜、吸水垫，胶金垫上包被有胶体金标记的抗DDA单克隆抗体，赛多利斯NC膜上分别包被有DDA与卵清蛋白偶联物构成的检测线和羊抗鼠第二抗体构成的质控线。
所述抗DDT代谢物的单克隆抗体为用DDA-牛血清蛋白偶联物免疫Balb/c小鼠， 经细胞融合，筛选得到抗DDT代谢物的单克隆抗体的杂交瘤细胞系分泌的。所述样本垫、胶金垫、NC膜、吸水垫按顺序依次粘附在PVC背衬上并装在试纸条卡里，上面开有加样孔和显色区。所述试纸条为检测DDT代谢物DDA的试纸条。所述快速检测DDT代谢物DDA的免疫胶体金试纸条的制法，其步骤包括1、将2，2_双(4-氯苯基)乙酸(DDA)与载体蛋白偶联，制备得到DDA-载体蛋白偶联物；2、用DDA-牛血清蛋白偶联物免疫Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选得到分泌抗DDT 代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞系；3、制备抗DDT代谢物单克隆抗体；4、用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；5、将步骤3制得的抗DDT代谢物单克隆抗体加入步骤4制备得到的胶体金中，得到抗DDT代谢物单克隆抗体_胶体金标记物；6、将抗DDT代谢物单克隆抗体_胶体金标记物喷点(包被)在胶金垫上；7、将DDA-卵清蛋白偶联物喷点(包被)在NC膜上构成检测线，并将羊抗鼠多抗 (或单抗)喷点(包被)在NC膜上构成质控线。8、将样本垫、胶金垫、NC膜、吸水垫按顺序依次粘附在PVC背衬上，并包装在试纸条卡里，上面开有加样孔和显色区，得到检测DDT代谢物DDA的免疫胶体金试纸条。所述快速检测DDT代谢物的免疫胶体金试纸条在检测DDT代谢物DDA的应用。本发明借助胶体金标记显色的免疫层析反应，用以制备快速检测DDT代谢物免疫胶体金试纸条，结构更加合理，应用胶体金标记抗DDT代谢物单克隆抗体，选用DDA-载体蛋白偶联物作为检测线，建立竞争免疫层析快速检测待测样品中是否含有DDT代谢物。通过待检样品中的DDT及代谢物DDA与包被于NC膜上的DDA-载体蛋白偶联物共同竞争抗DDT 代谢物DDA单克隆抗体-胶体金标记物，在检测线处出现深浅不同的红色条带或不出现条带，质控线处出现红色条带。若待测样品试纸条检测线无色，同时质控线上出现红色条带则判断为阳性样品，即待测样品中DDT代谢物DDA的浓度高于250ng/mL ；若待测样品试纸条检测线有红色出现，同时质控线上出现红色条带则判断为阴性样品，即待测样品中DDA的浓度小于250ng/mL ；如果质控线上没有出现红色条带，则该试纸条失效。与现有技术相比，本发明具有以下突出优点1、本发明的检测DDT代谢物DDA的免疫胶体金试纸条，具有特异性强，检测灵敏度高(可达250ng/mL)，检测快速(只需15min)，前处理简单等优点。2、本发明的试纸条不需任何仪器设备，携带方便，检测成本低。3、本发明的试纸条操作简单易掌握，无需专业人员操作。
4、本发明的试纸条储存方便，稳定性好，在室温下至少可保存六个月。5、本发明的试纸条检测结果准确性高，精度高。
图1为本发明检测试纸条结构示意中1为样品垫，2为胶金垫，3为赛多利斯NC膜，4为吸水垫，5为PVC背衬，6为检测线，7为质控线，8为试纸条卡，9为加样孔，10为显色区图2为本发明的检测试纸条结果判定示意中A为阴性标准品结果，B为阴性样品结果，⑶为阳性样品结果，EF为试纸条失效
具体实施例方式实施例1 (制备实施例)检测DDT代谢物DDA的免疫胶体金试纸条制备方法
1、DDA-载体蛋白偶联物的制备将2，2-双(4-氯苯基)乙酸(DDA)溶于少许的二甲基亚砜中，加入水溶性碳化二亚N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，25°C反应1. 5小时后，加入溶于磷酸盐缓冲液(pH7. 0)的牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(0VA)，25°C反应3小时。将反应混合物透析3d，4°C，每12h换液 1次。透析物分装后，_20°C保存。制备得到DDA-BSA和DDA-OVA偶联物备用。2、抗DDT代谢物单克隆抗体的制备利用制备的DDA-牛血清蛋白偶联物(DDA-BSA)作为免疫原，免疫6 8周龄的雌性BALB/c小鼠。首次免疫用30 μ gDDA-BSA与等体积完全弗氏佐剂，充分乳化后，腹腔注射小鼠，第3、5、7、9、11周取同量DDA-BSA与等体积不完全弗氏佐剂充分乳化，腹腔注射。取尾血测定小鼠血清效价，待效价大于要求值后，用同量DDA-BSA的PBS溶液腹腔注射进行加强免疫，三天后取脾细胞融合。取生长状态良好的骨髓瘤SP2/0细胞与免疫的小鼠脾细胞按1 10的比例混合， 加入PEG进行细胞融合。融合后接种于96孔细胞培养板中，在15%血清的HAT培养基中选择培养，7天后换HT培养液，取细胞培养液上清ELISA检测。选取阳性细胞孔，用有限稀释法克隆3次，筛选可稳定分泌抗DDT代谢物DDA单克隆抗体的杂交瘤细胞株。取8周龄健康BALB/c雌性小鼠或杂交一代鼠，腹腔注射液体石蜡0. 5mL/每只，待用。1500r/min离心收集对数生长期的阳性杂交瘤细胞，悬浮于生理盐水中，浓度为106/mL左右。在石蜡油处理的小鼠腹腔内注射0. 5mL杂交瘤细胞悬液诱生腹水，收集腹水，3000r/min离心lOmin，收集上清液即为含单克隆抗体腹水。腹水用辛酸硫酸氨方法提纯得到粗制抗体蛋白，再用0. OlM的PBS缓冲液(pH7. 4) 透析3天。取出用紫外分光光度计测得蛋白浓度为2. 6mg/mL。3、抗DDT代谢物单克隆抗体_胶体金标记物的制备及包被胶金垫用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；取40nm的胶体金于干净的烧杯中，用 IM的K2CO3调节其pH值为8. 2，加入抗DDT代谢物单克隆抗体，使其在胶体金中终浓度为 25 μ g/ml，搅拌lh，加入胶体金1/10体积的10% BSA溶液，搅拌30min，5000rpm离心30min，取沉淀，用0. OlM的PBS缓冲液复溶，用紫外分光光度计扫描胶体金特征吸收峰，确定胶体金OD值后用0. OlM的PBS缓冲液稀释，包被到经预处理的胶金垫上。真空干燥备用。 4、偶联抗原包被NC膜DDA-卵清蛋白偶联抗原用0. OlM的PBS缓冲液稀释后，包被到经预处理的NC膜上。37°C干燥1小时备用。并将羊抗鼠多抗(或单抗)包被在NC膜上构成质控线。5、试纸条的组装将处理好的样本垫、包被有抗DDA单克隆抗体-胶体金标记物的胶金垫、包被有2， 2_双(4-氯苯基)乙酸-卵清蛋白偶联抗原作为检测线和包被有羊抗鼠抗体作为质控线的NC膜、吸水垫按顺序依次粘附在PVC背衬上，安装在试纸条卡里，上面开有加样孔和显色区。阳性250ng/mL完全抑制，无条带出现；加样量为100 μ 1/孔；判断时间为15min ；最低检测限为小于250ng/mL。真空封装，常温保存，有效期至少6个月。实施例2 (应用实施例)检测有机氯农药滴滴涕代谢物的免疫胶体金试纸条使用方法1、贝类等样品的预处理称取贝类勻浆5g，加5ml (丙酮/正己烷=1/1)，搅勻，超声萃取10min，3000r/ min离心IOmin ；勻浆固体再加5ml (丙酮/正己烷=1/1)超声萃取lOmin，3000r/min离心 IOmin ；2次上清合并，减压蒸干，用PBS (pH = 7. 4)定容至1ml。取上清液进行分析。2、检测上述的贝类萃取液，用微量移液枪取100 μ L于加样孔中，放置15min观察显色情况。同时分别取100 μ 1 0. OlM PBS和100 μ L 250ng/mL的2，2-双(4-氯苯基)乙酸DDA 标准溶液于另两个试纸条的加样孔中，做阴性空白和阳性标准品对照实验。3、结果判定如图2所示，若待测样品试纸条检测线颜色比阴性空白试纸条检测线颜色浅，同时质控线上出现红色条带，则判断为阳性样品，即样品中DDA的浓度小于250ng/mL ；若待测样品试纸条检测线无颜色，同时质控线上出现红色条带，则判断为阳性样品，即样品中2， 2_双(4-氯苯基)乙酸DDA的浓度大于或等于250ng/mL;若待测样品试纸条检测线颜色与阴性空白试纸条检测线颜色一致，同时质控线上出现红色条带，则判断为阴性样品，即样品中不含2，2-双(4-氯苯基)乙酸或小于250ng/mL;若质控线上无颜色，则该试纸条失效。实施例3 (应用实施例)检测有机氯农药滴滴涕代谢物的免疫胶体金试纸条的应用样品中的2，2-双(4-氯苯基)乙酸DDA模拟检测实验分别向贝肉中添加2，2-双(4-氯苯基)乙酸DDA标准品，按实施例2制成Ong/ mlU00ng/ml,250ng/ml和300ng/ml的样品待测液，并按实施例2所述方法，用本发明试纸条对Ong/ml、250ng/ml、100ng/ml、300ng/ml的样品检测，重复实验3次，结果显示Ong/ml、 100ng/ml样品的试纸条检测线与阴性空白检测线颜色一致，同时质控线出现红色条带，判断为阴性样品；而250ng/ml和300ng/ml的样品的试纸条检测线无颜色或颜色极浅(大于 30min)，同时质控线出现红色条带，判断为阳性样品。说明本发明试纸条可以用来检测贝类样品。
权利要求
1.一种快速检测有机氯农药滴滴涕(l，l，l-trichl0r0-2， 2-bis-p-chlorophenyl-ethane,DDT)代谢物的免疫胶体金试纸条，包括样本垫、胶金垫、赛多利斯NC膜、吸水纸和PVC背衬，其特征是在PVC背衬上按顺序依次粘附有样本垫、胶金垫、赛多利斯NC膜、吸水垫，胶金垫为包被抗滴滴涕代谢物DDA的单克隆抗体-胶体金标记物的胶金垫，赛多利斯NC膜上分别包被2，2-双(4-氯苯基)乙酸(DDA)-蛋白偶联物构成的检测线和羊抗鼠抗体构成的质控线。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测滴滴涕代谢物的免疫胶体金试纸条，其特征是抗滴滴涕代谢物单克隆抗体为用2，2-双(4-氯苯基)乙酸-牛血清蛋白偶联物免疫 Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选得到抗DDA单克隆抗体的杂交瘤细胞系分泌的。
3.根据权利要求1或2所述的一种快速检测有机氯农药滴滴涕DDT代谢物的免疫胶体金试纸条，其特征是样本垫、胶金垫、NC膜、吸水垫按顺序依次粘附在PVC背衬上并装在试纸条卡里，上面开有加样孔和显色区。
4.根据权利要求1或2所述的一种快速检测有机氯农药滴滴涕DDT代谢物的免疫胶体金试纸条，其特征是其为检测滴滴涕代谢物DDA的试纸条。
5.一种快速检测有机氯农药滴滴涕DDT代谢物DDA的免疫胶体金试纸条的制备方法， 其步骤包括(1)将2，2-双(4-氯苯基)乙酸与载体蛋白偶联，制备得到2，2_双(4-氯苯基)乙酸-载体蛋白偶联物；(2)用2，2_双(4-氯苯基)乙酸-牛血清蛋白偶联物免疫Balb/c小鼠，经细胞融合， 筛选得到分泌抗滴滴涕代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞系；(3)制备抗滴滴涕代谢物DDA单克隆抗体；(4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；(5)将步骤(3)制得的抗DDA单克隆抗体加入步骤(4)制备得到的胶体金中，得到抗滴滴涕代谢物单克隆抗体_胶体金标记物；(6)将抗滴滴涕代谢物单克隆抗体-胶体金标记物喷点(包被)在胶金垫上；(7)将2，2-双(4-氯苯基)乙酸-卵清蛋白偶联物喷点(包被)在NC膜上构成检测线，并将羊抗鼠抗体喷点(包被)在NC膜上构成质控线；(8)将样本垫、胶金垫、NC膜、吸水垫按顺序依次粘附在PVC背衬上，并包装在试纸条卡里，上面开有加样孔和显色区，得到所述的检测有机氯农药滴滴涕(DDT)代谢物DDA的免疫胶体金试纸条。
6.快速检测有机氯农药滴滴涕DDT代谢物DDA的免疫胶体金试纸条在检测有机氯农药滴滴涕(DDT)代谢物中的应用。
全文摘要
本发明涉及检测有机氯农药滴滴涕(1，1，1-trichloro-2，2-bis-p-chlorophenyl-ethane，DDT)代谢物的检测器具。一种快速检测DDT代谢物的免疫胶体金试纸条，包括样本垫、胶金垫、赛多利斯NC膜、吸水垫和PVC背衬；其具体结构是在PVC背衬上按顺序依次粘附有样本垫、胶金垫、赛多利斯NC膜、吸水垫，胶金垫上包被有胶体金标记的抗DDT代谢物DDA的单克隆抗体，赛多利斯NC膜上分别包被有2，2-双(4-氯苯基)乙酸(DDA)与卵清蛋白偶联物构成的检测线和羊抗鼠抗体构成的质控线。本发明试纸条具有特异性强，检测灵敏度高，检测快速，前处理简单等优点，不需任何仪器设备，携带方便，检测成本低，操作简单易掌握；试纸条储存方便，稳定性好，在室温下至少可保存六个月；检测结果准确性高，精度高。
文档编号G01N33/577GK102411054SQ20101029139
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月19日 优先权日2010年9月19日
发明者刘仁沿, 刘磊, 梁玉波, 许道艳 申请人:国家海洋环境监测中心