专利名称：子宫内膜异位症的判定方法以及子宫内膜异位症的诊断用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于判定子宫内膜异位症的有无的方法、用于诊断子宫内膜异位症的试剂盒以及抗突触融合蛋白自身抗体等的使用方法。
背景技术：
子宫内膜异位症是子宫内膜样上皮细胞、间质细胞在卵巢、输卵管及腹腔内、直肠表面等子宫腔内表面以外的组织、内脏器官中随月经周期而重复增殖、出血、再生，从而对组织带来障碍的疾病。子宫内膜异位症具有子宫内膜样组织在异位增殖等与恶性肿瘤类似的特征，但是其始终为良性的疾病。然而，子宫内膜异位症的原因尚未阐明，认为月经应激为原因之一，由于晚婚、生育年龄延迟、生育次数减少等，近年来这种患者数目有所增加。此外有数据表明，子宫内膜异位症引起炎症、疼痛、组织粘连等，并以高比率并发不孕症。由此，在早期阶段检出子宫内膜异位症并对其进行处理是重要的。对于子宫内膜异位症，推荐通过腹腔镜检查、剖腹术进行视诊和通过组织学诊断进行明确诊断。但是，由于这些诊断方法对患者造成痛苦和负担，一般首先进行更简便的内诊、超声波检查、血液检查等。该血液检查中，使用CA125、CA19-9等标记物。而这些CA125和CA19-9本来为卵巢癌等的肿瘤标记物，因此对于子宫内膜异位症并无特异性。此外，在使用这些标记物的诊断中，存在真阳性率低、且假阳性率高的缺点。因此，要求可以替代CA125等的新型子宫内膜异位症诊断用标记物。作为除CA125等之外的子宫内膜异位症诊断用标记物，例如专利文献1中公开了 NADH脱氢酶等的基因，专利文献2中公开了组胺释放因子，专利文献3中公开了称为组织因子途径抑制物(TFPI-幻的蛋白质等。现有技术文献专利文献
专利文献1 日本特表2003-531580号公报专利文献2 日本特开2005-49343号公报专利文献3 日本特表2007-506965号公报。
发明内容
如上所述，除了实用化的CA125和CA19-9之外，也对子宫内膜异位症的诊断用标记物进行了各种研究。但是，对于专利文献1 2中记载的标记物，必须测定子宫内膜细胞样品中的表达水平，因此存在在采取样品时对受检者造成痛苦等问题。此外，对于专利文献3的标记物，以实验示出其与卵巢中产生的子宫内膜异位症性囊肿(巧克力囊肿)的相关性，但是其与卵巢外产生的子宫内膜异位症、未发展至巧克力囊肿的轻度子宫内膜异位症的相关性不明。
因此，本发明的目的在于，提供可以使用受检者的血液样品、并且与仅使用作为子宫内膜异位症标记物的CA125等的以往方法相比可以高灵敏度且高精度地判定子宫内膜异位症的判定方法，用于实施该本发明方法的诊断用试剂盒，以及应用抗突触融合蛋白自身抗体等判定子宫内膜异位症和制备子宫内膜异位症的诊断用试剂盒的方法。本发明人为了解决上述课题而进行精心研究，由血液中含有的成分搜索可以用作子宫内膜异位症的诊断用标记物的成分。结果发现，对于特定蛋白质的自身抗体表现出与子宫内膜异位症显著的相关性，因此用作比以往的子宫内膜异位症标记物更准确的标记物，从而完成本发明。本发明涉及的子宫内膜异位症的判定方法的特征在于含有进行选自血液样品中抗突触融合蛋白自身抗体、抗PDIKlL自身抗体和抗烯醇化酶自身抗体中至少1种的表达分析的步骤，和通过上述表达分析结果判定子宫内膜异位症发病的有无的步骤。本发明涉及的子宫内膜异位症的诊断用试剂盒的特征在于含有选自突触融合蛋白、PDIK1L、烯醇化酶、它们的片段肽、它们的变性物、它们的修饰物中的至少一种肽，以及可以和与上述肽特异性地结合的自身抗体结合且具有标记基团的二次抗体。本发明涉及的选自抗突触融合蛋白自身抗体、抗PDIKlL自身抗体和抗烯醇化酶自身抗体中的至少一种可以用于子宫内膜异位症的判定和子宫内膜异位症的诊断用试剂盒的制备。
[图1]为表示基于本发明方法，测定由子宫内膜异位症患者、其它疾病的患者和健康者得到的血清样品中的抗α-烯醇化酶自身抗体的相对活性的结果的图。[图2]为表示基于本发明方法，测定由子宫内膜异位症患者、其它疾病的患者和健康者得到的血清样品中的抗PDIKlL自身抗体的相对活性的结果的图。[图3]为表示基于本发明方法，测定由子宫内膜异位症患者、其它疾病的患者和健康者得到的血清样品中的抗突触融合蛋白5自身抗体的相对活性的结果的图。
具体实施例方式在本发明涉及的子宫内膜异位症的判定方法中，进行选自受检者的血液样品中的抗突触融合蛋白自身抗体、抗PDIKlL自身抗体和抗烯醇化酶自身抗体中的至少1种的表达分析。子宫内膜异位症是子宫内膜样上皮细胞、间质细胞在卵巢、输卵管及腹腔内、直肠表面等子宫腔内表面以外的组织、内脏器官中随月经周期而重复增殖、出血、再生，从而对组织带来障碍的疾病，根据其严重程度分为I期 IV期的4个阶段。本发明中，子宫内膜异位症的严重程度越高，则可以以越高的灵敏度和精度判定子宫内膜异位症的有无。由于作为实用化的子宫内膜异位症标记物的CA125和CA19-9也为卵巢癌等的肿瘤标记物，因此假阳性率高。与此相对地，对于本发明涉及的子宫内膜异位症标记物，根据本发明人进行的实验去除异常值，健康者、其它疾病患者的假阳性率比以往标记物低。对本发明方法中使用的血液样品的种类不特别限定，其含有血液自身、血浆、血清中的任意一种。但是由于作为表达分析的对象的自身抗体包含在血清中，因此优选使用血浆或血清，更优选使用血清。作为得到血浆、血清的方法，可以适用常规方法，更具体地，可以使用离心分离、过滤。认为本发明方法不仅对于人、而且对于其它的恒温动物也是有效的，因此，作为血液样品，不仅可以使用来源于人的血液样品，还可以使用来源于其它恒温动物的血液样品。由于本发明方法使用血液样品，因此没有必要从患者切除例如子宫组织等作为样品，采取血液即可。由此，利用本发明方法时，进一步降低对患者造成的痛苦。突触融合蛋白为形成与细胞的胞吐关联的SNARE复合体的细胞膜结合性蛋白质的一种。PDIKlL为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其与同样地为激酶的CLIKl表现出69%的同一性。PDIKlL 的氨基酸序列记载于 LINGCHEN GUO 等人，Journal of Genetics, vol. 82, nos. 1 & 2，pp. 27-32Q003)(该文献在本说明书中引入作为参考)中。烯醇化酶为与糖酵解系统关联的酶之一，作为其同工酶，有主要存在于细胞质中的α型、主要存在于肌肉细胞中的β型、主要存在于神经元中的Y型。在本发明中，进行受检者血液样品中上述蛋白质的自身抗体的表达分析。在子宫内膜异位症患者的血液样品中，上述蛋白质的自身抗体的表达量增加的原因尚未阐明，但是通过这些自身抗体的表达分析，可以比以往的标记物更准确地判定子宫内膜异位症的有无。在本发明涉及的判定方法中，除了选自抗突触融合蛋白自身抗体、抗PDIKlL自身抗体和抗烯醇化酶自身抗体中的至少1种的表达分析之外，优选还进行CA125或CA19-9的表达分析。通过与抗突触融合蛋白自身抗体等一起进行CA125或CA19-9的表达分析，可以灵敏度更高地检出子宫内膜异位症。作为表达分析对象的抗突触融合蛋白自身抗体优选抗突触融合蛋白5自身抗体， 抗烯醇化酶自身抗体优选抗α-烯醇化酶自身抗体。在本发明涉及的判定方法中，对于针对突触融合蛋白等的自身抗体和CA125等的表达分析法不作特别限定。例如，不限于测定血液样品中这些自身抗体的绝对量或浓度，也可以测定相对的量或浓度。更具体地说，例如可以测定上述自身抗体等在血液样品中的量、 浓度或活性。作为具体的表达分析方法，可以举出例如ELISA、使用蛋白质芯片的方法、免疫比浊法、蛋白质印迹法、RIA法、化学发光酶免疫测定法(CLEIA法)、胶乳凝聚法、电化学发光免疫测定法(ECLIA法)、红细胞凝集反应(HA法)等免疫测定法。在这些方法中，作为用于进行上述表达分析的方法，优选免疫测定法。免疫测定法的灵敏度和精度高，即使血中的自身抗体浓度稍微变化也可以检出。通过ELISA进行本发明涉及的自身抗体的表达分析时，可以合适地使用本发明涉及的子宫内膜异位症的诊断用试剂盒。本发明的诊断用试剂盒含有选自突触融合蛋白、PDIK1L、烯醇化酶、它们的片段肽、它们的变性物、它们的修饰物中的至少一种肽，以及可以和与上述肽特异性地结合的自身抗体结合且具有标记基团的二次抗体。作为上述诊断用试剂盒，其适当地进一步含有抗CA125抗体或抗CA19-9抗体、以及可以和与上述抗CA125抗体或抗CA19-9抗体特异性结合的CA125或CA19-9结合且具有
5标记基团的二次抗体。若使用这种试剂盒，则除了进行抗突触融合蛋白自身抗体等的表达分析之外，还可以进行CA125或CA19-9的表达分析，通过将这些分析结果组合，可以进一步准确地判定子宫内膜异位症。突触融合蛋白等的片段肽指的是可以与上述自身抗体特异性地结合的突触融合蛋白等的一部分。作为这些片段肽，可以举出例如，突触融合蛋白等的自身抗体的表位本身、含有表位的肽等。本发明涉及的与自身抗体结合的表位可以通过ELI斑点测定、细胞内细胞因子染色法、流式细胞术、T细胞增殖测定等公知方法来确定。突触融合蛋白等的变性物指的是通过实施加热、冷冻、紫外线等物理性处理或应用表面活性剂、变性剂等化学性处理而得到的、可以与上述自身抗体特异性地结合的变性物。例如，可以举出通过SDS、DTT处理而得到的变性物。突触融合蛋白等的修饰物指的是对1个以上氨基酸进行修饰而得到的、可以与上述自身抗体特异性地结合的修饰物。例如，可以举出用戊二醛处理而得到的修饰物。在本发明中，作为上述肽，可以使用为突触融合蛋白等的片段肽且经变性处理的肽、为变性物且为化学修饰物的突触融合蛋白等。上述肽可以具有1个或几个氨基酸残基的突变、置换、缺失和/或添加，只要可以与上述自身抗体特异性地结合。在本发明涉及的诊断用试剂盒中，可将上述肽、抗CA125抗体等固定在载体上。通过使用载体，产生易于将这些肽等从样品分离等优点。适于将上述肽等固定的载体为诊断用试剂盒中一般使用的载体即可，对其不作特别限定。例如，作为载体的材料，可以举出聚苯乙烯、聚酰胺、聚丙烯酰胺等树脂，硅胶、玻璃、棉等，作为载体的形状，可以举出珠、膜、 丝、无纺布、无定形凝胶等。在使用上述诊断用试剂盒时，使受检者的血液样品作用于上述肽等。结果，若血液样品中含有针对本发明涉及的肽等的自身抗体、CA125等，则其与肽等特异性地结合。接着， 用缓冲液等将与肽等非特异性地结合的蛋白质等洗涤除去后，使上述二次抗体进行作用。 二次抗体和与上述肽等结合的上述自身抗体等结合。上述二次抗体用对应于标记基团的方法检出。作为上述标记基团，可以使用生物化学领域中一般使用的标记基团。例如，可以举出荧光显色基团，过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶等酶。这些酶可以通过与检出试剂作用而发光等。例如，在使用过氧化物酶作为标记基团时，可以通过利用过氧化物酶的氧化而显色的显色试剂、对应于通过过氧化物酶的作用由过氧化物盐产生的O22 —而显色的显色试剂等来检出。血液样品中含有的自身抗体的浓度或量是通过显色强度等间接得到的。可以通过校准曲线等将得到的测定值换算为相对或绝对浓度、量、活性等。作为本发明的诊断用试剂盒，其优选含有正常对照样品、子宫内膜异位症对照样品。若试剂盒附带这些样品，则对这些样品进行同样的实验，将其测定值和受检样品的结果进行比较，由此可以更客观地判定受检者的子宫内膜异位症的有无。在使用蛋白质芯片的方法中，使用负载有上述肽等的蛋白质芯片。若使血液样品作用于上述蛋白质芯片，则本发明涉及的自身抗体与其特异性地结合。接着，用缓冲液等将非特异性地结合的蛋白质等洗涤除去后，可以通过常规方法检出所结合的自身抗体。
作为上述检出方法，可以举出例如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-T0F-MASS)、表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-T0F-MASS)等飞行时间质谱(T0F-MASS)。由TOF-MASS图，通过分子量峰、其它的片段峰、它们的强度等，可以掌握自身抗体的浓度或量。此外，与ELISA的情况同样地，也可以使用具有标记基团且可以与各自身抗体结合的二次抗体来检出与蛋白质芯片选择性地结合的自身抗体。在利用免疫比浊法时，使特异性抗原与血液样品中的本发明涉及的自身抗体结合后，照射特定的光，测定与所产生的不溶性复合体的量对应的浊度，由此求出自身抗体的浓度或量。由此，自身抗体的浓度或量作为对应于浊度的相对值得到，也可以通过使用事先制作的校准曲线求出绝对的量或浓度。在化学发光酶免疫测定法(CLEDUi)的情况下，可以将血液样品中的各自身抗体夹在固定于铁氧体粒子等上的上述肽等和标记抗体之间，形成抗原抗体反应复合体。然后， 添加发光底物等对应于标记基团的检出用化合物等，由此可测定发光量。在使用铁氧体粒子时，通过使用磁铁等，可以纯化必要的复合体。在本发明方法中，接着由所得到的表达分析结果判定子宫内膜异位症发病的有无。即，若子宫内膜异位症发病、或其症状越重，则血液中的本发明涉及的自身抗体的浓度或量越高。由此，基于本发明涉及的自身抗体的表达分析结果，若其表达量多则可以判断为阳性，若其表达量少则可以判断为阴性。实际上，根据子宫内膜异位症的定义、严重程度、本发明涉及的自身抗体的表达分析方法，可以改变阳性与阴性的边界，即截断值(cutoff value) 0因此，在没有一般基准的阶段，本发明方法的实施者有必要在通过预实验等事先确定表达分析方法和截断值后进行测定。进一步地，在本发明方法中，在进行抗突触融合蛋白自身抗体等的表达分析的同时，进行作为以往的标记物的CA125或CA19-9的表达分析，在抗突触融合蛋白自身抗体等和CA125等中的任一个超过各自的截断值时判断为子宫内膜异位症阳性，由此则可以以更高的灵敏度检出子宫内膜异位症。
实施例以下举出实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明决不受下述实施例所限定，本发明可以在适合上述、后述的宗旨的范围内适当地进行变更而实施是不言而喻的，这些变更都在本发明的技术范围内。实施例1:子宫内膜异位症标记物的搜索 (1)血清样品的采取
由51位20 50岁的子宫内膜异位症患者(平均年龄34. 7士7. 6 (平均值士标准偏差)岁)、18位22 34岁女性健康者(平均年龄26. 4士 3. 7)、18位17 48岁的患有子宫内膜异位症以外的疾病的患者(平均年龄32. 8士9. 采取血液。子宫内膜异位症以外的患者的疾病如表1所示。[表 1]
权利要求
1.子宫内膜异位症的判定方法，其特征在于包含进行选自血液样品中抗突触融合蛋白自身抗体、抗PDIKlL自身抗体和抗烯醇化酶自身抗体中至少1种的表达分析的步骤，以及通过所述表达分析结果判定子宫内膜异位症发病的有无的步骤。
2.如权利要求1所述的子宫内膜异位症的判定方法，其中，除了进行选自抗突触融合蛋白自身抗体、抗PDIKlL自身抗体和抗烯醇化酶自身抗体中至少1种的表达分析之外，还进行CA125或CA19-9的表达分析。
3.如权利要求1或2所述的判定方法，其中，所述表达分析通过免疫测定法进行。
4.子宫内膜异位症的诊断用试剂盒，其特征在于含有选自突触融合蛋白、PDIK1L、烯醇化酶、它们的片段肽、它们的变性物、它们的修饰物中的至少一种肽，以及可以和与所述肽特异性地结合的自身抗体结合且具有标记基团的二次抗体。
5.如权利要求4所述的子宫内膜异位症的诊断用试剂盒，其中，将所述肽固定在载体上。
6.如权利要求4或5所述的子宫内膜异位症的诊断用试剂盒，其进一步含有抗CA125 抗体或抗CA19-9抗体、以及可以和与所述抗CA125抗体或抗CA19-9抗体特异性地结合的 CA125或CA19-9结合且具有标记基团的二次抗体。
7.如权利要求6所述的子宫内膜异位症的诊断用试剂盒，其中，将所述抗CA125抗体或抗CA19-9抗体固定在载体上。
8.如权利要求4 7中任意一项所述的诊断用试剂盒，其进一步含有所述标记基团的检出试剂、正常对照样品或子宫内膜异位症对照样品中的任一种以上。
9.选自抗突触融合蛋白自身抗体、抗PDIKlL自身抗体和抗烯醇化酶自身抗体中的至少一种在判定子宫内膜异位症中的应用。
10.选自抗突触融合蛋白自身抗体、抗PDIKlL自身抗体和抗烯醇化酶自身抗体中的至少一种在制备子宫内膜异位症的诊断用试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明的目的在于，提供可以使用受检者的血液样品、并且与仅使用以往作为子宫内膜异位症标记物的CA125等的以往方法相比可以高灵敏度且高精度地判定子宫内膜异位症的判定方法，和用于实施该本发明方法的诊断用试剂盒。本发明涉及的子宫内膜异位症的判定方法的特征在于含有进行选自血液样品中抗突触融合蛋白自身抗体、抗PDIK1L自身抗体和抗烯醇化酶自身抗体中至少1种的表达分析的步骤，和通过上述表达分析结果判定子宫内膜异位症发病的有无的步骤。
文档编号G01N33/53GK102341704SQ201080010289
公开日2012年2月1日 申请日期2010年2月23日 优先权日2009年3月6日
发明者伊藤昌春, 锅田基生, 阿部康人 申请人:持田制药株式会社